Оригинальное исследование Нокаут мутантного ТР53 в клетках линии HaCaT усиливает их миграционную активность
П. М. Кожин, Д. Д. Ромашин, А. Л. Русанов, Н. Г. Лузгина
Линия HaCaT — спонтанно иммортализованные неканцерогенные кератиноциты человека, широко используемые в качестве модели для изучения функций нормальных кератиноцитов человека. В геноме клеток HaCaT присутствуют две аллели гена TP53, которые содержат две gain-of-function (GOV) мутации, приобретенные в результате спонтанной иммортализации (mutTP53). Наличие мутаций приводит к увеличению скорости пролиферации и нарушению программы стратификации. Целью исследования было изучить влияние нокаута гена mutTР53 на способность кератиноцитов линии HaCaT к пролиферации и миграции в модели повреждения и регенерации эпидермиса in vitro (скретч-тест), а также на способность формировать многослойный эпителий в органотипической модели эпидермиса. Для проведения скретч-теста клетки культивировали до образования монослоя, затем наносили стандартизованное повреждение. Органотипическую модель получали культивированием кератиноцитов в поликарбонатных мембранных вставках с диаметром пор 0,4 мкм на границе раздела фаз (воздух-жидкость). Продемонстрировано, что нокаут мутантного гена TP53 приводит к увеличению миграционной способности кератиноцитов линии HaCaT: для HaCaT с нокаутом mutTP53 закрытие дефекта происходило быстрее по сравнению с соответствующей группой WT HaCaT (p < 0,05), на третьи сутки размер дефекта составлял 12% ± 3% и 66% ± 5% от первоначального. Получены данные, что мутантный TP53 в клетках HaCaT является негативным регулятором экспрессии ламинина-5 (экспрессия LAMC2 была выше в клетках с нокаутом mutTP53 в 9,96 ± 1,92 раз, p < 0,05), однако это не способствует нормализации программы дифференцировки и стратификации эпителия с образованием рогового слоя в органотипической модели.
Статья получена: 12.12.2022
Опубликовано online: 30.12.2022
DOI: 10.24075/vrgmu.2022.070
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 2694
Оригинальное исследование Подход к разработке пролекарства на основе Амикумацина А
В. И. Шмыгарев, Ю. А. Прокопенко, С. С. Терехов, М. Ю. Захарова, М. А. Дубинный, И. В. Смирнов, И. В. Ямпольский, А. С. Царькова
Современная коронавирусная болезнь COVID-19, вызываемая вирусом SARS-CoV-2, характеризуется высокой контагиозностью и тяжелым течением. Оказание помощи пациентам с COVID-19 требует разработки новых видов противовирусных препаратов. Цель работы — разработать пролекарство для лечения коронавирусной болезни с применением антибиотика Амикумацин A (Ami), механизм действия которого основан на ингибировании трансляции. Ферментативный гидролиз инактивированного пролекарства основной протеазой SARS-CoV-2 может привести к высвобождению активной молекулы Ami и как следствие к подавлению биосинтеза белка в инфицированных клетках. Для проверки предложенной гипотезы был осуществлен пятистадийный синтез инактивированного аналога Амикумацина А, in vitro тестирование которого с рекомбинантной протеазой MPro SARS-CoV-2 показало низкий процент гидролиза. Дальнейшая оптимизация пептидного фрагмента инактивированного аналога, распознаваемого протеазой MPro SARS-CoV-2, возможно, приведет к повышению протеолиза и высвобождению Амикумацина А.
Статья получена: 15.11.2022
Опубликовано online: 30.12.2022
DOI: 10.24075/vrgmu.2022.073
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 2460
Оригинальное исследование Влияние различных доз мРНК-ЛНЧ-вакцин на нейровоспаление у BALB/c мышей
А. С. Киршина, А. А. Казакова, Е. С. Колосова, Е. А. Имашева, О. О. Васильева, О. В. Заборова, И. М. Теренин, А. Р. Муслимов, В. В. Решетников
Доказана высокая эффективность мРНК-вакцин в борьбе с эпидемией COVID-19, продемонстрирована низкая частота развития побочных эффектов. Тем не менее существует еще много пробелов в нашем понимании биологии и биобезопасности нуклеиновых кислот в составе липидных наночастиц (ЛНЧ), наиболее часто используемых в качестве системы внутриклеточной доставки вакцин на основе мРНК . Известно, что ЛНЧ приводят к сильному воспалительному ответу в месте введения, имеют широкий профиль биораспределения и обнаруживаются после введения во многих тканях организма, в том числе в головном мозге. Роль новых препаратов с такой фармакокинетикой в воспалительных процессах, развивающихся в забарьерных органах изучена недостаточно. Целью исследования было оценить влияние различных доз мРНК-ЛНЧ, экспрессирующих репортерный белок (0, 5, 10 и 20 мкг мРНК, кодирующей люциферазу светлячка) на экспрессию маркеров нейровоспаления (Tnfα, Il1β, Gfap, Aif1) в префронтальной коре и гипоталамусе лабораторных животных через 4, 8 и 30 ч после внутримышечной инъекции наноэмульсии ЛНЧ. Показано, что мРНК-ЛНЧ-вакцины в дозе 10–20 мкг мРНК способны усиливать экспрессию Aif1 в гипоталамусе через 8 ч после вакцинации, но через 30 ч эти различия не определялись. Обнаружено, что уровень экспрессии Gfap, l11β, Tnfα в экспериментальных группах различался в различных временных точках в гипоталамусе. Согласно полученным результатам, введенные парентерально мРНК-ЛНЧ могут стимулировать временную активацию микроглии в определенных временных промежутках дозо- и регион-зависимым образом.
