Макак-резус (Macaca mulatta) относится к числу наиболее распространенных модельных организмов в биомедицинских исследованиях. В сфере инфекционной патологии этот вид служит моделью для изучения патологий человека различной этиологии, включая ВИЧ-инфекцию/СПИД, туберкулез, гепатиты, грипп [1]. Кроме того, благодаря высокому филогенетическому сходству нервной системы макак и человека, они активно используются в нейробиологии, в частности при моделировании нейродегенеративных процессов и болезни Альцгеймера [2], ряда редких наследственных заболеваний [3], а также при доклинической оценке нейроактивных лекарственных средств [4]. Широкое применение этого вида в экспериментальной биомедицине обусловливает значительный интерес к изучению генетических основ фенотипической изменчивости M. mulatta, в частности, различий в восприимчивости к заболеваниям и ответе на терапию [5].

Ключевым инструментом для решения таких задач служат полногеномные ассоциативные исследования (GWAS), однако их проведение на больших когортах ограничено высокой стоимостью полногеномного секвенирования [6]. В условиях ограниченного бюджета особую значимость приобретают подходы, позволяющие сократить затраты на получение геномных данных без потери их информативности. Эффективной альтернативой прямому глубокому секвенированию выступает секвенирование с низким покрытием с последующей статистической импутацией генотипов. Этот подход позволяет восстанавливать пропущенные генотипы на основе известных гаплотипов из эталонной (референсной) панели, в разы снижая стоимость анализа по сравнению со стандартным покрытием (от 20х) и делая возможным проведение популяционных исследований на выборках из тысяч образцов [7]. Ключевым фактором, определяющим эффективность импутации, является наличие репрезентативной, фазированной и генетически близкой к целевой выборке референсной панели [8].

Для M. mulatta создан ряд геномных ресурсов, ориентированных на каталогизацию и аннотацию известных генетических вариантов. Наиболее масштабным из них является mGAP, предоставляющий каталог аннотированных вариантов, полученных в результате секвенирования 2,5 тыс. особей [5]. Стоит также отметить базу данных RhesusBase, включающую 46,1 млн полиморфных сайтов [9] и ресурс для межвидовых сравнений внутри рода Macaca MACSNVdb (74,5 млн SNV) [10]. Эти ресурсы решают задачи каталогизации, аннотации и поиска известных вариантов, однако не предоставляют фазированной референсной панели гаплотипов, необходимой для восстановления полногеномных генотипов у новых, ранее не секвенированных образцов.

В современной практике фазированные референсные панели для импутации генотипов служат базовым инструментом в крупных геномных проектах, связанных с изучением человека и сельскохозяйственных животных [11, 12]. В международных репозиториях представлены обширные массивы данных полногеномного секвенирования Macaca mulatta. В 2025 г. была опубликована первая специализированная референсная панель для данного вида, обеспечивающая высокую точность импутации генотипов даже при уровне покрытия 0,5× [13]. Тем не менее этот ресурс ограничен преимущественно индийской линией Macaca mulatta. За рамками анализа остается генетическая структура искусственно созданных закрытых популяций, генезис которых связан с гетерогенным происхождением исходного поголовья, фрагментарностью архивных данных об интродукции и многолетней панмиксией [14, 15]. Для таких популяций смешанного происхождения оптимальным решением становится использование интегрированной панели, объединяющей основные географические линии вида, что сочетает популяционную специфичность и универсальность.

Целью настоящей работы было описать разработку и валидацию фазированной референсной панели для импутации генотипов M. mulatta. Панель сформирована на основе результатов полногеномного секвенирования 618 образцов индийского и китайского происхождения из открытых источников, обработанных по единому стандартизированному протоколу с использованием современных алгоритмов фазирования и импутации. При оценке точности импутации по независимым тестовым образцам обеих линий получены высокие значения R² и конкордантности в диапазоне глубины покрытия 0,1×–0,9× при ожидаемом преимуществе доминирующей в панели индийской линии. Разработанный ресурс служит основой для проведения полногеномных ассоциативных и популяционно-генетических исследований на макаках-резус в отечественных и зарубежных приматологических центрах, генетическая структура популяций в которых может быть смешанной и априори неизвестной [16, 17].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор и систематизация общедоступных данных полногеномного секвенирования

