Макрофаги головного мозга представляют собой многокомпонентную и разнообразную популяцию клеток. К ним относятся микроглия нервной ткани мозга, макрофаги оболочек, периваскулярных пространств и сосудистого сплетения, а также макрофаги моноцитарного происхождения, мигрирующие из сосудистого русла в нервную ткань при различных патологиях [1]. Такое популяционное разнообразие, региональная специфика, а также высокая пластичность микроглии и макрофагов определяет многогранность их морфологических и функциональных особенностей. За последнее десятилетие было проведено множество исследований, касающихся происхождения и морфофункциональной гетерогенности этих клеток иммунной системы. Так, было описано несколько подтипов микроглии и макрофагов, ассоциированных с барьерными структурами, как в условиях физиологической нормы, так и при нейровоспалении, ассоциированном с различными патологическими состояниями ЦНС [2–4].

В частности, микроглия играет роль в регуляции кровотока в церебральных сосудах и сохранении целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Показано, что при запуске воспалительного процесса микроглия фагоцитирует концевые отростки астроцитов, нарушая целостность ГЭБ [5], а селективное удаление микроглиоцитов вызывает микрососудистую дисфункцию [6]. Периваскулярные макрофаги способны презентировать экзогенные антигены посредством MHC класса II, а потому являются сайтами инфильтрации Т-клеток при аутоимунных заболеваниях, болезнях Альцгеймера и Паркинсона [7]. Эпиплексусные макрофаги сосудистого сплетения головного мозга или клетки Колмера ограничивают проникновение в спинномозговую жидкость молекул периферической крови, а также патогенов и лимфоцитов в условиях инвазии и повреждения тканей [8]. В ответ на повышение концентрации тех или иных веществ в крови или цереброспинальной жидкости периваскулярные и эпиплексусные макрофаги усиливают генерацию активных форм кислорода, что может усугублять течение заболеваний [9]. И напротив, некоторые данные демонстрируют, что периваскулярные макрофаги и макрофаги мозговых оболочек способствуют клиренсу β-амилоида при болезни Альцгеймера или церебральной амилоидной ангиопатии [10]. Совокупность полученных данных показывает, что вклад макрофагов в развитие нейровоспаления зависит от множества факторов, что открывает широкую перспективу для модуляции их активности, а, следовательно, использования этого подхода в терапевтических целях.

Однако четкое разграничение подтипов микроглии и макрофагов ЦНС затруднено вследствие ограниченной специфичности большинства маркерных белков, таких как CD11b, F4/80, CX3CR1, CD45 и Iba-1 [11]. Иммунофенотипические характеристики эпиплексусных макрофагов соответствуют характеристикам других мононуклеарных фагоцитов, которые содержат маркерные белки MHC II, CD11b, CD68 и Iba-1 [12]. В дополнение к этому, при культивировании клеток ex vivo микроглиоциты теряют свои характерные особенности: как морфологические признаки, так и генетические и эпигенетические маркеры, — и становятся почти неотличимы от макрофагов [13]. В соответствии с этим иммунофенотипирование микроглии и макрофагов ЦНС in vivo представляется возможным только в совокупности с морфологическим анализом.

Для изучения проявлений нейровоспаления в настоящее время используют несколько экспериментальных моделей, имитирующих патологические особенности тех или иных заболеваний [14]. Так, с нарушением регуляции воспаления тесно связана артериальная гипертензия, которая по праву считается серьезной проблемой для здоровья людей во всем мире [15], и может являться моделью патологии нейровоспаления. Для стандартизированной гипертензии используют крыс линии SHR (spontaneously hypertensive rats). Исследования показывают, что следствием нарушения мозгового кровотока при хроническом повышении артериального давления у крыс SHR являются воспалительные процессы, которые могут приводить к нейродегенерации [16]. Результаты исследования, посвященные характеристике иммунной системы головного мозга при артериальной гипертензии, показывают, что микроглия у крыс SHR имеет морфологические признаки активации [17–19]. Также получены предварительные данные, позволившие предсказать тип поляризации активированных клеток микроглии у крыс SHR [20].

Характерным проявлением артериальной гипертензии у крыс SHR является нарушение гематоэнцефалического и гематоликворного барьеров [16, 21], вследствие снижения эластичности церебральных сосудов, вызванного ремоделированием их клеточных слоев. Таким образом, реакция микроглии и макрофагов на системные и локальные провоспалительные стимулы оказывается наиболее выражена именно в областях гематоэнцефалического, гематоликворного, а также ликворэнцефалического барьеров. Тем не менее, морфофункциональное состояние клеток иммунной системы мозга в области барьеров при данной патологии остается на сегодняшний день малоохарактеризованным.

