В последние десятилетия биорезорбируемые импланты рассматривают как перспективную альтернативу традиционным металлическим фиксаторам в травматологии и ортопедии [1–3]. Ключевой характеристикой таких имплантов является способность к контролируемой деградации in vivo. Это позволяет исключить необходимость повторного хирургического вмешательства для удаления фиксирующей конструкции, которое сопряжено с дополнительной травматизацией тканей, риском инфекционных осложнений и увеличением стоимости лечения [3, 4]. Данное клиническое преимущество обусловило интенсивное изучение как полимерных, так и металлических материалов с заданными параметрами биодеградации.

Идеальный биорезорбируемый имплант должен обладать механическими характеристиками, сопоставимыми с костной тканью человека, включая близкий модуль упругости, достаточную прочность и пластичность. Скорость деградации материала должна соответствовать темпам восстановления механической прочности костной ткани в зоне перелома [3]. Существенными требованиями также являются высокая биосовместимость, отсутствие токсических и канцерогенных эффектов, а также предсказуемый характер продуктов деградации [1, 3].

Полимерные импланты, преимущественно на основе PLA (Polylactic acid) и PGA (Polyglycolic acid), уже применяют в клинической практике, однако их использование ограничено относительно низкой механической прочностью [4]. Кроме того, резорбция полимеров сопровождается образованием кислых продуктов гидролиза, что может приводить к локальному асептическому воспалению [5]. В отличие от них, металлические биорезорбируемые импланты характеризуются значительно более высокими прочностными показателями, предсказуемым механизмом электрохимической коррозии и отсутствием выраженного локального ацидоза в зоне имплантации [6, 7]. Эти свойства определяют их потенциальную применимость для остеосинтеза переломов крупных опорных костей в условиях повышенной механической нагрузки.

Среди металлов, рассматриваемых для разработки биорезорбируемых имплантов, наибольшее внимание уделяется магнию (Mg), железу (Fe) и цинку (Zn) [8, 9].

Магниевые сплавы демонстрируют высокую биосовместимость и модуль упругости, близкий к костной ткани, однако их ключевым недостатком является чрезмерно высокая скорость коррозии в физиологических условиях, сопровождающаяся выделением водорода и преждевременной потерей механической прочности [10, 11]. Fe, напротив, несмотря на удовлетворительные механические свойства, характеризуется крайне медленной деградацией in vivo, что ограничивает его клиническую применимость [9, 12]. В этом контексте Zn рассматривают как материал с оптимальным балансом между скоростью резорбции и механической стабильностью, что делает его перспективной основой для создания имплантов с контролируемой кинетикой деградации [13].

Помимо благоприятных коррозионных свойств, Zn является эссенциальным микроэлементом, участвующим в регуляции остеогенеза, активности щелочной фосфатазы и экспрессии факторов роста. Исследования in vivo продемонстрировали, что импланты на основе Zn подвергаются равномерной коррозии со скоростью порядка 0,17–0,22 мм/год, что соответствует срокам костной репарации [14]. Однако чистый Zn обладает относительно невысокой механической прочностью (предел при растяжении около 100–150 МПа), что ограничивает его использование в условиях значительной нагрузки [13].

Один из наиболее эффективных путей повышения прочности Zn — легирование различными металлами. Бинарные Zn–Mg‑сплавы привлекают внимание как потенциальные материалы для биорезорбируемых имплантов благодаря сочетанию механической стабильности и умеренной скорости биодеградации [13, 15]. Добавление Mg способствует формированию интерметаллических фаз (Mg₂Zn₁₁, MgZn₂), которые обеспечивают упрочнение структуры сплава. Предел прочности при растяжении Zn–Mg‑сплавов может достигать 260–498 МПа в зависимости от содержания Mg и способа обработки [16, 17]. При этом скорость коррозии умеренно увеличивается по сравнению с чистым Zn, оставаясь в пределах, совместимых с физиологическими процессами регенерации кости [16]. Некоторые авторы сообщают, что добавление Mg увеличивает биосовместимость сплавов в сравнении с чистым цинком [18]. Данные по цитотоксичности бинарных сплавов Zn–Mg противоречивы и зависят от величины доли Mg в сплаве [15, 19]. Избыточное количество Mg в составе сплава может, напротив, ухудшать механические свойства и чрезмерно ускорять процессы коррозии [19].

Таким образом, несмотря на значительное количество исследований, посвященных Zn–Mg сплавам, данные о влиянии низких концентраций Mg (0,5–2 мас.%) на цитотоксичность, скорость деградации и тканевый ответ остаются частично противоречивыми, а комплексные исследования, объединяющие in vitro и in vivo анализ для данного диапазона концентраций, немногочисленны, что ограничивает возможность оптимизации состава сплавов для клинического применения.

