Вирус гриппа вызывает сезонные заболевания и относится к семейству Orthomyxoviridae, подразделяющемуся на четыре рода (A, B, C и D). Вирус гриппа рода А вызывает наиболее тяжелое течение инфекции и является причиной 290–650 тыс. смертей в год в основном среди детей, беременных женщин и пожилых людей [1]. Высокая изменчивость вируса, обусловленная различными механизмами, включая антигенный дрейф (мутации в генах, кодирующих вирусные белки) и шифт (реассортация сегментов генома), требует ежегодного обновления антигенного состава вакцин [2–4]. Таким образом, эта специфика вируса гриппа обусловливает необходимость обновления состава вакцинных препаратов к постоянно изменяющимся антигенным детерминантам.

Вакцинопрофилактика остается наиболее эффективным инструментом контроля вирусных инфекций, позволяющим снизить заболеваемость и тяжесть клинических проявлений [5]. В настоящее время в России применяют такие вакцины для профилактики гриппа, как «Ультрикс Квадри», «Совигрипп», «Флю-М», «Гриппол плюс», «Гриппол» и «Квадривалент», которые относятся к инактивированным вакцинам [6]. Инактивированные вакцины, несмотря на высокий профиль безопасности, имеют ряд ограничений. Среди них слабая перекрестная активность индуцируемого иммунного ответа, необходимость ежегодной смены штаммового состава, в том числе из-за снижения иммунного ответа в течение года, сниженная эффективность среди определенных групп риска, а также длительные сроки производства, затрудняющие быструю адаптацию к циркулирующим вариантам вируса [1]. Более того, на этапе получения инактивированных вакцин вирусные антигены могут претерпевать изменения, что может приводить к сниженной эпидемиологической эффективности вакцинальной кампании [7, 8]. Для поддержания долгосрочной защиты обычно необходимы ревакцинации [1]. Показано, что из-за длительного процесса разработки вакцин, а также изменения антигенных детерминант вируса гриппа эффективность инактивированных вакцин варьируется в пределах 10–60% [9].

В отличие от инактивированных препаратов, РНКвакцины кодируют нативную структуру антигена, обладают собственными адъювантными свойствами и позволяют быстро менять последовательность в ответ на изменчивость вируса [10, 11]. В качестве основы для РНК-вакцины могут быть использованы классические мРНК-молекулы и самоамплифицирующиеся РНК (саРНК), которые, помимо последовательности целевого антигена, содержат также последовательности неструктурных генов альфавирусов, обеспечивающих репликацию РНК в клетке [11, 12]. Препараты на основе саРНК обеспечивают более пролонгированный биосинтез целевого белка, что в контексте вакцинных препаратов может обеспечить более высокую иммуногенность или позволить снизить дозу препарата. Однако использование препаратов на основе саРНК остается ограниченным из-за потенциальных побочных эффектов, связанных с повышенным уровнем реактогенности. Цель данной работы — проведение сравнительного анализа иммуногенности экспериментальных препаратов на основе классической мРНК и самоамплифицирующейся саРНК, кодирующих гемагглютинин вируса гриппа A(H1N1)pdm09 на мышах линии BALB/c. Для валидации экспериментальной системы и корректной интерпретации данных в качестве положительного контроля была использована зарегистрированная инактивированная вакцина «Ультрикс Квадри». Мы оценили динамику гуморального иммунного ответа (титры антител в РТГА) после двукратной иммунизации с интервалом 21 день. Данное исследование направлено на определение потенциала платформы саРНК в контексте разработки вакцин против гриппа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клонирование и in vitro транскрипция

Плазмида, кодирующая самоамплифицирующуюся РНК, содержащую репликон вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) с геном GFP (T7-VEE-GFP), была получена из коллекции Addgene (плазмида № 58977). Исходная плазмида, содержавшая последовательности EMCV IRES и ген устойчивости к пуромицину, была модифицирована путем удаления этих элементов. Для снижения реактогенности в последовательность неструктурного белка nsP2 была введена мутация S773P. Кроме того, последовательность eGFP под контролем субгеномного промотора заменили на последовательность гемагглютинина вируса гриппа A/Wisconsin/588/2019 (H1N1). Для конструкции классической матричной РНК последовательность H1N1 фланкировали 5'-нетранслируемой областью (5'-UTR) и 3'-нетранслируемой областью (3'-UTR) человеческого альфа-глобина, а также полиА-хвостом длиной 110 н.о.