Цель настоящего исследования состояла в оценке функциональной активности и иммунофенотипа микроглии и макрофагов в субэпендимной области боковых и третьего желудочков, а также в сосудистом сплетении головного мозга крыс SHR.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для иммунофенотипирования микроглии и макрофагов у нормотензивных и гипертензивных животных использовали материал головного мозга крыс-самцов Вистар и SHR массой 250–300 г (возраст 3–4 месяца, n = 10), фиксированного в цинк-этанол-формальдегиде и залитого в парафин по стандартной методике. При формировании групп животных с артериальной гипертензией отбирали крыс SHR с систолическим давлением, в среднем соответствующим или превышающим 200 мм рт. ст. Измерение артериального давления у крыс линии SHR проводили перед взятием материала с использованием системы неинвазивного измерения давления «Систола» (Нейроботикс, Россия).

Выявление микроглии и макрофагов на срезах головного мозга проводили с помощью антител к кальций-связывающему белку Iba-1 (ab5076, Abcam, Великобритания и ET-1705-78, Huabio, Китай), лизосомному гликопротеину CD68 (GB113109, Servicebio, Китай) и маннозному рецептору CD206 (HA722892, Huabio, Китай).

В качестве вторичных реагентов использовали реагенты из набора UltraVision Quanto Detection System HRP (TL-060-QHL, Fisher Scientific, США), anti-Goat HRP-DAB Cell & Tissue Staining Kit (CTS008, R&D Systems, США), Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection Kit (ab236466, Abcam, Великобритания). Для визуализации продукта моноферментной реакции использовали хромоген 3'3-диаминобензидин из набора Stable DAB/Plus (Diagnostic BioSystems, США). Для иммунофлуоресценции срезы после инкубации во вторичных антителах обрабатывали конъюгатом стрептавидина с флуорохромом Cy2 (016-220-084, Jackson ImmunoResearch, США), а также раствором козьих антител против пероксидазы хрена, конъюгированных с флуорохромом Cy3 (123-165-021, Jackson ImmunoResearch, США).

Полученные препараты анализировали с использованием микроскопов Leica DM750 (Германия) и конфокального лазерного микроскопа LSM800, оснащенного системой Airyscan. Иммуноморфологический анализ микроглии и макрофагов проводили в барьерных областях, прилегающих к мозговым центрам: эпендиме боковых и третьего желудочков (в области стриатума и медиобазального гипоталамуса соответственно), мягкой мозговой оболочке, сосудистом сплетении боковых желудочков. Специалист, выполняющий морфологический и количественный анализ полученных препаратов, был «ослеплен» относительно информации о тестируемых объектах.

Для количественной оценки проводили подсчет клеток в трех полях зрения для каждого препарата на увеличении объектива ×10 и ×20, затем стандартизировали по длине шкалы в 1 мм² (число значений, использованных для подсчета среднего для каждого случая, равно 6). Долю клеток, содержащих два маркера (Iba-1 и CD68), вычисляли путем деления количества Iba-1⁺/CD68⁺клеток на количество Iba-1⁺-клеток и представляли в процентах. Для анализа изображений использовали программу ImageJ2 в расширении FIJI (https://imagej.net/software/fiji/). Для анализа колокализации исследуемых маркеров использовали плагины Coloc2 (https://imagej.net/plugins/coloc-2) и Colocalization Finder (http://rsb.info. nih.gov/ij/plugins/colocalization-finder.html). Определяли коэффициент корреляции Пирсона в различных отделах мозга у крыс Вистар и SHR: субэпендимной зоне боковых и третьего желудочков, в сосудистом сплетении. Статистическую обработку проводили в программе GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Соответствие данных нормальному распределению проверяли с помощью критерия для малых выборок Шапиро–Уилка. Распределение считали соответствующим нормальному при р > 0,05. Для сравнения данных применяли однофакторный и двухфакторный дисперсионный анализ (one-way, two-way ANOVA) с последующим сравнением групп с помощью post-hoc-критерия Тьюки, а также однофакторный дисперсионный анализ Краскела– Уоллиса с применением post-hoc-критерия Данна. Данные представляли в виде среднее ± стандартное отклонение. Различия считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты измерения артериального давления у крыс линии SHR, отобранных для проведения исследования, представлены в табл. 1.