Цель настоящего исследования — комплексная оценка биосовместимости сплавов Zn–Mg с содержанием Mg (0,5–2 мас.%), включающая анализ цитотоксичности на клеточных культурах SCP in vitro и изучение биологического ответа на имплантацию материала in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для достижения поставленной цели исследование выполняли в два последовательных этапа. На первом этапе проводили скрининговую оценку цитотоксичности in vitro с использованием порошков исследуемых сплавов. Порошковая форма выбрана для стандартизированного MTT‑теста в прямом контакте. Он позволяет определить пороговые концентрации, вызывающие гибель клеток, в условиях максимальной площади поверхности материала (стресс‑тест). На втором этапе оценивали биосовместимость in vivo на компактных цилиндрических имплантах, форма которых соответствует потенциальному клиническому применению в качестве фиксаторов для остеосинтеза. Прямое количественное сопоставление абсолютных значений жизнеспособности клеток in vitro и скорости деградации имплантов in vivo не проводили ввиду различий в морфологии образцов.

Исследуемые материалы

В качестве исходных материалов использовали Zn Ц0 (ГОСТ 3640‑79) и Mg Мг90 (ГОСТ 804‑72). Выплавку образцов осуществляли по двум экспериментальным режимам. Запаянная в кварцевую ампулу навеска заданного состава нагревалась до 440 ℃ (эта температура на 20 °C выше температуры плавления Zn), выдерживали в течение 10 ч и резко закаливали в воде.

В дальнейшем все исследования проводили с использованием сплавов в литом состоянии. Материалы характеризовались крупнозернистой микроструктурой, преимущественно состоящей из зерен твердого раствора на основе Zn. В сплавах с содержанием Mg более 1,5% по межкристаллитным границам также была обнаружена в виде тонких прослоек вырожденная эвтектика ((Zn) + Mg₂Zn), объемная доля которой не превышала 5%. Увеличение содержания Mg в составе приводило к уменьшению среднего размера зерен с 400 до 195, 160, 120 мкм.

Порошок необходимого гранулометрического состава получали диспергированием в планетарной шаровой мельнице PM 100 (Retsch GmbH, Германия). Первоначально с целью получения металлической стружки отлитые слитки обрабатывали на фрезерном станке. В дальнейшем помол стружки проводили при помощи агатовых мелющих шаров в агатовой ступке объемом 200 мл при вращении 300 об./мин в течение 5 ч в среде гептана для предотвращения слипания частиц. Использование агатовых шаров было обусловлено необходимостью предотвратить загрязнение готового порошка железом, частицы которого могут обнаруживаться на поверхности порошка после помола стандартными стальными мелющими шарами.

Отношение массы загружаемой стружки сплава к массе мелющих шаров составило 1/2. Масса мелющих шаров составляла 60 г, соответственно каждый раз получали порции порошка по 30 г. После обработки для устранения грубых частиц полученный в шаровой мельнице порошок просеивали через сито с размером ячейки 100 мкм. Просеянный порошок тщательно промывали в ультразвуковой ванне с этиловым спиртом, после чего полученную суспензию пропускали через фильтровальную бумагу. Оставшийся на бумаге готовый порошок подвергался сушке в течение 24 ч в вентилируемом вытяжном шкафу.

Аттестацию гранулометрического состава готового порошка проводили с помощью оптического микроскопа Neophot 32 (Carl Zeiss, Германия) и сканирующего электронного микроскопа TESCAN MIRA 2 (TESCAN, Brno, Чехия), оборудованного системой энергодисперсионного рентгеновского спектрального анализа (Oxford Instruments, Великобритания). В результате проведенного анализа было установлено, что для гранул порошка характерна неправильная форма в виде чешуек, средний размер которых в случае Zn–0,5Mg составлял 50 мкм, Zn–1Mg — 65 мкм, Zn–1,5Mg — 96 мкм, Zn–2Mg — 89 мкм. Доля частиц с минимальным диаметром менее 20 мкм во всех образцах не превышала 5%.

Для проведения исследований in vivo из исходных слитков с помощью электроэрозионного станка были вырезаны заготовки в виде цилиндров диаметром 1,5 мм и высотой 8 мм. В дальнейшем для устранения окислов и получения требуемого качества поверхность образцов обрабатывали механической шлифовкой на наждачной бумаге зернистостью 240, 400 и 800. 