Транскрипцию саРНК и мРНК in vitro проводили в реакционной смеси, содержащей 5 мкг линеаризованной плазмиды, реагенты из набора RNA-20 Kit (Biolabmix, Россия), 2,4 мМ синтетического аналога 3'-O-Me-m7G(5') ppp(5')G (кэп-аналог ARCA) (Biolabmix, Россия) для саРНК и 2,4 мМ m27,3′-OGpppAmG (CapAG; Biolabmix) для мРНК, 1 мкг/мкл ингибитора рибонуклеаз RiboCare (Evrogen, Россия) и 0,002 е.а/мкл неорганической пирофосфатазы (New England Biolabs, США) в соответствии с протоколом производителя. Для транскрипции саРНК in vitro использовали стандартный набор нуклеотидов, включающий 3 мМ каждого из ATP, UTP, CTP и 0,6 мМ GTP (Biolabmix, Россия), для синтеза мРНК — 3 мМ ATP, CTP, GTP и N1-метилпсевдоуридина (Biolabmix, Россия). Реакцию проводили в течение 1 ч при 37 °C. Для удаления ДНК-матрицы образцы гидролизовали термолабильной ДНКазой (Thermolabile DNase; Biolabmix, Россия). Затем РНК очищали с использованием магнитных частиц для выделения РНК (RNA beads; Vazyme, Китай). Длину и чистоту синтезированных молекул РНК оценивали с помощью системы микрочипового электрофореза MultiNA (Shimadzu, Япония).

Формуляция РНК в липидные наночастицы

Для инкапсуляции мРНК и саРНК в липидные наночастицы (ЛНЧ) мы использовали автоматизированную систему NP System для генерации липосом (микрочип-миксер, Dolomite Microfluidics, Великобритания). Методика формулирования была аналогична описанной для других мРНК-платформ [13]. Липидный состав включал следующие компоненты: холестерин (Merck, США), ионизируемые катионные липиды (ICL) SM-102 (Sinopeg, Китай), ICL ALC-0315 (Sinopeg, Китай), вспомогательный липид DSPC (Avanti, США), пегилированный липид DMG-PEG2000 (Avanti, США). Оптимальное молярное соотношение компонентов составляло 42,70 : 23,15 : 23,15 : 9,40 : 1,60 (холестерин : SM-102 : ALC-0315 : DSPC : DMG-PEG2000).

После формулирования суспензии частиц очищали методом диализа с использованием мембран Float-ALyzer G2 объемом 1 мл с порогом молекулярной массы отсечения (MWCO) 10 кДа; материал мембраны — сложный эфир целлюлозы (Cellulose Ester; Repligen, США). Мембраны подготавливали в соответствии с протоколом производителя. Диализ проводили в течение ночи (12 ч) в фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4) при +4 °C при интенсивном перемешивании. Буфер заменяли один раз. Криопротекцию осуществляли в 20% растворе сахарозы в PBS в течение 2 ч при +4 °C, затем необходимое количество аликвот для анализа и функционального тестирования замораживали при –80 °C.

Аналитическая характеризация мРНК препаратов

Определение размера липидных наночастиц (ЛНЧ) и индекса полидисперсности (PDI) осуществляли на анализаторе Zetasizer Ultra (Malvern Panalytical). Образцы ЛНЧ предварительно разбавляли в 100 раз фосфатносолевым буфером (PBS) и выдерживали при комнатной температуре для термостабилизации. Измерения проводили в пластиковых кюветах; для каждого образца регистрировали три повторности (каждая — до 100 сканов) до достижения стабильных показаний.