В результате иммуногистохимической реакции на CD206 в срезах головного мозга крыс Вистар и SHR выявляются периваскулярные клетки (в нервной ткани головного мозга и сосудистом сплетении) и клетки мягкой оболочки (рис. 1). В нервной ткани головного мозга клеток, иммунопозитивных по CD206, отмечено не было. Среднее количество CD206⁺-клеток на 1 мм² было выше у крыс с генетически детерминированной артериальной гипертензией (t-test, р = 0,0007) и составляло 40,69 ± 4,87 клеток (против 28,73 ± 1,39 у крыс Вистар).

Использование двойной иммунофлуоресцентной реакции позволило выявить микроглию и макрофаги (Iba-1⁺), содержащие белок CD68 (рис. 2). Они располагаются во всех трех исследуемых барьерных областях (субэпендимная зона боковых и третьего желудочка, сосудистое сплетение) и имеют свои специфические морфологические особенности. Вблизи эпендимы боковых и третьего желудочка это типичные отростчатые субэпендимные микроглиоциты, обладающие корзинчатым и веретеновидным морфотипом. Распределение CD68⁺-гранул в цитоплазме этих клеток соответствует общим представлениям о локализации лизосом. Для клеток сосудистого сплетения характерен малоотростчатый амебоидный или веретеновидный морфотип, и их CD68⁺-гранулы также распределяются в месте локализации лизосом. Отдельно стоит упомянуть о клетках, не ассоциированных ни с эпендимой, ни с сосудистым сплетением, и распределенных свободно в просвете желудочков. Обычно такие клетки встречались на препаратах крыс линии SHR. Гранулы белка CD68 во внутрижелудочковых клетках занимали практически весь объем цитоплазмы, маскируя ядро (рис. 2а).

Разница в количественном распределении Iba-1⁺/CD68⁺ микроглиоцитов и макрофагов в различных барьерных областях головного мозга оказывается регионоспецифичной, что подтверждается дисперсионным анализом (F = 117,4, р < 0,0001). Так показано, что доля Iba-1⁺/CD68⁺-клеток наибольшая в области сосудистого сплетения. В субэпендимной зоне боковых и третьего желудочка содержание двойных иммунопозитивных клеток не такое высокое (табл. 2). Количественный анализ не выявил достоверных различий между группами нормотензивных и гипертензивных крыс (F = 2,19, р = 0,16). Тем не менее, данные выборки крыс SHR несколько смещены относительно выборки Вистар (рис. 2Г, Д) в сторону увеличения доли клеток, иммунопозитивных по двум маркерам.

В результате анализа колокализации (рис. 3) были получены средние значения критерия корреляции для каждой области в обеих группах (Вистар и SHR; табл. 3). Во всех случаях критерий корреляции принимает значения достаточные, чтобы колокализация маркеров считалась неслучайной (значения критерия отличаются от нуля). При этом видимых сдвигов значений при артериальной гипертензии не наблюдали (two-way ANOVA, F = 0,56, р = 0,48). Более того, значимых различий в степени корреляции белков Iba-1 и CD68 не было отмечено и при анализе различных исследуемых областей (two-way ANOVA, F = 3,45, р = 0,06).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Макрофаги играют особую роль в поддержании тканевого гомеостаза, нейтрализации патогенов и аберрантных клеток, а также в инициировании и модулировании адаптивного иммунитета благодаря своей фагоцитарной активности, способности к эффероцитозу и презентации антигенов. Многолетние исследования физиологических и цитохимических особенностей макрофагов различных органов при воспалительных процессах позволили выявить два основных функциональных состояния, обозначенные типами поляризации M1 и M2 [22]. В дальнейшем научное сообщество постепенно отошло от концепции жесткой дихотомии и пришло к выводу, что функциональные состояния макрофагов являют собой целый спектр фенотипов между провоспалительным M1 и репаративным M2 [23, 24]. В результате дальнейшего разделения на подтипы стало возможным с большей точностью охарактеризовать роль этих клеточных популяций в воспалении и выработать индивидуальные терапевтические стратегии для лечения различных заболеваний [25].

Предполагается, что микроглия головного мозга обладает схожими особенностями поляризации в ходе активации [26], что позволяет использовать уже имеющуюся парадигму для сравнительных исследований и экстраполяции результатов, полученных на разных органах. Однако микроглиоциты отличаются от других макрофагов как по гистогенезу, так и по ряду структурных характеристик [2, 27]. В этом случае необходимо применять дифференцированный подход к оценке микроглии и макрофагов с учетом их особенностей.