Цитотоксичность in vitro

Клеточная линия и условия культивирования

Для оценки цитотоксичности использовали иммортализованные костномозговые стволовые клетки человека линии SCP‑1, обладающие стабильной адгезией на металлических поверхностях. Клетки культивировали во флаконах Т‑25 (Sarstedt, Германия) с адгезивным покрытием в среде с содержанием LoSera basal medium (HiMedia, Индия) 88%, FBS (HiMedia, Индия) 10%, L‑глутамина (ServiceBio, China) 0,01%, раствора пенициллина, стрептомицина и амфотерицина В (CDH, Индия)  0,01%, в CO₂‑инкубаторе (Panasonic (Sanyo) MCO‑15A, Япония) c концентрацией CO₂ 5%, при температуре 37 °C.

При достижении 90–100% конфлюэнтности выполняли пассирование: удаляли использованную среду, промывали клетки сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS, ServiceBio, Китай) без ионов Ca²⁺и Mg²⁺ дважды, затем добавляли 0,25%‑й раствор трипсина с ЭДТА (2,5 мл) (ServiceBio, Китай). Экспозиция трипсина составила 10 с, затем флакон помещали в CO₂‑инкубатор на 1 мин 30 с. После этого клетки ресуспендировали в 10 мл свежей среды. С помощью светового инвертированного микроскопа (Nexcope NIB620FL, Китай) контролировали отделение клеток от подлежащей поверхности. Клеточную суспензию отбирали в пробирку и центрифугировали со скоростью 1600 об./мин 3 мин. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок ресуспендировали в 15 мл среды и переносили по 5 мл в три новых флакона (трехкратное разбавление).

Клеточную суспензию вносили в 96‑луночный планшет (Sarstedt, Германия) в концентрации 525 000 кл./мл и культивировали 24 ч перед добавлением исследуемого материала.

Подготовка суспензии металлических порошков

Цитотоксичность оценивали методом прямого контакта. Использовали порошки сплавов Zn–Mg с содержанием Mg 0,5 и 1 мас.% (группы А и B соответственно). Для порошков с концентрацией Mg 1,5 и 2 мас.% исследование цитотоксичности in vitro не проводили, поскольку слишком крупный размер частиц не позволял произвести дозирование металлического порошка.

Порошки стерилизовали автоклавированием при 121 °C 60 мин и охлаждали до комнатной температуры в стерильных условиях. В пробирках объемом 1,5 мл типа эппендорф готовили взвесь на основе культуральной среды, указанной выше, со стоковой концентрацией исследуемых порошков 10 мг/мл, которую, после тщательного встряхивания на микроцентрифуге‑вортексе двухкратными разведениями разбавляли до рабочих концентраций 2,5, 1,25, 0,62, 0,31 и 0,15 мг/мл.

Из лунок с клеточной культурой удаляли культуральную среду и добавляли в 72 лунки приготовленные взвеси исследуемых материалов, в соответствии с приведенной схемой (рис. 1). Объем суспензии, вносимой в каждую лунку, составлял 100 мкл.

Суспензии порошков в концентрациях 2,5–0,15 мг/мл вносили в лунки с клеточной культурой. Верхние три ряда (по 6 лунок планшета) каждой группы содержали опытные образцы и интактный контроль. Четвертый ряд — контроль адсорбции порошка с клетками (без MTT), пятый — контроль адсорбции порошка с MTT (без клеток), шестой — контроль адсорбции с DMSO (без клеток). Введение дополнительных контролей позволило исключить ложноположительные реакции, связанные с неспецифическим связыванием частиц порошка с компонентами MTT‑теста, что проявлялось в ранних экспериментах. Время экспозиции — 24 ч.

Полученные образцы анализировали методом MTTтеста. Для этого сухой реагент МТТ (3‑(4,5‑Dimethylthiazol2‑yl)‑2,5‑Diphenyltetrazolium Bromide; ServiceBio, Китай) растворяли в концентрации 5 мг/мл в 1× растворе PBS (Phosphate Buffered Saline, фосфатно‑солевой буфер, ServiceBio, Китай). Затем 1 мл стокового раствора МТТ (5 мг/мл) смешивали с 9 мл культуральной среды (рабочая концентрация МТТ — 0,5 мг/мл). После 24 ч экспозиции с исследуемыми металлическими порошками из всех лунок аккуратно удаляли среду с помощью вакуумного аспиратора и добавляли в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора МТТ (0,5 мг/мл). Инкубировали 2,5 ч в СО₂инкубаторе. С помощью вакуумного аспиратора удаляли раствор и добавляли по 100 мкл DMSO (ServiceBio, Китай). Инкубировали 15 мин на радиальном шейкере (100 об./мин).