Показатель эффективности инкапсуляции (ЭИ, %) определяли согласно опубликованному протоколу [14]. С целью оценки инкапсуляции ЛНЧ подвергали лизису в TE-буфере (pH 7,5), содержащем 1% Triton X-100. Окрашивание интеркалирующим флуоресцентным красителем SYBR Green (Evrogen, Россия) выполняли как для интактных, так и для лизированных частиц — до и после дестабилизации липидной оболочки. Количественное содержание РНК устанавливали по калибровочной зависимости, построенной с использованием стандарта мРНК в TE-буфере (в присутствии и отсутствии Triton X-100).

Итоговую концентрацию инкапсулированной мРНК вычисляли как разность сигналов, полученных для лизированных и нативных образцов.

Подробная характеристика препаратов мРНК-ЛНЧ, используемых в эксперименте, приведена в результатах исследования.

Иммунизация

Для оценки иммуногенности были сформированы четыре группы мышей линии BALB/c (самки возрастом 7–8 недель, по шесть мышей в группе; рис. 1А). При формировании групп мышей распределяли в случайном порядке. Иммунизировали мышей в мышцу бедра на нулевой день и 21-й день в дозах 2 мкг саРНК или мРНК в объеме 0,2 человеческой дозы (3 мкг) вакцины «Ультрикс Квадри» (штаммовый состав 2025–2026 гг. для Северного полушария: A/Victoria/4897/2022 (H1N1)pdm09; A/Croatia/10136RV/2023 (H3N2); B/Austria/1359417/2021; B/ Phuket/3073/2013) и 100 мкл плацебо (PBS с 20% сахарозы). Оценку титра антител проводили в сыворотках крови мышей на 20-й день после первой иммунизации и на 21-й день после второй иммунизации (42-й день после первой иммунизации) в реакции торможения гемагглютинации (титр РТГА) по отношению к гемагглютинину антигенных вариантов вируса гриппа A(H1N1)pdm09.

Доза инактивированной вакцины «Ультрикс Квадри» для мышей (3 мкг гемагглютинина на штамм, что соответствует ~0,2 человеческой дозы) была выбрана на основе аллометрического масштабирования по площади поверхности тела с использованием Km-факторов [15]:

Km (человек) = 37, Km (мышь) = 3. Расчетная эквивалентная доза составила ~1,2 мкг, однако для обеспечения надежной детекции иммунного ответа и сопоставимости с дозой экспериментальных РНК-препаратов (2 мкг) использовали консервативную дозу 3 мкг. Поскольку экспериментальные РНК-препараты кодируют единственный антиген (ГА A/Wisconsin/588/2019), сравнение иммуногенности с «Ультрикс Квадри» проводили по эквивалентной дозе гемагглютинина конкретного штамма H1N1, что обеспечивает корректность интерпретации данных.

Реакция торможения гемагглютинации

Иммуногенность в экспериментах на животных оценивали с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в соответствии с протоколом РТГА, разработанным на основе рекомендаций Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [16]. Для этого сыворотки крови мышей обрабатывали рецептор-разрушающим ферментом (RDE, полученный из Vibrio cholerae, приобретен в Denka Seiken Co., Ltd., Токио, Япония), после чего в 96-луночных планшетах с V-образным дном готовили двукратные разведения обработанных сывороток. Затем добавляли вирусный антиген в рабочей дозе 8 агглютинирующих единиц (АЕ) и инкубировали планшет в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого добавляли 0,5–1% суспензии человеческих эритроцитов первой группы крови системы АВ0 и инкубировали планшет еще 60 мин при комнатной температуре. Если в образце сыворотки присутствовали антитела, способные перекрестно реагировать с вирусом, они связывались с вирусом и препятствовали его способности агглютинировать эритроциты. После инкубации титр антител определяли как наибольшее разведение сыворотки, при котором еще наблюдали торможение гемагглютинации.

