Токсокароз человека связан с миграцией и сохранением в тканях личинок нематод рода Toxocara, прежде всего T. canis и T. cati. Клинические проявления зависят от локализации личинок и реакции хозяина и включают висцеральные, глазные и неврологические поражения; возможно также малосимптомное протекание инфекции. Поскольку в организме человека паразит не достигает половозрелого состояния, обнаружение яиц в фекалиях не служит методом подтверждения человеческого токсокароза. Поэтому серологические методы занимают центральное место в обследовании пациентов и изучении контакта населения с возбудителем [1, 2].

Эпидемиологическую значимость токсокароза подтверждает метаанализ, объединивший 250 исследований из 71 страны: глобальная оценка серопозитивности составила 19,0% при существенных различиях между регионами и обследованными группами [3]. Казахстанские данные также указывают на необходимость региональных исследований. В нашем предыдущем исследовании в Уральске изучены серопозитивность и авидность IgG у взрослых и зараженность собак; а также разграничили наличие антител у человека и показатели текущей кишечной инвазии у окончательного хозяина [4]. Эти результаты характеризуют другую территорию и не позволяют непосредственно оценить авидностный профиль взрослых Алматы.

Применение экскреторно-секреторных антигенов личинок Toxocara в иммуно-ферментном анализе (ИФА) было обосновано в ранних исследованиях серологической диагностики [5]. Однако положительный IgG-результат не определяет давность и активность инвазии. Иммуноблот и рекомбинантные антигены могут повысить специфичность выявления антител, но решают иную задачу, чем оценка стадии инфекции [6]. При длительном наблюдении детей после лечения в одном из исследований было зарегистрировано снижение титров IgG значительно позднее, чем иммуноглобулинов классов E и A (IgE и IgA), начиная с четвертого года наблюдения [7]. Эти данные свидетельствуют о длительном сохранении антител, однако полученные у детей сроки нельзя непосредственно переносить на взрослых. Определение иммуноглобулинов класса M (IgM) также ограничено перекрестным связыванием с антигенами Toxocara у пациентов с другими гельминтозами и у здоровых лиц [8].

Авидность характеризует совокупную прочность многовалентного взаимодействия антител с антигеном и отличается от аффинности отдельного антигенсвязывающего участка. В модифицированном ИФА ее оценивают по сохранению сигнала после воздействия хаотропного агента, ослабляющего нековалентные взаимодействия. Описан такой подход с использованием диссоциирующего реагента [9]. Получаемый индекс зависит от антигена, разведения сыворотки и режима обработки, поэтому его границы необходимо оценивать для конкретной тест-системы [10].

Исследования токсокароза подтверждают потенциальную пользу определения авидности, но не предлагают единой шкалы для всех тестов. Одни авторы использовали границу около 40%, другие сопоставляли относительную авидность с предполагаемой длительностью инвазии, третьи предложили раздельные пороги для поддержки и исключения активного токсокароза [11–13]. Сохранение низких и пограничных значений на протяжении нескольких лет, описанное в одной из работ, ограничивает интерпретацию низкой авидности как признака недавнего заражения [14]. Таким образом, дополнительная характеристика связывания антител возможна, но ее клиническое значение требует независимой проверки.

Для серологического обследования взрослых важно сопоставить ИА с выраженностью положительного IgGрезультата. Отдельного рассмотрения требуют образцы, в которых оптическая плотность (ОП) после обработки денатурирующим раствором (ДР) превышает ОП парной лунки без ДР. Причину такого увеличения сигнала нельзя установить только по рассчитанному индексу.

Цель исследования — охарактеризовать распределение индекса авидности IgG к T. canis у серопозитивных взрослых, обследованных в Алматы в 2026 г., оценить его связь с выраженностью положительной реакции в ИФА и особенности изменения ОП после денатурирующей обработки. Исследование направлено на применение авидностного анализа к серологической выборке и оценку границ интерпретации полученных результатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено поперечное серологическое исследование взрослых добровольцев, обследованных в Алматы, Казахстан, в апреле-мае 2026 г. Отбор венозной крови осуществляли медицинские специалисты ТОО «Fenix Med» (Алматы, Казахстан), лабораторные исследования выполняли в ТОО «Научно-исследовательский производственный центр „MVA GROUP“» (Алматинская область, Казахстан). Формировали последовательную удобную выборку (convenience sample): всех соответствовавших критериям лиц, обратившихся в пункт сбора и согласившихся участвовать, включали до достижения целевого объема 500 человек. Выборку не рассматривали как случайную или репрезентативную для всего взрослого населения Алматы.

