Под термином «гипоксическая ишемическая энцефалопатия» понимают острое повреждение структур головного мозга, вызванное перенесенной асфиксией в родах. Статистика заболеваемости в мире варьирует от 1 до 3 случаев на 1000 живорождений в развитых странах, при этом в государствах с ограниченными ресурсами цифры могут быть в 10 раз выше [1, 2]. В Российской Федерации этот показатель составляет 13,3 на 1000 новорожденных детей [3].

Патогенез гипоксической ишемической энцефалопатии инициируется снижением церебральной перфузии, ведущим к гипоксии, ишемии и энергодефициту, а тяжесть неврологических исходов коррелирует с гестационным возрастом и локализацией повреждения [4]. Окислительный стресс, нейровоспаление, эксайтотоксичность, апоптоз и некроз клеток представляют собой ключевые звенья сложных патофизиологических каскадов, индуцированных в головном мозге. Тем не менее точные патофизиологические механизмы развития гипоксической ишемической энцефалопатии изучены недостаточно [5, 6].

На сегодняшний день единственным доказанным методом нейропротекции при гипоксической ишемической энцефалопатии является терапевтическая гипотермия [7–10]. Однако ее эффективность остается ограниченной, так как она лишь частично снижает риск смертности и инвалидизации [11–13]. Это стимулирует активный поиск новых терапевтических стратегий, способных потенцировать эффекты гипотермии или обладающих самостоятельным нейропротекторным действием.

Одним из перспективных направлений является использование благородных газов, которые, согласно экспериментальным данным, обладают фармакологической активностью [14–16]. Особый интерес представляет ксенон, его нейропротективные свойства продемонстрированы в различных моделях повреждения головного мозга [17]. Однако результаты клинических исследований, таких как международное исследование TOBY-Xe, не выявили значимого улучшения исходов при добавлении ксенона к гипотермии у доношенных новорожденных [18, 19]. Это не свидетельствует об отсутствии потенциала ксенона, а скорее указывает на необходимость более глубокого доклинического изучения механизмов его действия, режимов дозирования и отсроченных эффектов. В частности, требует уточнения способность ксенона влиять на функциональное созревание мозга в постишемическом периоде, что может быть оценено в экспериментальных моделях с помощью длительного нейроповеденческого тестирования и методов нейровизуализации.

Цель исследования — изучить нейропротекторные свойства ксенон-кислородной смеси на модели неонатальной ишемии-гипоксии у крыс с оценкой объема повреждения головного мозга и некоторых показателей неврологического статуса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 

Экспериментальная работа выполнена на крысятах линии Wistar обоих полов массой 25–30 г (n = 16). Распределение животных на группы осуществляли методом простой рандомизации при помощи генератора случайных чисел. Из исследования исключали животных, у которых на исходном этапе по результатам стандартного осмотра и оценки поведения выявлялись признаки заболевания, а также особи, погибшие вследствие осложнений анестезии или хирургического вмешательства. Критериями для гуманного выведения из эксперимента служили следующие данные: инфицирование послеоперационной раны, отсутствие стартл-рефлекса, снижение массы тела более чем на 20% за сутки, проявления аутоагрессии, невозможность самостоятельного приема пищи и воды спустя 24 ч после индукции ишемии-гипоксии.

Дизайн исследования предусматривал формирование двух экспериментальных серий. Контрольная группа (группа К, n = 8) — через 30 мин после моделирования ишемии-гипоксии животные были подвергнуты ингаляции азот-кислородной смеси (азот 50% / кислород 50%; ИнертГазМедикал, Россия) в течение 60 мин. Экспериментальная группа (группа Xe, n = 8) — через 30 мин после моделирования ишемии-гипоксии животные получали ксенон-кислородную смесь («КсенОнокс 50», ксенон 50% / кислород 50%; № регистрационного удостоверения ЛП-006493, ИнертГазМедикал, Россия) в течение 60 мин. Эвтаназию лабораторных животных выполняли после завершения экспериментальной работы методом передозировки анестетика.

Неонатальную ишемию-гипоксию воспроизводили по модели Райса–Вануччи [20]. Анестезию осуществляли изофлураном (индукция 3%, поддержание 1,5–2% в 100% O₂) на термостолике (36 °C). Контроль глубины наркоза проводили по отсутствию корнеального и межпальцевого рефлексов. После микрохирургического выделения левой общей сонной артерии и ее лигирования убеждались в отсутствии дистальной пульсации, рану ушивали. Крысят помещали в термостат (36 °C, 60 мин), затем в мультигазовый инкубатор с гипоксической смесью (8% O₂ / 92% N₂) на 90 мин с мониторингом температуры и визуальным контролем.