Исследовали в микропланшетном ридере (Alsheng AMR‑100, Китай) оптическую плотность каждого образца на длине волны 540 нм (референтная длина волны — 750 нм). Жизнеспособность вычисляли по формуле %Vi = (100 × ODe)/ODb, где ODe — значение оптической плотности исследуемых образцов, ODb — среднее значение оптической плотности отрицательных контролей. За отрицательный контроль принимали интактные клетки, культивируемые в тех же условиях, но без добавления металлического порошка. Дополнительные контроли (контроль адсорбции порошка с клетками без MTT, контроль адсорбции порошка с MTT без клеток, контроль адсорбции с DMSO без клеток) использовали для выявления неспецифичного связывания компонентов MTT‑теста с частицами порошка. Если в каком‑либо из дополнительных контролей регистрировали оптическую плотность, превышающую 5% от значений отрицательного контроля, соответствующую концентрацию порошка исключали из анализа как дающую ложноположительный результат. Во всех представленных в работе случаях значения дополнительных контролей не превышали указанного порога. Все измерения выполняли в трех технических повторностях [20].

Исследование in vivo

Экспериментальное исследование проводили на базе вивария ФГБОУ ВО УГМУ Минздрава России с использованием четырех половозрелых самцов кроликов породы Советская шиншилла. В исследование включали клинически здоровых животных в возрасте 6–9 месяцев, массой тела 2,0–3,5 кг, прошедших карантинизацию и ветеринарный осмотр с подтверждением нормальных клинико‑лабораторных показателей. Содержание животных осуществляли в соответствии с требованиями ГОСТ 33216‑2014 и рекомендациями FELASA.

Размер выборки (n = 4) обусловлен пилотным характером исследования и был минимально достаточным для оценки локальных и системных реакций на имплант у конкретного организма. С целью увеличения количества экспериментальных точек импланты устанавливали билатерально (в правую и левую нижние конечности одного и того же кролика).

В качестве исследуемых образцов использовали Zn– Mg‑импланты с процентным содержанием Mg 0,5, 1, 1,5 и 2 мас.%, цилиндрической формы, диаметром 1,5 мм и высотой 8 мм. Перед применением импланты стерилизовали в сухожаровом шкафу при температуре 180 ° в течение 60 мин.

Оперативное вмешательство

Операции выполняли под общей анестезией, индуцированной внутримышечным введением препарата Zoletil 100 (производитель Virbac Sante Animale) в дозе 10 мг/кг. Во время вмешательства осуществляли мониторинг частоты дыхания и сердцебиения. Животное фиксировали на операционном столе в положении на боку (со стороны вмешательства). С нижних конечностей животных предварительно удаляли шерстяной покров с помощью электротриммера, затем последовательно обрабатывали область вмешательства 70%‑м этанолом и раствором повидон‑йода (ЗАО «Эгис Фармацевтический завод», Россия).

По медиальной поверхности в проекции проксимального метафиза большеберцовой кости выполняли продольный кожный разрез длиной 3–4 см. После послойного рассечения мягких тканей визуализировали проксимальный метафиз. На медиальной поверхности метафиза на расстоянии 6–8 мм от суставной щели гравером со стерильным цилиндрическим бором диаметром 1 мм формировали кортикально‑губчатый дефект диаметром 1,5 мм, глубиной до противоположного кортикального слоя. Сверление осуществляли под постоянным охлаждением стерильным физиологическим раствором для предотвращения термического повреждения костной ткани. Имплант погружали в сформированный дефект до упора в противоположный кортикальный слой кости. Во всех случаях была достигнута плотная механическая фиксация импланта (рис. 2).

После установки импланта рану ушивали послойно отдельными узловыми швами, фасцию — нитью Vicryl 4‑0 («Медин‑Н», Россия), кожу — Prolene 3‑0 («Медин‑Н», Россия). Линию шва обрабатывали раствором окситетрациклина. Иммобилизацию оперированной конечности не выполняли. Аналогичное вмешательство проводили с контралатеральной стороны в рамках единой процедуры.

После операции животных обезболивали кетопрофеном (производитель VIC) (1 мг/кг внутримышечно, 1 раз в сутки в течение 3–4 дней). Эффективность обезболивания контролировали с использованием шкалы Rabbit Grimace Scale. Для профилактики инфекционных осложнений применяли энрофлоксацин (KRKA, Словения) в дозе 5 мг/кг внутримышечно в течение 3 дней. В течение всего периода наблюдения ежедневно контролировали общее состояние животных, поведение, аппетит и состояние послеоперационной раны.

Гематологический анализ

На седьмые сутки после операции осуществляли забор крови из краевой ушной вены для проведения общего анализа крови (ОАК). Кровь исследовали с использованием автоматического гематологического анализатора Mythic 5Vet PRO (Orphée S.A., Швейцария). Определяли содержание эритроцитов (RBC), уровень гемоглобина (HGB), количество лейкоцитов (WBC), а также оценивали лейкоцитарную формулу (GRA%, MID%, LYM%). Интерпретацию результатов проводили с учетом референтных значений для данного вида животных.