Критерии включения: возраст ≥18 лет, проживание в Алматы, письменное информированное согласие, заполненная анкета, пригодный для анализа образец венозной крови, отсутствие приема антигельминтных препаратов в течение предшествующих трех месяцев. Критерии исключения: возраст младше 18 лет, неспособность или отказ дать информированное согласие, наличие противопоказаний к венепункции, отзыв согласия, неполная анкета или заполненная непригодным образцом. Отдельных критериев исключения по наличию в анамнезе других гельминтозов, аллергических или аутоиммунных заболеваний, иммунодефицитных состояний либо беременности не применяли, поскольку исследование не было клиническим диагностическим исследованием. Венозную кровь (5–7 мл) брали в вакуумные пробирки с активатором свертывания; после 20–30 мин свертывания образцы центрифугировали при 1500–2000 × g в течение 10 мин. Сыворотку транспортировали при 2–8 °C, разделяли на аликвоты и хранили при –20 °C. Образцы с выраженным гемолизом, липемией, видимой контаминацией или недостаточным объемом не анализировали; повторного замораживания и оттаивания по возможности избегали.

Анкета включала следующие пункты: возраст, пол, место проживания, контакт с животными (в том числе с собаками и кошками), наличие дачи, огорода или частного дома, источники питьевой воды, употребление сырого или недостаточно обработанного мяса, употребление недостаточно вымытых овощей и фруктов, а также рыбалку и охоту. Возраст для описательных и вторичных сравнений группировали как 18–29, 30–44, 45–59, 60–74 и ≥75 лет. Клинические симптомы, эозинофилию, общий IgE, сопутствующие заболевания и беременность не использовали как критерии клинической классификации авидностных результатов. Связи ИА с анкетными факторами не являлись основной задачей исследования.

Основным показателем был индекс авидности (ИА) в IgG-положительных образцах; частота обнаружения IgG служила характеристикой обследованной группы. Авидностное исследование планировали для всех IgGположительных сывороток; для анализа ИА включали образцы только при наличии достаточного объема материала, двух валидных парных измерений и ненулевого значения ОП в варианте без денатурирующей обработки. Долю серопозитивных участников рассчитывали от общего числа обследованных, распределение ИА — от числа положительных образцов, прошедших контроль качества парной постановки.

Определение IgG к Toxocara canis

Антитела определяли непрямым твердофазным ИФА с использованием экспериментальной тест-системы «Токсокара-IgG-Human-ELISA–MVA GROUP» (MVA GROUP, Казахстан). Базовая конфигурация теста соответствовала ранее описанной экспериментальной платформе [4]. Нативный антигенный экстракт T. canis фракционировали методом гель-фильтрации. Рабочую фракцию 20–22 кДа контролировали электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) на оборудовании Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA), сопоставляя подвижность белков со стандартными маркерами молекулярной массы. Фракцию иммобилизовали на 96-луночных полистироловых планшетах с высокой сорбционной емкостью при нагрузке 100 мкг антигена на планшет; отдельный этап блокирования не применяли.

Сыворотки исследовали в дубликатах при конечном разведении 1 : 5: к 80 мкл разводящего буфера добавляли 20 мкл сыворотки. После инкубации в течение 30 мин при 37 °C планшет пятикратно промывали фосфатно-солевым буфером с Tween-20. Вносили конъюгат антител против IgG человека с пероксидазой хрена в разведении 1 : 30 000 и инкубировали 30 мин при 37 °C. После пяти промываний добавляли субстрат 3,3′,5,5′-тетраметилбензидин (ТМБ), развивали окраску 15 мин при 20–25 °C в темноте и останавливали реакцию 0,9 М серной кислотой. ОП измеряли при 450 нм с референсной длиной волны 630 нм на микропланшетном фотометре BIOBASE (BIOBASE Group, Цзинань, Китай); для инкубации и промывания использовали термостат и промыватель планшетов того же производителя. 

Каждая постановка включала положительный и отрицательный контроли и лунки с реагентами без сыворотки для контроля фона. Постановку принимали при средней ОП отрицательного контроля ≤ 0,20 и положительного контроля ≥ 0,60. Порог положительности равнялся средней ОП отрицательного контроля плюс 0,200; образец считали положительным, если его ОП была не ниже этого порога. Разведение 1 : 5 и прибавка 0,200 были выбраны на этапе предварительной оптимизации по разделению сигналов положительных и отрицательных сывороток, уровню фоновой ОП и повторяемости и являлись внутренними рабочими параметрами экспериментальной системы, а не универсальными диагностическими порогами. В настоящей выборке диагностическую чувствительность и специфичность независимо не оценивали; результаты ИФА трактовали как серологические находки, а не как подтвержденный клинический диагноз.