Систематический поиск данных полногеномного секвенирования M. mulatta осуществляли в международных репозиториях NCBI SRA [18], ENA [19] и NGDC [20]. Отбор данных производили на основании следующих критериев: подтвержденная видовая принадлежность к M. mulatta, глубина секвенирования не менее 20x, а также наличие верифицированных метаданных о географическом происхождении (Индия или Китай) и поле особи. В ходе первичного поиска было идентифицировано 1808 образцов. После фильтрации по величине покрытия и валидации метаданных число кандидатов составило 982. Из дальнейшего анализа исключали особи, определенные в метаданных как межвидовые гибриды (M. mulatta × M. fascicularis), а также образцы с неустановленным географическим происхождением.

На заключительном этапе формирования выборки применяли процедуру стратификации, направленную на достижение сбалансированного по полу состава внутри каждой популяционной группы и на минимизацию потенциальных систематических искажений, обусловленных неодинаковой представленностью данных из различных исследований. Итоговый массив включил 618 уникальных особей из трех проектов: PRJNA251548 (BCM, n = 21), PRJNA382404 (OHSU, n = 397) и CRA014717 (KIZ, n = 200). Из общего числа образцов 418 имели индийское происхождение, 200 — китайское; количество самок составило 410, самцов — 208. Сведения о географическом происхождении и поле каждого образца представлены в файле dataset-description.xlsx в открытом репозитории Zenodo: https://doi.org/10.5281/ zenodo.21296424.

Биоинформатическая обработка и идентификация SNP

Для всех 618 образцов был разработан и применен единый стандартизированный пайплайн биоинформатической обработки, обеспечивающий консистентность данных на всех этапах. Необработанные прочтения фильтровали по качеству с помощью fastp v0.23.2 [21] с параметрами: -w 12 -z 7 -V -g --poly_g_min_len 5 -x --poly_x_min_len 10 -5 -3 -M 30 -n 1 -e 20 -l 50 --c. Отфильтрованные прочтения картировались на референсный геном M. mulatta (сборка Mmul_10, GCF_003339765.1) с использованием Bowtie2 v2.3.5.1 [22] с настройками по умолчанию. Идентификацию SNP выполняли с помощью bcftools v1.15 [23] (команды mpileup и call) с ключевыми параметрами: --redo-BAQ --min-BQ 30 --per-sample-mF --annotate DP,AD --multialleliccaller --variants-only. На следующем этапе из итоговых VCFфайлов удаляли инсерции и делеции с использованием vcftools v0.1.16 (параметр --remove-indels), оставляя только однонуклеотидные замены (SNP) для дальнейшего анализа. Полученный VCF-файл подвергали дополнительной строгой фильтрации с использованием vcftools v0.1.16 [24] по критериям: качество генотипа (GQ) ≥ 30, глубина прочтения (DP) 15–180, доля пропущенных генотипов на сайт ≤ 0,02, минимальная частота минорного аллеля (MAF) ≥ 0,01.

Фазирование референсной панели

Для восстановления хромосомных фаз гаплотипов отфильтрованного набора данных использовали пакет SHAPEIT5 v5.1.0 [25], разработанный для крупных массивов WGS-данных и характеризующийся высокой точностью восстановления гаплотипных фаз при работе с большими выборками. Для повышения вычислительной эффективности и снижения требований к оперативной памяти применяли постадийное фазирование с разбиением генома на независимые блоки. На первом этапе с помощью модуля SHAPEIT5_phase_common обработку проводили в хромосомных блоках длиной 20 сМ; для каждого блока выполняли независимое фазирование с последующей оценкой качества. С целью обеспечения целостности сборки полных хромосом и устранения артефактов, возникающих на границах блоков, осуществляли дополнительное фазирование в перекрывающихся участках на стыках (перекрытие 2 сМ) с последующим объединением фаз в единую хромосомную последовательность. В результате была сформирована полностью фазированная панель, содержащая для каждой из 618 особей два гаплотипа (материнский и отцовский), что является необходимым условием для последующей импутации генотипов.