Компьютерная томография

Компьютерную томографию (КТ) выполняли через 3 и 10 месяцев после имплантации с использованием 64‑срезового томографа Philips Tomoscan AV (Philips Healthcare, Нидерланды), толщина среза — 0,6 мм.

Полученные изображения анализировали с использованием программного обеспечения RadiAnt DICOM Viewer (Medixant, Польша). В ходе анализа оценивали наличие газовых или жидкостных скоплений в периимплантной зоне, признаки воспалительных изменений мягких тканей, а также участки костной деструкции.

Плотность костной ткани оценивали в единицах Хаунсфилда (Hounsfield Units, Венгрия). Для количественного анализа измеряли: плотность кортикальной кости (Cortical Bone Density, CBD) вентрально и дорсально относительно импланта, а также плотность трабекулярной кости (Trabecular Bone Density, TBD) в периимплантной зоне.

Статистическая обработка данных

Для обработки количественных данных использовали программный пакет Microsoft Office Excel 2020 (Microsoft, США). Количественные показатели описывали с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD). Предварительный расчет объема выборки не делали. Сравнение групп с применением статистических критериев не проводили ввиду малого объема выборки. Построение графиков выполняли в среде R, версия 4.5.2 (R Foundation for Statistical Computing, Австрия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование цитотоксичности

Анализ цитотоксичности металлических порошков биорезорбируемых сплавов Zn–Mg в отношении костномозговых стволовых клеток человека линии SCP‑1 выявил дозозависимое снижение жизнеспособности клеток (рис. 3).

При максимальной исследованной концентрации 2,5 мг/мл оба типа сплавов продемонстрировали выраженную цитотоксичность. Жизнеспособность клеток составила 12,51 ± 1,03% для сплава с содержанием магния 0,5% и 16,78 ± 1,63% для сплава с содержанием магния 1%. При снижении концентрации до 1,25 мг/мл сплав с 0,5% магния сохранял умеренную цитотоксичность (жизнеспособность 51,25 ± 4,4 %), тогда как сплав с 1% магния не проявлял токсического действия (101,42 ± 3,28%).

Концентрации 0,62 мг/мл и ниже для сплава с 1% магния характеризовались жизнеспособностью клеток на уровне контроля или выше: 108,97 ± 8,52% при 0,62 мг/мл, 108,14 ± 11,69% при 0,31 мг/мл и 105,18 ± 3,29% при 0,12 мг/мл. Для сплава с 0,5% магния восстановление жизнеспособности до приемлемых значений (> 80%) наблюдалось начиная с концентрации 0,62 мг/мл (89,77 ± 9,06%), с дальнейшим увеличением до 96,79 ± 4,43% и 100,16 ± 4,37% при концентрациях 0,31 и 0,12 мг/мл соответственно.

Исследование in vivo

В течение всего послеоперационного периода общее состояние животных оставалось удовлетворительным. Все кролики сохраняли нормальную двигательную активность, аппетит и физиологическую температуру тела. Клинических признаков воспаления или инфицирования раны, а также нарушений функции нижних конечностей не было выявлено.

Гематологические показатели

На 7‑е сутки после операции были определены основные гематологические показатели — количество эритроцитов (RBC), концентрация гемоглобина (HGB), общий уровень лейкоцитов (WBC) и лейкоцитарная формула (табл. 1)

WBC находились в пределах референсного диапазона (5,0–12,0 × 10⁹/л). Относительные и абсолютные значения лимфоцитов (LYM) и нейтрофилов (NEU) соответствовали физиологической норме, относительное содержание моноцитов (MON) незначительно превышало верхнюю границу референсов и составляло 10,35–13,22%. Показатели EOS и BASO также находились в пределах референсных значений. Показатель RBC варьировал от 6,18 до 7,09 × 10¹²/л, а HGB — от 141 до 157 г/л, что не значительно превышает верхнюю границу референсного диапазона.

Компьютерная томография

КТ, выполненная через 3 месяца после имплантации, показала сохранение положения всех имплантов без признаков миграции, что свидетельствует о стабильной механической фиксации и интеграции в костную ткань (рис. 4).

Анализ плотности костной ткани по данным КТ с использованием RadiAnt DICOM Viewer показал высокую однородность показателей кортикального (CBD) и трабекулярного (TBD) компонентов у всех животных (табл. 2).