Для межгруппового анализа сохраняли категории лабораторного реестра «слабоположительный», «положительный» и «резкоположительный». Они характеризовали выраженность положительного результата ИФА и не являлись измеренной концентрацией антител. Анализ этих порядковых категорий не заменял количественное определение IgG.

Определение авидности и контроль воспроизводимости

Авидность оценивали в парном формате при конечном разведении сыворотки 1 : 100 в обоих вариантах. Для этого к 90 мкл разводящего буфера добавляли 10 мкл сыворотки, предварительно разведенной как 1 : 10. Каждый вариант выполняли в дубликатах. Разведение 1 : 100 использовали только в авидностной модификации; его выбрали в предварительных постановках для уменьшения риска насыщения сигнала и получения сопоставимых ОП в паре обработанная/необработанная лунка. Поэтому числитель и знаменатель ИА получали при одинаковом разведении 1 : 100, отдельно от скринингового ИФА 1 : 5.

После 30-минутной инкубации при 37 °C и трех промываний в один вариант вносили по 100 мкл денатурирующего раствора (ДР), содержащего 6,0 М мочевину. Парный вариант не подвергали дополнительной денатурирующей обработке. Оба варианта выдерживали 10 мин при 20–25 °C. Затем выполняли два промывания, инкубацию с конъюгатом и последующие этапы детекции в одинаковых условиях. Обозначение «без ДР» относится к отсутствию дополнительной обработки мочевиной на этом этапе.

Рабочие условия подбирали на контрольных сыворотках с предполагаемо низкой и высокой авидностью, по 10 образцов в каждой группе. Контрольные сыворотки разделяли на аликвоты, хранили при –20 °C и использовали с минимизацией повторных циклов замораживания– оттаивания. Сравнивали 4,0, 6,0 и 8,0 М мочевину при экспозиции 10 мин и 20–25 °C. Для 6,0 М мочевины дополнительно сравнивали 5, 10 и 15 мин при 20–25 °C и 10 мин при 37 °C. Оценивали разделение распределений ИА, сохранение сигнала в высокоавидной группе и воспроизводимость. Эти контроли характеризовали устойчивость связывания в тесте и не использовались как группы с независимо установленной давностью заражения.

Воспроизводимость дополнительно характеризовали на трех контрольных уровнях авидности. Внутрисерийную вариабельность оценивали по повторным измерениям в одной постановке, межсерийную — по отдельным постановкам. CV пересчитывали по приведенным в лабораторной сводке средним значениям и стандартным отклонениям: CV (%) = SD / среднее × 100. Эти показатели характеризуют повторяемость измерения, но сами по себе не устанавливают клиническую диагностическую точность теста.

Расчет индекса и правила интерпретации

Индекс авидности рассчитывали по формуле:

              ИА (%) = (ОП_ДР / ОП_безДР) × 100,

где ОП_ДР — оптическая плотность в лунке с денатурирующим раствором, ОП_безДР — оптическая плотность в парной лунке без денатурирующего раствора.

В расчете использовали зарегистрированные в лабораторной таблице значения ОП; при статистическом пересчете дополнительную фоновую поправку не вводили. Отдельный нижний порог ОП без ДР для включения в расчет ИА не применяли. Для всех положительных образцов проверяли наличие обоих измерений и ненулевого знаменателя; отрицательные по IgG образцы в анализ авидности не включали.

Основной анализ включал непрерывное распределение ИА. Для его наглядного описания использовали неперекрывающиеся интервалы: 0–<20%, 20–<40%, 40–<60%, 60–<80%, 80–100%, >100–140% и >140%. Первые два интервала объединяли при обсуждении значений < 40%. Эти интервалы служили описанию данных и не рассматривались как валидированные критерии острого процесса, повторного заражения или выздоровления.

Значения > 100% сохраняли в исходном виде и учитывали отдельно. Операционно они означали, что ОП_ДР > ОП_безДР. Для оценки влияния таких наблюдений дополнительно рассчитывали медиану и межквартильный интервал среди образцов с ИА ≤ 100%.