В ходе ранее выполненного исследования было показано, что микроглия крыс с генетически детерминированной артериальной гипертензией может обладать повышенной фагоцитарной активностью [11]. В рамках настоящего исследования проведена проверка гипотезы о возможности M2а-поляризации микроглии головного мозга у крыс SHR.

Известно, что активированные M2a-макрофаги способны к эндоцитозу, стимулируют рост клеток и регенерацию тканей [25]. Наиболее типичными маркерными белками M2a-подтипа у лабораторных грызунов являются CD206, Fizz1, Ym1/2 и аргиназа 1 [28]. На основании характеристики предложенных маркеров [29], а также результатов скринингового иммуногистохимического исследования с использованием различных антител, для оценки функциональной активности клеток иммунной системы головного мозга был выбран маннозный рецептор CD206.

Полученные результаты иммуногистохимической реакции и последующего количественного анализа показывают заметное увеличение числа CD206+-клеток у крыс SHR, что может свидетельствовать о сдвиге к M2a-типу поляризации. Это позволяет определить дальнейшие направления работы в отношении иммунофенотипирования микроглии и макрофагов ЦНС крыс SHR, например, с помощью мультиплексной иммуногистохимии с широкой панелью антител против белков, специфичных для M2a-фенотипа.

Выявление роли макрофагов при артериальной гипертензии обращает на себя пристальное внимание исследователей. Отмечается, что у крыс SHR повышено содержание CD11b+-клеток кишечника, ингибирующих выделение провоспалительных цитокинов. Однако содержание провоспалительных цитокинов также повышено у крыс SHR по сравнению с контрольной группой [30]. И напротив, отмечается, что в брюшной полости к четвертому месяцу преобладают M1-макрофаги, но уже к шестому разница между количеством M1- и M2-поляризованных клеток снижается [31]. Авторы предполагают, что макрофаги разных органов будут также приобретать различные иммунофенотипы, т. е. в одном органе могут преобладать M1-фенотип, а в другом — M2.

Это может быть связано с тем, что резидентные макрофаги привлекают прибывающие в ткани иммунные клетки из разных источников, которые, в свою очередь, попадают под влияние регионоспецифичного микроокружения. По-видимому, микроокружение нервной ткани при артериальной гипертензии усиливает необходимость, как минимум, к повышению экспрессии CD206, а как максимум — к M2a-поляризации макрофагов головного мозга.

Однако их локализация ограничивается периваскулярными пространствами, мягкой мозговой оболочкой и сосудистым сплетением. Непосредственно в нервной ткани мозга клеток, иммунопозитивных по CD206, не наблюдали ни в одном из изученных случаев.

Отсутствие маркера CD206 в отростчатой микроглии и обнаружение его только в типичных макрофагах может указывать на различия в профилях экспрессии маркеров активации у микроглиоцитов и макрофагов. Тем не менее, результаты отдельных исследований, по-видимому, входят в противоречие с данным предположением. В одном из недавних обзоров, посвященных функциональной гетерогенности глиальных клеток ЦНС, авторы допускают возможность существования популяции CD206⁺ -микроглии [13].

Результаты оригинального исследования с использованием метода проточной цитометрии показывают, что некоторые P2Y12+-клетки человека могут содержать низкие уровни белка CD206 [32]. В другой работе была зарегистрирована одновременная экспрессия CD32 и CD206 в микроглиоцитах при сочетанном воздействии электромагнитного поля и индуктора нейровоспаления TNFα [33]. Авторы интерпретируют появление такой комбинации маркеров в пользу осуществления восстановления ткани в ответ на повреждающее воздействие. У грызунов появление CD206+-микроглии было отмечено при повреждении спинного мозга [34], а также на ранних стадиях постнатального развития [35]. Учитывая то, что в отмеченных работах проводили исследования на клеточных культурах и с использованием проточной цитометрии, эти данные не вполне сопоставимы с результатами иммуногистохимического исследования.

Наличие CD206 в микроглии головного мозга крыс с использованием иммуногистохимического метода показано, например, в работе, посвященной исследованию влияния кверцетина на активацию клеток иммунной системы головного мозга [36]. Колокализация белков Iba-1 и CD206 четко наблюдается на препаратах головного мозга после воздействия кверцетина, который обладает противовоспалительным и антиоксидантным эффектом и, предположительно, способствует активации микроглии по типу М2. Однако при ишемическом/реперфузионном повреждении реакция на CD206 в микроглии достаточно слабая, и отсутствует у группы контроля. И напротив, при нейровоспалении, ассоциированном с болезнью Альцгеймера, у мышей [37] колокализации CD206 и Iba-1 не было обнаружено. В связи с этим авторы заключают, что CD206⁺-макрофаги и Iba-1⁺ микроглиальных клеток представляют собой различные популяции. В дополнение к этому, использование антител к маркерным белкам макрофагов (таких как CD206 и Iba-1) также не дает исчерпывающей информации о происхождении наблюдаемых на препаратах клеток. Поэтому полностью различить микроглию, микроглиоподобные клетки и инфильтрирующие головной мозг макрофаги представляется затруднительным. Таким образом, предположение о возможности или невозможности экспрессии маннозного рецептора CD206 микроглией у крыс при различных состояниях нервной системы нуждается в дальнейшей проверке.