Исследованию подверглись восемь опытных образов, всего четыре типа импланта с разным процентным содержанием магния от 0,5 до 2% с шагом 0,5%. Средние значения кортикальной плотности варьировались от 642,5 до 655 HU (Hounsfield Units, единицы Хаунсфилда) в зависимости от концентрации Mg в импланте, а трабекулярная плотность — от 505 до 517 HU. Групповое среднее значение для всех образцов составило 647,25 ± 5,42 HU для CBD и 510,5 ± 6,40 HU для TBD. Нормальное значение плотности здоровой кости у кроликов составляет в среднем 655 HU в случае кортикальной плотности кости, 510 HU — в случае трабекулярной плотности.

По данным КТ спустя 10 месяцев после операции имплант определяется в месте первоначальной установки. При анализе содержания газа в периимплантной зоне отмечается незначительное его выделение, без распространения в костномозговой канал большеберцовой кости лабораторного животного.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Впервые о перспективах применения бинарного сплава Zn–Mg в качестве биоразлагаемого материала в медицине появилось сообщение в 2011 г. [22]. Авторы выяснили, что скорость деградации сплавов Zn–Mg in vitro составляла порядка десятков микрон в год, что может быть достаточным для восстановления механической прочности костной ткани в области повреждения. В дальнейшем было установлено, что легирование цинка магнием приводит к формированию интерметаллических фаз (прежде всего Mg₂Zn₁₁ и MgZn₂), обеспечивающих существенное повышение прочностных характеристик за счет дисперсионного упрочнения, при этом сохраняющих модуль упругости, близкий к костной ткани [16]. Кроме того, импланты, изготовленные из бинарных сплавов Zn, демонстрируют лучшую остеоинтеграцию, чем чистый Zn, что может быть связано со стимулирующим действием ионов Mg на остеогенез [15].

Полученные в нашем исследовании результаты свидетельствуют о дозозависимом характере цитотоксичности исследуемых Zn–Mg сплавов и подтверждают их удовлетворительный профиль биосовместимости при концентрациях 1,25 мг/мл для 1 мас.% и 0,62 мг/мл для 0,5 мас.%. Наиболее существенное снижение жизнеспособности клеток (до 12,5–16,8%) наблюдалось при максимальной концентрации порошков (2,5 мг/мл), тогда как при разбавлении среды она восстанавливается до значений, сопоставимых или превышающих контроль (до 109,0%). Данный профиль ответа указывает на влияние локальной концентрации высвобождаемых ионов металлов как основного фактора, определяющего клеточную выживаемость [8, 16].

Было продемонстрировано, что при концентрации 0,31 мг/мл для сплава Zn–5Mg жизнеспособность эндотелиальных клеток превышала 100%, тогда как для чистого Zn при тех же условиях составляла около 85% [15]. В другом исследовании зафиксировано снижение жизнеспособности клеток до 50% при концентрации 0,75 мг/мл сплава Zn–3Mg, однако при более низких концентрациях выживаемость клеток постепенно увеличивалась [23]. Аналогично, сообщалось о > 70% жизнеспособности клеток линий HOS и MG‑63 70% при воздействии разбавленных экстрактов сплава Zn–1,2Mg [24].

Необходимо учитывать, что в большинстве представленных работ цитотоксичность оценивали методом экстрактов, что может приводить к снижению пиковых концентраций ионов и, соответственно, к более высоким показателям жизнеспособности клеток [15]. Используемая в настоящей работе модель прямого контакта потенциально более приближена к условиям локального взаимодействия материала с клетками, а применение расширенной системы контролей позволило повысить достоверность оценки цитотоксичности и частично исключить влияние неспецифической адсорбции порошков на результаты MTT‑теста, что ранее отмечалось как одна из проблем in vitro оценки металлических биоматериалов [25].

Несмотря на отсутствие в настоящем исследовании прямых электрохимических измерений и количественной оценки кинетики высвобождения ионов, обсуждение возможных механизмов наблюдаемой цитотоксичности представляется необходимым. Согласно данным литературы, ионы Zn²⁺ в концентрациях, сопоставимых с использованными в нашей работе при максимальных концентрациях порошка (2,5 мг/мл и, для сплава Zn‒0,5Mg, при 1,25 мг/мл), индуцируют апоптоз в клетках костного происхождения преимущественно через митохондриальный путь. Показано, что воздействие Zn²⁺ в диапазоне 80–160 мкМ приводит к повышению соотношения Bax/Bcl‑2, высвобождению цитохрома C из митохондрий, активации каспаз‑3 и ‑9 и, как следствие, к гибели клеток. Дополнительным механизмом является индукция оксидативного стресса: ионы Zn²⁺ способствуют генерации активных форм кислорода, что вызывает повреждение мембранных липидов и ДНК [19]. В нашем исследовании снижение жизнеспособности клеток до 12–17% при 2,5 мг/мл для обоих сплавов хорошо согласуется с этими литературными данными. Интересно, что при 1,25 мг/мл сплав Zn‒1Mg не проявлял токсичность (жизнеспособность — 101,4%), тогда как Zn‒0,5Mg сохранял цитотоксический эффект (51,3%). Это различие может быть объяснено не только разной скоростью высвобождения ионов Zn²⁺ из‑за различной доли интерметаллических фаз Mg₂Zn₁₁ (как обсуждалось выше), но и возможным прямым протективным действием ионов Mg²⁺ [19].