Импутация генотипов и валидация панели

Для оценки точности созданной референсной панели из ее состава были исключены два образца с известным географическим происхождением: M00016 (индийская популяция) и CRR1023808 (китайская популяция). Исходные BAM-файлы высокого покрытия для каждого из этих образцов были подвергнуты прореживанию (downsampling) до пяти уровней глубины покрытия: 0,1×, 0,3×, 0,5×, 0,7× и 0,9×, что позволяло имитировать условия секвенирования с низким покрытием.

Импутацию генотипов для смоделированных данных выполняли с использованием пайплайна GLIMPSE2 v2.0.0 [26]. Процедура включала последовательные этапы: разбиение генома на перекрывающиеся окна с помощью утилиты GLIMPSE2_chunk, подготовку референсной панели в формате GLIMPSE2 посредством GLIMPSE2_ split_reference, непосредственно импутацию и фазирование через GLIMPSE2_phase, а также объединение результатов по всем окнам для восстановления полнохромосомных файлов с использованием GLIMPSE2_ligate.

Точность импутации оценивали путем сопоставления импутированных генотипов с референсными, в качестве которых использовали исходные генотипы высокой надежности тех же образцов до проведения прореживания. Для расчета применяли инструмент GLIMPSE2_concordance, вычисляющий два показателя: конкордантность (долю полностью совпавших генотипов) и R² (квадрат коэффициента корреляции между импутированными и референсными дозами аллелей). Данный подход позволял количественно охарактеризовать зависимость точности импутации от глубины покрытия целевого образца и степени его генетической близости к референсной панели. Референсная панель доступна в открытом репозитории Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.21296424.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика созданной референсной панели

В результате консолидации и унифицированной обработки данных 618 особей M. mulatta сформирована фазированная референсная панель гаплотипов, включающая 33 457 491 высокодостоверный SNP-маркер. Популяционная структура панели определяется составом включенных проектов. Большинство образцов имеют индийское происхождение (418 особей; 67,6%), что связано с преобладанием в выборке проекта PRJNA382404 (OHSU, n = 397), образцы которого относились к индийской популяции. Китайское происхождение установлено для 200 особей (32,4%; проект CRA014717, KIZ). Благодаря такому соотношению в панели обеспечена представленность обеих основных географических линий, что расширяет область ее применения на лабораторные популяции со смешанным или неустановленным происхождением. Половой состав выборки характеризуется смещением в сторону самок: 410 самок (66,3%) и 208 самцов (33,7%), что отражает структуру исходных общедоступных WGS-данных.

Оценка точности импутации

Оценку точности импутации выполняли по двум метрикам: конкордантности (доле полностью совпавших генотипов) и R² (квадрату коэффициента корреляции между импутированными и референсными дозами аллелей). В отличие от конкордантности, R² более чувствителен к ошибкам при редких вариантах, поскольку отражает корреляционную связь между дозами аллелей. Оба показателя ожидаемо демонстрировали прямую зависимость от уровня покрытия целевого образца: с увеличением глубины точность импутации закономерно возрастала. Дополнительно оценивали точность импутации в зависимости от частоты минорного аллеля (MAF) в диапазоне от 1 до 45%.

Для образца индийского происхождения M00016 значение R² при увеличении покрытия с 0,1х до 0,9х возрастало с 0,56 до 0,96 (рис. 1А). При стратификации по MAF установлено, что для частых вариантов (MAF ≥ 10%) R² достигал 0,95–0,96 уже при покрытии 0,7×, тогда как для редких вариантов (MAF < 1%) значение R² составляло 0,56 при 0,1× и 0,84 при 0,9×. Конкордантность для данного образца при 0,9× варьировала от 0,61 (MAF 1%) до 0,96–0,97 (MAF ≥ 10%).

Для образца китайской популяции CRR1023808 R² повышался с 0,58 при 0,1× до 0,95 при 0,9× (рис. 1Б). Для частых вариантов (MAF ≥ 10%) R² достигал 0,93–0,95 при покрытии 0,7×, для редких (MAF 1%) — 0,58 при 0,1× и 0,82 при 0,9×. Конкордантность для данного образца при 0,9× составляла от 0,63 (MAF 1%) до 0,95–0,97 (MAF ≥ 10%).