Антиген вируса гриппа A/Victoria/4897/2022 для проведения РТГА был приобретен в ООО «Компания по производству диагностических препаратов» (СанктПетербург, Россия). Культивирование вирусного штамма A/Wisconsin/588/2019 с целью накопления антигенного материала проводили на культуре клеток MDCK согласно общепринятой методике [16].

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили, используя однофакторный дисперсионный анализ Краскела–Уоллиса с помощью теста Данна для попарного сравнения (post-hoc). Различия между экспериментальными группами считали статистически значимыми при p < 0,05. Анализ данных и их визуализацию производили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 10.4.1 (GraphPad Software, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе проводили оценку качества полученных вакцинных препаратов на основе мРНК и саРНК, инкапсулированных в липидные наночастицы (рис. 1). Оба препарата были приготовлены в концентрации 20 нг/мкл (в пересчете на РНК). Препараты имели высокий уровень инкапсуляции: для классической мРНК этот показатель составил 99,9%, для самоамплифицирующейся саРНК — 94,0% (рис. 1А). Средний гидродинамический диаметр частиц находился в сопоставимом диапазоне: ~99,2 нм для мРНК-препарата и ~88,2 нм для саРНК-препарата, что соответствует оптимальному размеру для клеточного захвата путем эндоцитоза. Целостность и размер нуклеиновых кислот были верифицированы методом капиллярного гель-электрофореза после разрушения липидных наночастиц. Четкие дискретные полосы без признаков деградации свидетельствовали о высоком качестве полученных препаратов. Длина классической мРНК ~2000 н.о., а саРНК ~9500 н.о., что обусловлено наличием в ее составе последовательности неструктурных генов альфавируса (рис. 1Б). Анализ распределения частиц по размерам методом динамического светорассеяния подтвердил однородность обоих препаратов.

Размер частиц был в диапазоне от 88 нм до 100 нм при индексе полидисперсности PDI < 0,11 (рис. 1В, Г). Таким образом, препараты на основе мРНК и саРНК имели высокие показатели качества и сопоставимые физикохимические параметры, что позволило использовать их для дальнейшей оценки иммуногенности.

Через 20 дней после первой иммунизации в группах мышей, получивших экспериментальные РНК-препараты (саРНК и мРНК), наблюдали детектируемые титры антител, ингибирующих гемагглютинацию (p < 0,01)  против антигенов вирусов гриппа A/Wisconsin/588/2019 и A/Victoria/4897/2022 по сравнению с группой отрицательного контроля (PBS) (рис. 2Б). В группе саРНК среднее геометрических титров антител составило 1 : 180 (ДИ (95% доверительный интервал): 1 : 133 – 1 : 242) против штамма A/Wisconsin/588/2019 и 1 : 67 (ДИ: 1 : 44 – 1 : 92) против A/Victoria/4897/2022. В группе классической мРНК были получены более высокие показатели: 1 : 285 (ДИ: 1 : 165 – 1 : 493) и 1 : 101 (ДИ: 1 : 48 – 1 : 214) против тех же штаммов соответственно, однако межгрупповые различия не достигали статистической значимости. В группе животных, вакцинированных коммерческой инактивированной сплит-вакциной «Ультрикс Квадри» (0,2 человеческой дозы), титр антител в РТГА против штамма A/Wisconsin/588/2019 составил 1 : 71 (ДИ: 1 : 53 – 1 : 96), а против штамма A/Victoria/4897/2022 наблюдали минимальные титры антител (менее 1 : 37 (ДИ: 1 : 17 – 1 : 73)). Таким образом, вакцина «Ультрикс Квадри» хоть и имела в своем составе антигены вирусного штамма A/Victoria/4897/2022, однако стимулировала выработку более низкого уровня иммунного ответа в выбранной дозе.