Статистический анализ

Доли представляли как число наблюдений и процент, 95%-е доверительные интервалы (ДИ) рассчитывали методом Уилсона. Для ИА приводили медиану (Me), первый и третий квартили (Q₁ и Q₃; соответственно 25-й и 75-й процентили), а также минимум и максимум; среднее и стандартное отклонение (SD, standard deviation) использовали дополнительно. Запись Me [Q₁–Q₃] обозначает медиану и межквартильный интервал. Распределения ИА в трех категориях ИФА сравнивали критерием Краскела–Уоллиса; H обозначает статистику этого критерия. Сравнение было общим, попарные проверки и тест линейной корреляции не проводили. Демографические и анкетные показатели представляли описательно как абсолютные и относительные частоты; их связь с ИА отдельно не оценивали. Все тесты были двусторонними, порог статистической значимости составлял 0,05. Расчеты выполнены в Python 3.12.14 с библиотеками NumPy 2.3.5 и SciPy 1.17.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследованная группа и полнота авидностного анализа

В анализ были включены 500 взрослых: 329 женщин (65,8%) и 171 мужчина (34,2%). Средний возраст составил 41,3 года, SD — 15,5 года; диапазон — 18–82 года. IgG к антигену T. canis выявлены у 93 участников: 18,6% (95% ДИ 15,4–22,2%). Все 93 положительных образца имели парные значения ОП и вошли в авидностный анализ; исключенных из этой подвыборки из-за отсутствия одного из измерений не было. ОП без ДР составляла 0,407–2,234, нулевые знаменатели отсутствовали.

Сведения о числе приглашенных, отказавшихся и исключенных до формирования итоговой выборки были недоступны для настоящего анализа. Распределение пола и возраста внутри серопозитивной подвыборки и связи ИА с анкетными факторами не оценивали.

Выбор условий денатурации и вариабельность измерений

При подборе условий 4,0 М мочевина недостаточно разделяла контрольные группы, а 8,0 М существенно снижала ИА и у высокоавидных сывороток. Для последующего анализа выбрали 6,0 М мочевину с экспозицией 10 мин при 20–25 °C. При этом режиме диапазоны ИА в двух контрольных группах не перекрывались; увеличение времени или температуры обработки снижало значения в высокоавидной группе (табл. 1).

Внутрисерийные CV составили 4,9–8,3%, межсерийные — 7,4–13,0% (табл. 2). Наибольшая относительная вариабельность между постановками отмечена для низкоавидного контроля.

Распределение индекса авидности

Медиана ИА составила 79,2% [52,7–90,7], диапазон — 8,9–230,2%. Среднее значение равнялось 77,9%, SD — 32,7 процентного пункта. Наиболее частым отдельным интервалом был интервал 80–100%, однако он не охватывал большинства наблюдений. Значения < 40% встречались редко; заметную часть распределения составляли образцы с ИА 40–<80% (табл. 3).

Авидность при различной выраженности положительного результата ИФА

Распределения ИА различались между тремя категориями ИФА (H = 20,97; число степеней свободы — 2; p < 0,001). Медиана ИА была ниже в резко положительной группе, а межквартильные интервалы слабоположительной и положительной групп существенно перекрывались (табл. 4). Общее сравнение не устанавливает статистическую значимость каждой пары групп. Полученные результаты не показали последовательного увеличения ИА при более выраженном положительном результате ИФА.

Значения индекса авидности выше 100%

В 12 образцах (12,9%; 95% ДИ 7,5–21,2%) ОП с ДР превышала ОП без ДР; ИА составлял 108,9–230,2%. Увеличение ОП находилось в пределах 0,116–0,919, медиана разности равнялась 0,311. ОП без ДР в этой группе составляла 0,518–1,996, поэтому все превышения нельзя объяснить исключительно малым знаменателем. Парные измерения представлены на рисунке (рисунок). При отдельном рассмотрении 81 образца с ИА ≤ 100% медиана составила 71,8% [50,4–88,6]; следовательно, включение значений > 100% заметно влияло на итоговую характеристику распределения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты показывают неоднородность авидности IgG у серопозитивных взрослых Алматы. Выраженность положительного результата ИФА не сопровождалась последовательным увеличением ИА. Определение авидности поэтому дополняет характеристику антител, однако само по себе не устанавливает активный токсокароз. Длительное сохранение IgG после лечения описано у детей [7]; эта работа поддерживает осторожную интерпретацию положительного результата, но сроки изменения антител у взрослых требуют самостоятельной оценки.