Полученные значения R² и конкордантности свидетельствуют о высокой эффективности созданной референсной панели для импутации генотипов у макакрезус. Для частых и среднечастотных вариантов (MAF ≥ 10%) значение R² достигает 0,93‒0,96 уже при покрытии 0,7×, а конкордантность при 0,9× превышает 0,95 для обоих тестовых образцов, что подтверждает надежность восстановления генотипов для данной категории маркеров. Для редких вариантов (MAF 1%) точность импутации ожидаемо ниже: R² составляет 0,82–0,84 при 0,9×, конкордантность — 0,86‒0,88, что указывает на необходимость более глубокого покрытия (не менее 0,7×‒0,9×) при проведении исследований, ориентированных на анализ редких генетических вариантов. Таким образом, созданная панель обеспечивает высокую точность импутации для широкого спектра вариантов и может быть использована в популяционных и ассоциативных исследованиях макак-резус.

Анализ популяционной структуры

Для оценки генетической структуры референсной панели был проведен анализ главных компонент (PCA) на основе 33457491 SNP-маркера. Первая главная компонента (PC1, 68,5% общей дисперсии) четко разделяет образцы индийского и китайского происхождения на два обособленных кластера (рис. 2), что согласуется с ранее опубликованными данными о значительной генетической дивергенции между двумя основными географическими линиями M. mulatta [27]. Вторая главная компонента (PC2, 5,2% дисперсии) выявляет дополнительную структуру внутри каждой из групп: образцы индийского происхождения демонстрируют относительно компактное распределение, тогда как китайские образцы характеризуются большим разбросом вдоль PC2, что соответствует более высокой генетической гетерогенности восточноазиатской линии вследствие ее подвидового разнообразия [28].

Апробация панели на независимых образцах

Для апробации панели на независимых данных была проведена импутация генотипов 10 особей M. mulatta из коллекции Курчатовского комплекса медицинской приматологии НИЦ «Курчатовский институт», не входивших в состав референсной панели. Секвенирование выполняли со средним покрытием 0,6×, что соответствует схеме эксперимента, обеспечивающей оптимальный баланс между стоимостью и достоверностью генотипирования при использовании секвенирования с низким покрытием [7, 12]. Импутацию выполняли с использованием алгоритма GLIMPSE2 на созданной референсной панели.

Качество импутации оценивали по показателю INFO/ RSQ, отражающему степень статистической уверенности для каждого импутированного варианта и принимающему значения от 0 до 1. В исследованной выборке значения INFO/RSQ варьировали от 0,862 до 0,934 при среднем значении 0,898. Все идентифицированные варианты характеризовались значениями INFO > 0,8, соответствующими строгому порогу отбора для частых и среднечастотных вариантов [29, 30].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе создана и валидирована фазированная референсная панель гаплотипов для импутации генотипов у Macaca mulatta, включающая 618 особей и 33,4 млн SNP-маркеров, обработанных по единому стандартизированному пайплайну. Среди доступных ресурсов для импутации генотипов данного вида следует выделить панель из 741 особи индийской линии [13] и масштабную когорту из 919 китайских макак с фенотипическими данными, представляющую собой ресурс, ориентированный на GWAS, но не представляющий собой единой фазированной импутационной панели [31]. Оба ресурса не охватывают обе географические линии вида в рамках единого стандартизированного пайплайна обработки. Между тем значительная часть лабораторных популяций M. mulatta в исследовательских центрах мира формировалась на протяжении десятилетий путем завоза животных из разных регионов и последующего неконтролируемого скрещивания, что нередко приводило к неизвестному или смешанному происхождению животных [14, 27, 32]. Это обусловливает практическую потребность именно в интегрированном ресурсе, охватывающем обе линии, разработанном в настоящей работе. Ни один из перечисленных ресурсов не охватывает обе географические линии вида в рамках единого стандартизированного пайплайна обработки. Между тем значительная часть лабораторных популяций M. mulatta в исследовательских центрах мира формировалась на протяжении десятилетий путем завоза животных из разных регионов и последующего скрещивания, а в отдельных питомниках путем преднамеренного или непреднамеренного скрещивания особей китайского и индийского происхождения, что нередко приводило к неизвестному или смешанному происхождению отдельных животных или целых субпопуляций [32]. Это обусловливает практическую потребность именно в интегрированном ресурсе, охватывающем обе линии, созданном в настоящей работе.