Статья получена: 01.12.2022
Опубликовано online: 30.12.2022
DOI: 10.24075/vrgmu.2022.068
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 3175
Оригинальное исследование Особенности профиля аминокислот в моноцитах при раке молочной железы
А. В. Новоселова, М. Н. Юшина, М. Р. Патышева, Е. А. Простакишина, О. Д. Брагина, Е. Ю. Гарбуков, Ю. Г. Кжышковска
Моноциты — крупные циркулирующие в крови лейкоциты, которые во взрослом организме являются основными предшественниками тканевых макрофагов, а также опухоле-ассоциированных макрофагов. Различные типы моноцитов имеют разнонаправленное действие в отношении роста и метастатического распространения раковых клеток, как активируют, так и подавляют данные процессы. Опухолевая прогрессия связана с запуском целого каскада воспалительных и иммунных реакций. Данные патологические процессы ассоциированы с изменением содержания аминокислот в составе моноцитов, что может привести к нарушению их функции, в частности миграции, деления и созревания. Целью работы было профилировать аминокислоты моноцитов с последующим изучением особенностей аминокислотного состава моноцитов пациентов с раком молочной железы при помощи жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией. Статистически значимые различия уровней метаболитов в моноцитах пациентов с раком молочной железы и моноцитов здоровых доноров обнаружены для глицина (p-value = 0,0127), аспарагина (p-value = 0,0197), пролина (p-value = 0,0159), метионина (p-value = 0,0357), триптофана (p-value = 0,0028), тирозина (p-value = 0,0127). В результате биоинформатического анализа метаболических путей с участием задействованных аминокислот были определены биологические сети, которые потенциально могут вовлекаться в изменение фенотипа моноцитов под воздействием РМЖ. Разработаны математические модели, построенные на комбинации аминокислот, обладающие 100% чувствительностью и специфичностью. Выявлены особенности метаболизма клеток иммунной системы при РМЖ и предложены потенциальные диагностические биомаркеры.
Статья получена: 08.12.2022
Опубликовано online: 28.12.2022
DOI: 10.24075/vrgmu.2022.064
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 3011
Оригинальное исследование Мутационные основы формирования устойчивости к меропенему у Pseudomonas aeruginosa
И. В. Чеботарь, Ю. А. Бочарова, А. В. Чаплин, Т. А. Савинова, Ю. А. Василиадис, Н. А. Маянский
Резистентные к карбапенемам штаммы Pseudomonas aeruginosa расценивают в качестве критически опасных патогенов первого уровня приоритета. Расшифровка механизмов формирования устойчивости к карбапенемам является актуальной задачей современной медицинской науки. Целью работы было описать разнообразие и закрепление мутаций, ассоциированных с формированием карбапенемрезистентности в процессе адаптации P. aeruginosa к повышающимся концентрациям меропенема. Объектами исследования были изоляты P. aeruginosa, полученные при росте референтного штамма P. aeruginosa ATCC 27853 в градиенте возрастающих концентраций меропенема. Оценку чувствительности изолятов к меропенему выполняли при помощи е-тестов (эпсилометрический метод) с меропенемом и при помощи метода дилюции антибиотика в агаре. Геномы изолятов были секвенированы на полногеномном секвенаторе MGISEQ-2000. Полученные результаты показали, что формирование высоких уровней резистентности к меропенему у P. aeruginosa в эксперименте происходит в короткие сроки (6 суток). Эволюция резистентности сопряжена с процессом клонирования, при котором происходит возникновение множества клонов с различными генотипами. Основой клонирования является мутагенез, в который вовлечены 11 генов, включая oprD, pbuE, nalD, nalC, spoT, mlaA, mexD, mexR, oprM, mraY, pbp3. Часть образовавшихся клонов, независимо от уровня их резистентности к меропенему, не получают прогрессивного развития и вытесняются более успешными клонами.