Через 30 мин после завершения индукции гипоксии, в течение которых животные имели доступ к матери, крысят помещали в камеру на 60 мин для ингаляции контрольной или экспериментальной газовой смесью. Подачу (N₂/O₂ 50/50 или «КсенОкс 50») осуществляли непрерывно со скоростью 0,5–1 л/мин. Внутри камеры поддерживали температуру 36 °C и относительную влажность 40–60%. Одновременно в камере находилось не более пяти крысят; на дно помещали слой древесного подстила для абсорбции биологических жидкостей. Контур оснащали влагопоглотителем (силикагель) и адсорбером CO₂ (натронная известь), рециркуляцию обеспечивали вентилятором. По окончании экспозиции оценивали уровень бодрствования и двигательную активность животных.

Неврологический статус

Оценку неврологического развития новорожденных крысят проводили с использованием 8 поведенческих тестов, начиная с третьего постнатального дня, следуя ранее описанным протоколам [21–23].

Хватательный рефлекс передних конечностей начинали оценивать с третьего дня жизни: тупой стержень при легком надавливании прикладывали к ладонной поверхности передней лапы, что в норме вызывало сгибание пальцев и захват. Рефлекс считали окончательно сформированным при стабильном схватывании обеими передними лапами в течение двух последовательных дней. Оценку проводили по трехбалльной шкале, где 0 баллов соответствовали отсутствию рефлекса, 1 балл — захвату одной передней конечностью (с указанием стороны), а 2 балла — захвату обеими передними конечностями. Аналогичным образом, начиная с третьего дня, оценивали хватательный рефлекс задних конечностей, используя ту же методику и шкалу: 0 баллов — отсутствие захвата, 1 балл — захват одной задней конечностью, 2 балла — захват обеими задними конечностями.

Рефлекс переворачивания также тестировали с третьего дня: крысенка фиксировали в положении на спине с выпрямленными конечностями, после чего отпускали, фиксируя время до полного переворота. Максимально допустимое время для завершения реакции составляло 15 с. Отсутствие переворота в течение этого времени оценивали в 0 баллов, переворот на бок (с указанием стороны) или принятие неправильной позы — в 1 балл, а полный переворот с принятием физиологически правильного положения (опора на все четыре лапы) — в 2 балла.

С четвертого дня жизни начинали оценку рефлекса постановки задних конечностей: крысенка удерживали вертикально за туловище и тыльной стороной задней лапы прикасались к краю твердой поверхности. В норме животное отдергивало лапу и ставило ее на поверхность. Отсутствие реакции оценивали в 0 баллов, постановку одной конечности (с указанием стороны) — в 1 балл, а постановку обеих конечностей — в 2 балла.

Реакцию избегания края, также оцениваемую с четвертого дня, проверяли, помещая крысенка передними лапами и мордой за край горизонтальной поверхности; под краем размещали мягкую подложку для предотвращения травмы при падении. Рефлекторное избегание проявлялось в отворачивании от края. Отсутствие движений или падение оценивали в 0 баллов, попытку уйти от края со свисающими конечностями — в 1 балл, а полное отступление от края — в 2 балла.

Начиная с десятого дня, оценивали слуховую стартл-реакцию: громкий звуковой сигнал подавали непосредственно над животным. Наличие резкого движения или вздрагивания расценивали как положительную реакцию и оценивали в 1 балл, отсутствие реакции — в 0 баллов.

С двенадцатого дня жизни оценивали характер позы при движении на нескользящей поверхности. Незрелую позу (волочение брюшка, перпендикулярное положение конечностей относительно тела) оценивали в 1 балл, зрелую (приподнятое брюшко, параллельное положение конечностей) — в 2 балла; отсутствие движения соответствовало 0 баллов. В этом же возрасте, с двенадцатого дня, регистрировали открытие глаз: сомкнутые веки соответствовали 0 баллов, открытие одного глаза (с указанием стороны) — 1 баллу, открытие обоих глаз — 2 баллам.