Через 20 дней после второй иммунизации (41-й день эксперимента; рис. 2В) наблюдалось существенное повышение титров антител, ингибирующих гемагглютинацию как против штамма A/Wisconsin/588/2019, так и против штамма A/Victoria/4897/2022 в группах экспериментальных РНК-препаратов по сравнению с первой иммунизацией (рис. 2Б). Наиболее выраженное повышение титра антител отмечено в группе мышей, иммунизированных классической мРНК. Титр антител в группе мРНК против штамма A/Wisconsin/588/2019 был 1 : 2281 (ДИ: 1 : 1319 – 1 : 3943), что выше (p < 0,0001) по сравнению с группой отрицательного контроля (PBS) и группой мышей, получивших контрольную вакцину (1 : 17 (ДИ: 1 : 8 – 1 : 42)). Против штамма A/Victoria/4897/2022 в группе мРНК также наблюдались высокие титры (1 : 1810 (ДИ: 1 : 844 – 1 : 3882)), отличающиеся от контроля и группы «Ультрикс Квадри» (1 : 56 (ДИ: 1 : 26 – 1 : 121); p < 0,05). В группе мышей, иммунизированных саРНК, титры антител также повышались после второй иммунизации, но менее выражено, чем в группе мРНК. В группе саРНК титры составили 1 : 640 (ДИ: 1 : 404 – 1 : 1014) против штамма A/Wisconsin/588/2019 и 1 : 452 (ДИ: 1 : 246 – 1 : 832) против штамма A/Victoria/4897/2022, что было также выше, чем у контрольной группы (p < 0,05). Межгрупповые различия групп саРНК и мРНК не достигли статистической значимости. Вакцина «Ультрикс Квадри» после второй иммунизации показала низкие титры антител в тесте РТГА, которые были значительно ниже показателей обеих групп РНК-вакцин. В целом, эти данные свидетельствуют о высоком гуморальном иммунном ответе, наблюдаемом при использовании мРНК- и саРНК-вакцин.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании проведено сравнение иммуногенности экспериментальных вакцин на основе классической мРНК и самоамплифицирующейся саРНК, кодирующих гемагглютинин вируса гриппа A/Wisconsin/588/2019 (H1N1)pdm09, в доклинической модели на мышах линии BALB/c. После второй иммунизации наблюдалось значительное увеличение титров антител в обеих группах РНК-вакцин, которые значительно превосходили показатели, наблюдаемые при использовании вакцины «Ультрикс Квадри». Последняя показала лишь умеренный рост или отсутствие значимого ответа против штаммов A/Wisconsin/588/2019 и A/Victoria/4897/2022. Низкая иммуногенность инактивированной вакцины, наблюдаемая нами в ходе описанных экспериментов, может быть обусловлена как низкой выбранной дозой вакцины (по 3 мкг каждого из четырех антигенов), так и свойствами платформы (фиксированной дозой антигена, отсутствием эндогенной экспрессии и адъювантов). Что же касается РНК-препаратов, то они, согласно литературным источникам, обеспечивают длительный биосинтез вирусных антигенов и могут оказывать дополнительный адъювантный эффект за счет активации рецепторов врожденного иммунитета (TLR3, TLR7/8, RIG-I) [11].

Анализ перекрестной реактивности выявил, что использование РНК-препаратов обеспечивает формирование высокого титра антител как против гомологичного штамма A/Wisconsin/588/2019, так и против антигенно-дистантного варианта A/Victoria/4897/2022. Способность обеих РНКпрепаратов индуцировать выраженную иммуногенность против антигенно-дистантного штамма A/Victoria/4897/2022 подтверждает потенциал платформы РНК для индукции кросс-реактивного иммунного ответа [17]. Эти результаты подтверждают литературные сведения о способности РНК-вакцин индуцировать антитела, распознающие антигенно-дрейфующие штаммы [18–20]. Таким образом, создание мультивалентных конструкций, кодирующих гемагглютинины нескольких подтипов гриппа, может способствовать разработке универсальной вакцины с широкой перекрестной защитой [21]. Эти обстоятельства подтверждают перспективность обеих РНК-технологий для профилактики гриппа.