Статья получена: 25.11.2022
Опубликовано online: 28.12.2022
DOI: 10.24075/vrgmu.2022.063
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 2482
Мнение Стратегии дизайна лекарственных препаратов для лечения коронавирусной инфекции
С. С. Терехов, В. И. Шмыгарев, К. В. Пуртов, И. В. Смирнов, И. В. Ямпольский, А. С. Царькова
Возрастающие с каждым годом численность и плотность человеческой популяции приводит к увеличивающемуся риску распространения инфекционных заболеваний, что грозит возникновением все новых эпидемий по всему миру. Широкое использование вакцинации снизило заболеваемость и смертность, связанные с вирусными инфекциями, а в некоторых случаях полностью уничтожило вирус среди населения. К сожалению, некоторые виды вирусов сохраняют способность к быстрой мутации и таким образом ускользают от вызванного вакциной иммунного ответа. В связи с этим для лечения и профилактики вирусных заболеваний требуются новые противовирусные препараты. Современные исследования в области структур и свойств вирусных протеаз, имеющих ключевое значение в жизненном цикле вирусов, позволяют, на наш взгляд, превратить эти ферменты в перспективные мишени для разработки эффективных методов борьбы с вирусными заболеваниями.
Статья получена: 05.12.2022
Опубликовано online: 28.12.2022
DOI: 10.24075/vrgmu.2022.067
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 2287
Оригинальное исследование Роль кластерина в прогнозировании развития ранней и поздней преэклампсии в первом триместре беременности
А. В. Тимофеева, И. С. Федоров, А. М. Тарасова, К. А. Горина, Ю. В. Сухова, В. А. Гусар, Т. Ю. Иванец
Преэклампсия (ПЭ) встречается в 2–8% беременностей, является одной из важнейших причин материнской и перинатальной заболеваемости и смертности. На сегодняшний день нет используемых в клинической практике тест-систем, позволяющих с высокой точностью прогнозировать на 11–14-й неделе беременности ранний дебют ПЭ (с 20-й по 34-ю неделю) или поздний дебют ПЭ (после 34-й недели). Целью исследования было оценить возможности использования количественного определения секреторной формы кластерина в прогнозировании развития ранней и поздней ПЭ в первом триместре беременности. Выбор данного белка обусловлен специфичностью его экспрессии для клеток цитотрофобласта, синцитиотрофобласта и внеклеточного трофобласта, а также доказанным негативным влиянием кластерина на инвазивные свойства трофобластных клеток и гестационные преобразования сосудов матки, играющих ключевую роль в патогенезе ПЭ. В исследование включены 40 беременных в возрасте от 27–40 лет, проходивших комплексное скрининговое обследование в первом триместре беременности. Методом Вестерн-блоттинга обнаружено значимое повышение уровня секреторного кластерина (40 кДа) в сыворотке крови беременных в случае развития ПЭ относительно физиологической беременности: при ранней ПЭ — двукратное увеличение уровня кластерина в везикулярной и вневезикулярной фракции сыворотки крови (р = 0,03 и р = 0,004 соответственно), при поздней ПЭ — трехкратное увеличение только во вневезикулярной фракции сыворотки крови (р = 0,002). Согласно моделям логистической регрессии уровень секреторного кластерина во вневезикулярной фракции сыворотки крови беременных в первом триместре обладает прогностической значимостью при оценке вероятности развития ранней ПЭ (AUC = 0,97, Se = 1, Sp = 0,875, cutoff = 0,3877) и поздней ПЭ (AUC =  1, Se = 1, Sp = 1, cutoff = 0,5).
Статья получена: 23.11.2022
Опубликовано online: 28.12.2022
DOI: 10.24075/vrgmu.2022.061
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 2413
Оригинальное исследование Трансгенные мыши для изучения киназа-независимых механизмов действия циклин-зависимых киназ CDK8/19
Н. И. Ставская, Л. А. Ильчук, Ю. Д. Окулова, М. В. Кубекина, Е. А. Варламова, Ю. Ю. Силаева, А. В. Брутер
Циклин-зависимая транскрипционная киназа CDK8 и ее менее изученный паралог CDK19 регулируют экспрессию зависимых генов посредством нескольких механизмов. CDK8/19 могут напрямую фосфорилировать некоторые транскрипционные факторы (ICN, STAT1), но в то же время в составе медиаторного комплекса эти киназы регулируют транскрипцию за счет взаимодействия с хроматином в области промоторов и энхансеров соответствующих генов. В последнее время появляются работы, демонстрирующие путем сравнения эффектов генетической инактивации и химического ингибирования киназной активности наличие у CDK8/19 киназа-независимых механизмов действия. Целью работы  было получить трансгенных мышей, способных к индуцируемой и тканеспецифичной экспрессии киназнонегативной (лишенной фосфорилирующей активности) формы CDK8 — CDK8(D173A), которых впоследствии можно будет использовать для изучения киназа-независимых механизмов действия CDK8 in vivo. Методом случайного трансгенеза в результате микроинъекций линейной ДНК в пронуклеус нами получены четыре трансгенных особи F0, две из которых стали родоначальниками отдельных линий. Для всех F0 и полученных линий измерена копийность интегрировавшейся конструкции. Данная модель может быть использована для изучения киназа-независимых свойств белков CDK8/19.
Статья получена: 22.11.2022
Опубликовано online: 28.12.2022
DOI: 10.24075/vrgmu.2022.066
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 2650