Оценку сенсомоторной функции конечностей проводили с использованием теста «Постановка конечности на опору». После трех дней адаптации к рукам животные выполняли семь проб, направленных на оценку сенсомоторной интеграции конечностей. Пробы включали поочередное смещение передних и задних лап с края стола в разных позициях (с визуальным контролем, латерально, при подталкивании туловища к краю, а также при опускании за хвост к поверхности). Выполнение каждой пробы оценивали по трехбалльной шкале: 2 балла — нормальное выполнение, 1 балл — замедленное или неполное, 0 баллов — отсутствие реакции.

Магнитно-резонансная томография

На 7-е сутки после моделирования ишемии-гипоксии выполняли МРТ-исследование животных in vivo на томографе с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м (BioSpec 70/30; Bruker, Германия). Анестезию осуществляли изофлураном в концентрации 1,5–2%, после чего животное помещали в систему фиксации со стереотаксическим устройством и терморегуляцией. Использовали стандартный протокол исследования головного мозга, включающий получение Т2-взвешенных изображений. Для передачи радиочастотного сигнала применяли линейный трансмиттер с внутренним диаметром 72 мм, для детекции сигнала — поверхностную приемную катушку для мозга крысы. RARE — последовательность на основе спинового эха с параметрами: TR = 6000 мс, TE = 63,9 мс, толщина среза — 0,8 мм с шагом 0,8 мм, размер матрицы — 256 × 384, разрешение — 0,164 × 0,164 мм/пиксел. Общее время сканирования одного животного составляло около 30 мин.

Степень повреждения головного мозга оценивали путем планиметрического анализа МР-изображений с последующим вычислением объема поврежденной ткани. На серии МРТ-изображений с помощью программы

ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, США) рассчитывали площадь повреждения (в мм²) для каждого среза. Для этого выделяли площади интактной ткани здорового (S₁) и поврежденного (S₂) полушарий и вычисляли площадь повреждения на срезе по формуле: ΣS = S₁–S₂, где ΣS — площадь повреждения на одном срезе (мм²) [24]. Объем повреждения головного мозга рассчитывали по формуле: V = ΣS_n × d, где d — толщина среза (0,8 мм), ΣS_n — сумма площадей повреждения на всех срезах (мм²).

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием SPSS Statistics 28.0.1 и GraphPad Prism 10.4.2. Нормальность распределения оценивали с помощью критерия Шапиро– Уилка. Поскольку показатели имели порядковую шкалу и распределение, отличное от нормального, данные представлены в виде медианы и интерквартильного интервала — Me (Q₁; Q₃). Сравнение групп выполняли с использованием U-теста Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при двустороннем уровне p < 0,05. Для минимизации систематической ошибки исследователь, проводивший МРТ и оценивавший неврологический статус животных в поведенческих тестах, работал в условиях ослепления и не был осведомлен о распределении крысят по группам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По данным МРТ-исследования, проведенного на 7-е сутки, в группе животных, получавших ксенон-кислородную смесь, наблюдалось статистически значимое уменьшение объема повреждения головного мозга. Этот показатель был на 25% ниже, чем в контрольной группе (p = 0,001; рисунок).

Анализ неврологического статуса позволил выявить статистически значимое ускорение формирования рефлексов у крысят группы Xe. На 3-и сутки медиана оценки хватательного рефлекса передних конечностей в данной группе была статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой (p = 0,025; таблица), что свидетельствует о выраженном нейропротекторном эффекте ксенон-кислородной смеси в отношении моторных функций. Аналогичная, еще более выраженная динамика наблюдалась для рефлекса задних конечностей (p = 0,005). В тесте на исправляющий рефлекс статистически значимых различий между исследуемыми группами не выявлено (p = 0,190).

На 7-е сутки животные группы Xe статистически значимо лучше выполняли тест постановки задних конечностей (p = 0,045), а также демонстрировали более выраженную реакцию избегания обрыва по сравнению с контролем (p = 0,030).

К 14-м суткам у крысят, получавших ксенон-кислородную смесь, регистрировалась статистически значимо более сохранная реакция испуга на звук (p = 0,035). Сроки открытия глаз статистически значимо не различались между группами (p = 0,100).