В нашем исследовании сплав с содержанием Mg 1 мас.% продемонстрировал более благоприятный профиль биосовместимости по сравнению со сплавом, содержащим 0,5% магния. Критическое различие наблюдалось в диапазоне концентраций 1,25–2,5 мг/мл, в котором сплав с большим содержанием магния показал существенно меньшую цитотоксичность. При концентрациях 0,62 мг/мл и ниже оба сплава демонстрировали сопоставимые показатели жизнеспособности клеток, превышающие 80%‑й порог. Этот эффект может быть объяснен увеличением доли интерметаллических фаз (прежде всего Mg₂Zn₁₁) в сплаве Zn‒1Mg, что приводит к снижению биодоступности ионов Zn²⁺ и ограничивает их локальные концентрационные пики в клеточной среде [16, 26]. Кроме того, повышение жизнеспособности клеток может также быть обусловлено биопротективным действием ионов Mg²⁺, а также их влиянием на процессы клеточного метаболизма и регуляции апоптоза [8].

При концентрациях 0,62 мг/мл для Zn–1Mg и 0,12 мг/мл для Zn–0,5Mg сплавы демонстрировали жизнеспособность клеток выше 100% (до 108,97 ± 8,52%), что указывает на возможный стимулирующий эффект субтоксических концентраций высвобождаемых ионов металлов. Аналогичный стимулирующий эффект ионов Zn²⁺ был продемонстрирован в исследованиях in vitro на мезенхимных стволовых клетках [19].

Результаты гематологического анализа in vivo через 7 суток после имплантации не выявили признаков системной воспалительной реакции. Показатели WBC (5,30–9,79 × 10⁹/л) находились в пределах физиологической нормы, что свидетельствует об отсутствии выраженного иммунного ответа и согласуется с данными других авторов, которые также не выявили повышения воспалительных маркеров у животных после имплантации Zn–Mg–Fe сплавов [27]. Стабильность показателей RBC и HGB подтверждает отсутствие клинически значимой кровопотери и гемолитического эффекта, а незначительное превышение верхней границы референтного диапазона может объясняться индивидуальными особенностями гидратационного статуса животных. По результатам другой работы, показатель гемолиза для Zn–1,2Mg сплавов составлял менее 2%, что ниже предельного значения 5%, установленного стандартом ISO 109934 [24, 28]. В совокупности эти данные подтверждают, что Zn–Mg‑сплавы не вызывают выраженного системного воспалительного и токсического ответа in vivo.

Данные КТ через 3 месяца продемонстрировали сохранение положения имплантов и отсутствие признаков миграции, что косвенно подтверждает достаточную остаточную механическую прочность в ранний период после имплантации. Показатели плотности костной ткани (CBD 642,5–655 HU; TBD 505–517 HU) были сопоставимы с интактной костью, что свидетельствует об отсутствии остеолитических изменений. Это согласуется с данными литературы, в частности, с сообщением о статистически значимом увеличении площади новообразованной кости в группе Zn–0,8Mg в сравненни с чистым Zn, а также о повышении костно‑имплантационного контакта, что указывает на улучшенную остеокондуктивность материала [24].

Спустя 10 месяцев после имплантации в нашем исследовании имплант по‑прежнему определяется в месте первоначальной установки, что согласуется с сообщениями других авторов о стабильном положении импланта на протяжении 120–360 дней после операции, а также об отсутствии признаков инкапсулирования импланта и периимплантной костной деструкции по данным микро‑КТ [29]. Факт выделения минимального количества свободного газа в периимплантной области свидетельствует о реакции магния в составе сплава, что является признаком начала процесса резорбции материала в биологической среде организма лабораторного животного.

Ограничения

При интерпретации результатов настоящего исследования необходимо учитывать ряд ограничений, связанных с дизайном эксперимента, методами оценки и различиями между этапами in vitro и in vivo.