Результаты количественного анализа, полученные в рамках настоящей работы, позволили оценить готовность к фагоцитозу клеток микроглии и макрофагов по наличию функциональных лизосом, которые определяются благодаря присутствию макросиалина (CD68) — трансмембранного гликопротеина лизосом и фагосом [38].

В ходе анализа колокализации белков Iba-1 и CD68 было высказано предположение, что описанная Iba-1⁺/ CD68⁺-микроглия у крыс SHR вблизи мозговых барьеров находится в состоянии активации. Для сравнения уровней колокализации белков Iba-1 и CD68 на основании удобства интерпретации значений был выбран коэффициент корреляции Пирсона. Его значения варьируют от –1 до 1, где «–1» свидетельствует о полной отрицательной, «1» — о полной положительной, а «0» — о случайной корреляции [39]. У крыс как Вистар, так и SHR колокализация белков во всех исследуемых областях являлась неслучайной (разброс средних значений составлял от 0,4 до 0,6). Однако проведенное количественное исследование указывает на отсутствие значимых различий в уровнях колокализации белков Iba-1 и CD68.

Другой методический подход состоял в количественной оценке доли клеток, иммунопозитивных по двум маркерам, относительно общей популяции Iba-1⁺-клеток в сосудистом сплетении, а также вблизи эпендимы боковых и третьего желудочков. Было отмечено, что наибольшей долей Iba-1⁺/CD68⁺-клеток характеризуется сосудистое сплетение головного мозга, где локализована особая популяция макрофагов — клеток Колмера [40]. Природа этих клеток остается предметом дискуссий, однако их функция связана с активным фагоцитозом. Наименьшей долей двойных иммунопозитивных клеток обладает субэпендимная зона третьего желудочка в области гипоталамуса, что, вероятно, обусловлено наличием в эпендиме особых глиальных клеток — таницитов, которые формируют двунаправленный транспорт биологически активных молекул между ЦСЖ и кровью [41]. Не имеющая подобной выстилки субэпендимная зона боковых желудочков занимает промежуточное положение.

Несмотря на то что дисперсионный анализ не выявил значимых различий между долей клеток, иммунопозитивных по Iba-1 и CD68, у крыс разных линий, анализ описательных статистик показывает, что данные выборки крыс SHR смещены относительно выборки Вистар в сторону увеличения доли таких клеток. В частности, медиана, а также минимум и максимум могут принимать более высокие значения (рис. 2). Полученные данные указывают на неоднородность исследуемой группы SHR, несмотря на выполненную селекцию по уровню артериального давления.

В дальнейших исследованиях следует использовать выборки большего объема.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у крыс на фоне артериальной гипертензии может наблюдаться активация фагоцитарной активности микроглии и макрофагов в областях гематоэнцефалического, гематоликворного и ликворэнцефалического барьеров. При этом, принимая во внимание результаты анализа колокализации, необходимо подчеркнуть, что, вероятно, меняется число, но не степень функциональной активности клеток.

ВЫВОДЫ

Нейровоспаление, вызванное артериальной гипертензией у крыс SHR, приводит к смещению поляризации в сторону M2a-варианта у макрофагов мягкой мозговой оболочки, сосудистого сплетения и периваскулярных пространств. Определение популяционной принадлежности CD206⁺-клеток головного мозга остается не до конца выясненным и должно быть уточнено в ходе дальнейших научных исследований с применением двойного иммуногистохимического маркирования. Активация микроглии и макрофагов у крыс SHR, по-видимому, не сопровождается усилением фагоцитарной активности этих клеток. Выявленная тенденция к увеличению доли Iba-1⁺/CD68⁺-клеток в головном мозге у крыс SHR по сравнению с крысами Вистар может оказаться как следствием внутрипопуляционных различий, так и возможным признаком роста процента активных фагоцитов. Для проверки этих гипотез необходимы дальнейшие исследования.