На 28-е сутки при оценке сенсомоторной интеграции по тесту «Постановка конечности на опору» статистически значимых различий не выявлено (p = 0,080).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные в ходе исследования данные демонстрируют, что ингаляция ксенон-кислородной смеси (50% Xe / 50% O₂) в раннем восстановительном периоде после ишемиигипоксии оказывает выраженное нейропротекторное действие у крысят на модели Райса–Вануччи. Ключевым результатом работы стало статистически значимое уменьшение объема повреждения головного мозга на 25% в группе Xe по данным МРТ на 7-е сутки. Этот результат согласуется с выводами недавнего крупного систематического обзора и метаанализа, где было показано, что ксенон снижает неврологический дефицит в среднем на 39,7% в доклинических моделях гипоксической ишемической энцефалопатии у мышей, крыс и свиней [25]. Наше исследование подтверждает, что даже однократное 60-минутное применение ксенона способно статистически значимо ограничить формирование инфаркта мозга, что визуализируется на Т2-взвешенных изображениях.

Положительная динамика, зафиксированная в поведенческих тестах, подтверждает морфологические данные и имеет четкую временную логику. Улучшение хватательных рефлексов и теста постановки конечностей на 3–7 сутки указывает на то, что ксенон способствует сохранению сенсомоторных проводящих путей и корковых центров, отвечающих за эти рефлексы. Это критически важно, так как именно двигательные нарушения лежат в основе таких тяжелых исходов гипоксической ишемической энцефалопатии, как детский церебральный паралич. Сохранная реакция испуга на звук на 14-е сутки свидетельствует о лучшем функциональном состоянии слуховых анализаторов и ствола мозга, что перекликается с данными упомянутого выше обзора, где авторы отмечают способность ксенона снижать апоптоз и модулировать нейровоспаление [25]. Отсутствие статистически значимых различий в тесте «Постановка конечности на опору» на 28-е сутки, вероятно, связано с ограниченным объемом выборки и высокой вариабельностью, обусловленной компенсаторными возможностями незрелого мозга.

Полученные нами результаты хорошо вписываются в современные представления о механизмах действия ксенона. Нейропротекция ксенона опосредована не только антагонизмом к NMDA-рецепторам, но и плейотропными эффектами: активацией двухпоровых калиевых каналов, модуляцией AMPA-рецепторов и, что особенно важно для неонатального мозга, антиапоптотическим действием [26]. Показано, что ксенон уменьшает гибель нейронов и подавляет хроническое нейровоспаление [27, 28]. Улучшение неврологических исходов в нашем эксперименте, вероятно, является следствием именно такого комплексного воздействия: ограничения первичного повреждения и создания более благоприятных условий для постнатального созревания мозга.

Наши доклинические данные приобретают особую значимость в свете результатов клинических исследований, таких как TOBY-Xe. В том исследовании добавление ксенона к гипотермии у новорожденных не привело к улучшению исходов, что авторы связывают в том числе с поздним началом терапии. В нашей работе ксенон вводился строго через 30 мин после гипоксии, что подчеркивает критическую важность терапевтического окна. По другим данным, максимальная эффективность ксенона также достигается при начале терапии в первые часы после инсульта [25].

Таким образом, применение ксенон-кислородной смеси после моделирования неонатальной ишемии-гипоксии обеспечило нейропротекторный эффект у новорожденных крыс, что позволяет считать цель исследования достигнутой. При интерпретации полученных результатов необходимо учитывать ряд ограничений. Эксперименты проводили на животных в отсутствие терапевтической гипотермии — обязательного компонента современной клинической практики. Кроме того, период наблюдения, составивший 28 суток, не эквивалентен полному жизненному циклу, что оставляет открытым вопрос о долгосрочной эффективности препарата.

ВЫВОДЫ

Применение ксенон-кислородной смеси (ксенон 50% / кислород 50%) в раннем периоде неонатальной ишемиигипоксии обеспечивает выраженный нейропротекторный эффект у новорожденных крыс линии Wistar, что подтверждается статистически значимым уменьшением объема повреждения головного мозга на 25% по данным МРТ на 7-е сутки. Ксенон-кислородная смесь способствует ускорению постнатального функционального созревания центральной нервной системы: в группе Xe зарегистрированы более раннее формирование хватательных рефлексов, улучшение сенсомоторных реакций и сохранность слуховой стартл-реакции. Полученные данные подтверждают решающую роль раннего начала терапии в пределах терапевтического окна и обосновывают необходимость дальнейшего изучения оптимальных режимов дозирования ксенона, а также его потенциального синергизма с терапевтической гипотермией для оптимизации лечения гипоксической ишемической энцефалопатии у новорожденных.