Клинические исследования связывают высокую авидность с длительным течением инвазии [11, 12, 15], хотя диагностические пороги и информативность тестов неодинаковы. По некоторым данным, для ИА < 32% получена чувствительность 64,3% и специфичность 96,9% в отношении активного токсокароза; при этом высокий ИА встречался и у пациента с активной инфекцией [13]. Другие авторы наблюдали низкие или пограничные значения в течение 2–3 лет [14]. Есть также сообщения о влиянии клинического состава групп и выбранных границ ИА [16, 17]. Поэтому долю образцов с ИА < 40% в нашей выборке нельзя отождествлять с долей недавно заразившихся.

Динамика авидности зависит от исследуемой модели: у мышей ИА увеличивался в ходе инфекции [18, 19], а у кроликов высокая авидность появлялась уже при ранней сероконверсии [20]. Преимущественно высокая авидность описана у беременных и лиц старше 50 лет [21, 22]. При сопоставлении результатов необходимо учитывать состав выборки и антиген. Диагностическое значение выбора низкомолекулярных фракций было показано в ранней работе по иммуноблоту [23], а последующая оценка рекомбинантных белков подтвердила влияние антигенного состава на выявление антител [24].

Более низкую медиану ИА в резко положительной группе нельзя объяснять исключительно зрелостью иммунного ответа. ОП без ДР входит в знаменатель формулы, а концентрация антител и нелинейность измерения способны влиять на рассчитанное отношение [25]. Воспроизводимость авидностного ИФА оценивали после подбора разведения, обеспечивавшего ОП 0,5–1,3 [26].

Этот диапазон не является универсальным для других антигенов, но показывает значение контроля исходного сигнала. Для нашей системы необходимо проверить устойчивость межгрупповых различий при нескольких разведениях сывороток.

Значения ИА > 100% отражают увеличение регистрируемой ОП после обработки и не доказывают повышенную прочность связывания. Их нельзя заранее считать подтвержденными ошибками измерения. Так, при работе на системе вируса простого герпеса типа 1 (HSV-1) результат зависел от способа воздействия мочевины; необходимость стандартизации авидностного ИФА отмечена и в другой методической работе [10, 27]. Ранние исследования обнаружения циркулирующих антигенов и иммунных комплексов при токсокарозе [28, 29] описывают возможный биологический контекст, но не подтверждают причину увеличения ОП в нашей системе. Для ее установления нужны повторные парные измерения и отдельная проверка влияния фона, разведения и денатурирующей обработки.

Наши внутрисерийные CV по величине сопоставимы с CV 8%, описанным для авидностного ИФА к белку S SARSCoV-2 при обработке 7 М мочевиной [30]. Есть сообщение о CV <10% при измерении авидности в заранее выбранном диапазоне ОП [26]. Это методические ориентиры, а не доказательство эквивалентности тестов: использованы другие антигены, режимы обработки и способы расчета авидности. Межсерийная вариабельность низкоавидного контроля в нашей работе была выше. Полученное распределение характеризует антительный ответ обследованных взрослых, но не устанавливает клиническую стадию инфекции. Дальнейшая оценка должна включать повторные парные измерения, проверку значений >100% и сопоставление с клиническими данными. Подтверждение специфичности положительного ИФА отдельным методом также сохраняет значение, поскольку определение авидности не исключает перекрестного связывания [6, 14].

ВЫВОДЫ

Среди 500 взрослых, обследованных в Алматы в 2026 г., IgG к антигену T. canis выявлены у 93 человек (18,6%). Авидностный анализ 93 образцов с доступными парными значениями ОП продемонстрировал широкий диапазон ИА и существенную неоднородность серопозитивного материала. Наиболее частым отдельным интервалом был интервал 80–100%, однако он не составлял большинства наблюдений. Более выраженная положительная реакция в ИФА не сопровождалась увеличением индекса авидности. Полученное различие требует дальнейшей проверки с учетом зависимости расчетного индекса от исходного сигнала. Результаты > 100%, обнаруженные в 12,9% проанализированных образцов, следует сохранять отдельно и проверять повторно; их биологический механизм в данной работе не установлен. Применение авидностного ИФА с фракцией 20–22 кДа расширяет описание гуморального ответа к Toxocara. Для сопоставления исследований необходимы согласованные условия анализа и прозрачное представление исходных измерений. Использование ИА для определения давности или активности токсокароза требует самостоятельного клинического подтверждения.