Полученные показатели точности импутации полностью согласуются с опубликованными данными. Наибольшая точность достигнута для образцов индийского происхождения: R² 0,95–0,96 для частых вариантов уже при покрытии 0,7x, что сопоставимо с результатами, полученными по индийской панели [13]. Для китайской линии показатели несколько ниже, что закономерно отражает ее меньшую представленность. Разработанная панель значительно превосходит ранее доступные ресурсы по плотности маркеров, обеспечивая покрытие более 33 млн SNP, что соответствует уровню современных референсных панелей для сельскохозяйственных животных и открывает возможности для высокоразрешающего популяционного и ассоциативного анализа. При покрытии уже 0,6× панель обеспечивает качество импутации, сопоставимое с коммерческими SNP-чипами, что делает подход экономически эффективным для генотипирования больших когорт.

Практическая ценность созданного ресурса определяется широким спектром биомедицинских задач, в которых M. mulatta выступает основной моделью: изучение инфекционных заболеваний, исследования в области нейробиологии, фармакологии и токсикологии. Полногеномное генотипирование на основе импутации открывает возможность популяционного скрининга животных на носительство вариантов, ортологичных патогенным мутациям человека [33], а также контроля межиндивидуальной фармакокинетической вариабельности, обусловленной полиморфными вариантами ферментов метаболизма лекарственных веществ [34]. Этот подход доказал свою эффективность и на других модельных и сельскохозяйственных видах. Для крупного рогатого скота создана мультипородная панель на выборке из 2976 животных, включающая 61,8 млн SNP-маркеров. При использовании алгоритма GLIMPSE2, также примененного в данной работе, эта панель демонстрировала конкордантность более 99% уже при покрытии 0,1× [35]. Для свиней описаны панели SWIM (2259 особей из 44 пород) [36] и PHARP, построенная на основе данных 1181 особи из 71 популяции [37]. Все эти панели сформированы путем объединения данных нескольких общедоступных проектов по генотипированию различных популяций, что соответствует подходу, реализованному в настоящем исследовании. Растущий интерес к данному направлению отмечается и в отечественных исследованиях: перспективы секвенирования с низким покрытием для геномной селекции крупного рогатого скота обсуждаются в обзоре российских авторов [38], а импутированные полногеномные данные уже применяются для ассоциативного анализа хозяйственно значимых признаков в российских стадах [39]. Успешный опыт создания подобных ресурсов для других видов подтверждает, что разработанный в настоящей работе биоинформатический пайплайн воспроизводим и может быть адаптирован для создания аналогичных панелей для других видов приматов, применяемых в биомедицинских исследованиях.

Основные направления развития ресурса — расширение китайской компоненты панели на основе общедоступных данных, а также включение образцов из отечественных приматологических коллекций, что позволит повысить точность импутации для популяций со смешанным происхождением. Созданная референсная панель и разработанный биоинформатический подход закладывают инфраструктурную основу для проведения масштабных полногеномных ассоциативных и популяционно-генетических исследований на макакахрезус в отечественных лабораториях.

Ограничения исследования

К числу основных ограничений выполненной работы относится неравномерная представленность географических линий в составе панели: количество образцов индийского происхождения (418) более чем в два раза превышает число китайских (200). Это обусловило более высокую точность импутации для индийской линии. Кроме того, панель сформирована на основе данных зарубежных репозиториев (BCM, OHSU, KIZ), в связи с чем для более точного отражения локальных популяций требуется последующее включение образцов из отечественных приматологических коллекций. Оценка точности методом искусственного прореживания выполнена на двух образцах в диапазоне покрытия 0,1–0,9×, тогда как апробация на реальных данных низкого покрытия проведена на 10 независимых образцах при среднем покрытии 0,6×. В связи с этим дальнейшая проверка на более крупной и гетерогенной выборке позволит дополнительно подтвердить воспроизводимость полученных результатов.

ВЫВОДЫ

Создана и валидирована фазированная референсная панель гаплотипов для импутации генотипов у Macaca mulatta, включающая 618 особей и 33,4 млн SNP-маркеров обеих основных географических линий вида, обработанных по единому стандартизированному пайплайну. Панель обеспечивает высокую точность импутации при сверхнизком покрытии и готова к практическому применению в популяционно-генетических и ассоциативных исследованиях. Разработанный пайплайн может служить шаблоном для создания аналогичных ресурсов для других видов приматов, используемых в биомедицинских исследованиях.