Полученные в нашем исследовании титры РТГА для классической мРНК (1 : 2281 (ДИ: 1 : 1319 – 1 : 3943) против гомологичного штамма после второй иммунизации) находятся в диапазоне значений, наблюдаемых в других исследованиях [19–20]. Показано, что однократная иммунизация мРНК-препаратом против гриппа индуцировала титры >1 : 40, а после второй иммунизации значения находились в диапазоне 1 : 1000–1 : 5000 в зависимости от штамма и дозы [22]. В нашем предыдущем исследовании [23] средние геометрические титры антител в РТГА после двукратной иммунизации трехвалентным мРНК-препаратом также превышали 1 : 1000 и были в ~86 раз выше по сравнению с инактивированной вакциной. Для саРНК-платформы наши данные (1 : 640 (ДИ: 1 : 404 – 1 : 1014) при дозе 2 мкг) согласуются с другим исследованием, показывающим, что вакцины на основе самоамплифицирующейся РНК обеспечивают высокие титры РТГА после первой иммунизации на уровне 1 : 104 ± 53,67 при дозе 1,25 мкг [24]. Несмотря на отсутствие статистической значимости в РТГА-титрах в группах мРНК и саРНК, абсолютные значения и размах в группе мРНК были выше. Эти эффекты могут быть связаны со специфическим паттерном трансляции саРНК. Так, в экспериментах по прижизненной биолюминесценции на репортерных белках было показано, что в первые дни после введения саРНК наблюдается более низкий уровень биосинтеза целевого белка, который достигает максимума на 5–7 день после введения и затем постепенно снижается [25–27]. В случае препаратов мРНК максимальный уровень репортерного белка достигается через сутки после введения и затем значительно снижается, что обусловлено коротким периодом полудеградации РНК [25–27].

Важным ограничением текущего исследования является отсутствие оценки клеточного иммунного ответа. В данной работе мы сосредоточились на оценке гуморального иммунитета, в частности на оценке уровня гемагглютининингибирующих антител. Титры в РТГА  являются коррелятом защиты против гриппа и используются регуляторными органами для оценки эффективности вакцин [28]. Следует также отметить, что при одинаковой массовой дозе (2 мкг) молярное количество саРНК (~9,5 т.п.н.) примерно в 5 раз ниже, чем у мРНК (~2 т.н.). Сравнение препаратов в равной дозе необходимо для детекции возможных дозозависимых побочных эффектов. Выбор дозы был обусловлен ограничениями по реактогенности саРНК-платформы (активация врожденного иммунитета репликационными интермедиатами) и компенсирующим эффектом самоамплификации, обеспечивающим высокий уровень экспрессии антигена даже при меньшем стартовом количестве молекул.

Несмотря на более скромные результаты по иммуногенности кандидатной вакцины на основе саРНК, ее использование обладает большим потенциалом снижения дозы и потенциально может способствовать более длительному сохранению титров антител по сравнению с мРНК благодаря внутриклеточной репликации, что может снизить стоимость препарата и нежелательные эффекты, связанные с более высокой дозой липидных наночастиц. Перспективы дальнейшей разработки связаны с оптимизацией последовательности самоамплифицирующейся РНК. В частности, внесение мутаций в последовательности неструктурных белков репликона и оптимизация регуляторных элементов могут значительно улучшить иммуногенность саРНК-вакцин [11].

ВЫВОДЫ

Полученные данные демонстрируют, что кандидатные РНК-препараты на основе классической мРНК и саРНК, инкапсулированные в липидные наночастицы, приводят к формированию выраженного гуморального иммунного ответа против гомологичного A/Wisconsin/588/2019 и дистантного штамма A/Victoria/4897/2022, что подчеркивает их перспективность для создания вакцин нового поколения против сезонного и пандемического гриппа. Результаты нашего исследования показали, что кандидатный вакцинный препарат против гриппа на основе саРНК не показал преимуществ по сравнению с мРНК-препаратом. Таким образом, требуется дальнейшая оптимизация ее последовательности, дозы и режима введения.