Первое и наиболее важное ограничение касается различия морфологии и физического состояния образцов, использованных на разных этапах работы. Оценку цитотоксичности in vitro выполняли на порошках сплавов Zn‒0,5Mg и Zn‒1Mg со средним размером частиц от 50 до 65 мкм, тогда как in vivo имплантировали компактные полированные цилиндрические образцы диаметром 1,5 мм и высотой 8 мм из сплавов с содержанием магния 0,5, 1, 1,5 и 2 мас.%. Порошковая форма обеспечивает значительно большую удельную площадь поверхности по сравнению с компактным имплантом, что приводит к более быстрому и массивному высвобождению ионов Zn²⁺ и Mg²⁺ в культуральную среду. По сути модель прямого контакта с порошком представляет собой «стресс‑тест», выявляющий пороговые концентрации, тогда как компактный имплант в условиях in vivo деградирует с существенно меньшей скоростью. В связи с этим прямое количественное сопоставление абсолютных значений жизнеспособности клеток (в процентах) in vitro с какими‑либо параметрами тканевого ответа или скорости резорбции in vivo не проводилось и было бы методологически некорректным. Данные in vitro использовали исключительно для качественного сравнения двух составов между собой и для демонстрации дозозависимого характера цитотоксичности.

Второе ограничение связано с отсутствием в работе прямых измерений концентрации ионов металлов в биологических средах. Мы не определяли содержание Zn²⁺ и Mg²⁺ ни в культуральной среде после инкубации с порошками, ни в крови экспериментальных животных, ни в тканевой жидкости периимплантной зоны. Это не позволяет установить прямую причинно‑следственную связь между конкретной концентрацией ионов и наблюдаемым биологическим эффектом, а также разделить вклад прямого цитотоксического действия ионов, осмотических нарушений и возможного изменения pH среды, особенно в условиях прямого контакта с порошком. Кроме того, без данных о кинетике высвобождения ионов невозможно количественно объяснить, почему при концентрации порошка 1,25 мг/мл сплав Zn‒1Mg не проявлял токсичности, тогда как Zn‒0,5Mg сохранял цитотоксический эффект.

Еще одно важное ограничение связано с отсутствием в работе прямых измерений коррозионной стойкости и количественной оценки скорости деградации. Мы не проводили электрохимических испытаний (потенциодинамическая поляризация, электрохимическая импедансная спектроскопия) в стандартизированных средах, не определяли потерю массы имплантов после эксплантации, не измеряли глубину коррозионного поражения и не анализировали состав продуктов коррозии на поверхности. Без этих данных невозможно количественно связать наблюдаемые биологические эффекты (цитотоксичность in vitro, отсутствие остеолиза in vivo) с фактической скоростью выделения ионов. Кроме того, отсутствие измерений pH в культуральной среде в процессе MTT‑теста не позволяет исключить вклад защелачивания (характерного для магнийсодержащих сплавов) в гибель клеток. Таким образом, мы не можем окончательно установить механизм цитотоксичности — является он прямым следствием действия ионов Zn²⁺, результатом изменения pH или комбинацией факторов. В настоящей работе мы ограничиваемся описанием феноменологии (дозозависимое снижение выживаемости) и обсуждением возможных механизмов на основе литературных данных. Будущие исследования должны включать полный набор коррозионных и механистических тестов.

Также необходимо отметить, что системные гематологические показатели in vivo не позволяют в полной мере оценить локальные воспалительные изменения и клеточную реакцию в области имплантации. Отсутствие данных гистологического анализа периимплантных тканей существенно ограничивает возможность детальной оценки выраженности местного воспалительного ответа, характера клеточной инфильтрации, а также процессов ремоделирования и новообразования костной ткани на микроуровне. Кроме того, в рамках данного исследования не проводили оценку скорости деградации имплантов, что не позволяет количественно связать наблюдаемые биологические эффекты с динамикой разрушения материала.

ВЫВОДЫ

Проведена двухэтапная оценка биосовместимости бинарных сплавов Zn–Mg с содержанием магния 0,5–2 мас.%, включающая скрининговое исследование цитотоксичности на порошках in vitro (0,5–1 мас.%) и изучение тканевого ответа на компактные импланты in vivo (0,5–2 мас.%). Установлен дозозависимый характер цитотоксичности in vitro, при этом повышение содержания Mg ассоциируется с более благоприятным профилем клеточной выживаемости в области повышенных концентраций. В условиях in vivo не выявлено признаков системной воспалительной реакции; гематологические показатели оставались в пределах физиологической нормы, а данные КТ свидетельствуют о сохранении стабильной фиксации имплантов и отсутствии выраженных признаков костной резорбции в течение периода наблюдения. В совокупности полученные результаты подтверждают перспективность дальнейшего изучения Zn–Mg сплавов как класса биорезорбируемых материалов.