Оригинальное исследование Энтеровирусы человека проявляют избирательную онколитическую активность на модели ксенотрансплантатов мультиформной глиобластомы человека в иммунодефицитных мышах
А. О. Желтухин, А. В. Соболева, А. О. Сосновцева, Т. Х. Ле, Г. В. Ильинская, Д. В. Кочетков, А. В. Липатова, П. М. Чумаков
Основным источником возникновения рецидивов мультиформной глиобластомы после хирургического вмешательства являются стволовые клетки, успевающие проникнуть глубоко в ткани мозга. В настоящее время актуален поиск новых подходов для борьбы с ними, в том числе с помощью онколитических вирусов. Целью работы было определение чувствительности к непатогенным энтеровирусам клеток мультиформной глиобластомы человека, поддерживаемых in vitro и в модели мышиных ксенотрансплантатов. Культуры опухолевых клеток глиобластом испытывали на чувствительность к полиовирусу 1 типа (штамм вакцины Сэбина), вирусу Коксаки A7 (штамм ЖЭВ8), Коксаки A9 (штамм ЖЭВ9) и Коксаки B5 (Штамм ЖЭВ12). Количественную оценку репродукции вирусов и их цитолитическую активность проводили заражением монослойных культур клеток глиобластомы. Эффективность уничтожения стволовых клеток глиобластомы определяли по способности клеточных культур глиобластом, обогащенных опухолевыми стволовыми клетками, формировать подкожные опухоли у иммунодефицитных мышей после обработки вирусами. По результатам исследования наиболее выраженная онколитическая и репликационная активность выявлена у вируса Коксаки A7 и полиовируса 1 типа при тестировании в модели культур клеток глиобластом, инфицированных вирусами in vitro, а также in vivo, в модели подкожных опухолевых ксенотрансплантатов на иммунодефицитных мышах. Полиовирус 1 типа и вирус Коксакси A7 предотвращали образование опухолей после того как нейросферные культуры клеток глиобластом преинкубировали с вирусами перед подкожным введением. Вирус Коксаки В5 вызывал лишь частичное сокращение числа опухолей, а Коксаки A9 не влиял на опухолеобразование. Таким образом, ряд штаммов непатогенных энтеровирусов способен уничтожать стволовые клетки глиобластом и представляется перспективным при разработке терапевтических средств для безрецидивного лечения глиобластом.
Статья получена: 26.06.2018
Опубликовано online: 13.07.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.026
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 5130
Оригинальное исследование Изменения чувствительности клеток глиобластом человека к онколитическим энтеровирусам при пассировании в культуре
А. В. Соболева, А. В. Липатова, Д. В. Кочетков, П. М. Чумаков
Современная терапия мультиформных глиобластом не приводит к излечению пациентов. В качестве альтернативы перспективны онколитические вирусы (ОВ): они способны уничтожать опухолевые стволовые клетки, источники рецидивов. Однако каждый отдельный штамм ОВ эффективен только в ряде случаев. Для подбора подходящего штамма требуется тестирование чувствительности на живых опухолевых клетках пациента. Целью исследования было изучение изменения чувствительности к вирусам в процессе пассирования опухолевых клеток пациента в культуре. Органные и первичные культуры клеток глиобластом получали из операционного материала больных. Проводили сравнение чувствительности к четырем штаммам непатогенных энтеровирусов (вакцинный штамм полиовируса 1 типа, вирус Коксаки А7, Эховирусы 1 и 12) на первичных культурах, и на клетках, прошедших около 700 удвоений при пассировании. Чувствительность к вирусам оценивали по измерению доли жизнеспособных клеток с помощью МТТ теста через 72 ч после заражения серийными десятикратными разведениями вирусных препаратов. Клетки каждого из четырех пациентов имели строго индивидуальные спектры чувствительности к испытанным вирусным штаммам. Различия в минимальной инфекционной дозе, необходимой для заражения культур, составляли до 105. При пассировании происходили изменения в чувствительности, которые могли приводить к повышению чувствительности к одному вирусу, и понижению — к другому. Различия в чувствительности коррелировали со способностью зараженных клеток продуцировать инфекционный вирус. На основании полученных данных можно заключить, что испытание индивидуальной чувствительности опухолевых клеток пациентов следует проводить на как можно более ранних этапах пассирования, предпочтительно — на первичных культурах.
Статья получена: 16.06.2018
Опубликовано online: 08.07.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.025
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 5086
Оригинальное исследование Консервативность последовательностей генов помпы множественной лекарственной устойчивости AcrAB-TolC Escherichia coli как признак вовлеченности в перманентную «уборку» бактериальной клетки
М. В. Каракозова, П. А. Назаров
Помпы множественной лекарственной устойчивсти (МЛУ) помогают бактериям защищаться от неблагоприятного воздействия окружающей среды. Считается, что гены, кодирующие помпы МЛУ, вариабельны и относятся к так называемым генам «роскоши», т. е. предназначены для адаптации бактерий к изменению окружающих условий. Целью работы было проверить насколько консервативны последовательности генов помпы МЛУ. Для этого проводили анализ последовательностей белков AcrA, AcrB и TolC для различных лабораторных штаммов Escherichia coli. Методом выравнивания последовательностей было показано, что штаммы из разных стран, культивируемые в лабораториях уже долгое время, имеют удивительную консервативность последовательностей белков помпы AcrAB-TolC. Она напоминает консервативность генов «домашнего хозяйства», что, по-видимому, говорит о вовлеченности помпы МЛУ AcrAB-TolC в перманентную «уборку» клетки от различных веществ биотического и абиотического происхождения.
Статья получена: 19.02.2018
Опубликовано online: 06.07.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.024
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 5130
Оригинальное исследование Компетентность пластических хирургов
Н. Е. Мантурова, В. В. Кочубей, А. В. Кочубей
Отечественная система непрерывного медицинского образования (НМО) не гарантирует ежегодного прогресса профессиональной компетентности у всех ее участников: врачами не предоставляются отчеты о количестве и спектре проделанных операций, оценка компетентности и создание планов индивидуального обучения проводятся ими самостоятельно без участия профессионального сообщества. В этой связи актуальным является изучение компетентности пластических хирургов и объективности ее самооценки. Изучение проводили с помощью очного одноэтапного анкетирования. Анкета содержала два раздела. Первый раздел включал тесты для самооценки компетентности по 9 трудовым функциям пластического хирурга, где 1 означало, что нет опыта, 2 — новичок, 3 — специалист, 4 — знаток, 5 — эксперт. Во второй раздел входили тестовые задания закрытого типа простого одновариантного выбора для объективной оценки знаний респондентов. Правильный ответ оценивали в 1 балл, неверный — 0. В анкетировании приняли участие 162 человека. Средний возраст респондентов был 31,5 ± 6,9 года, средний стаж работы 4,0 ± 4,8 года. Для статистического анализа рассчитывали критерии Колмогорова–Смирнова, Манна–Уитни, Краскела–Уоллиса, коэффициент Спирмена, использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), тест Левена, тест Дункана. Статистически значимыми считали значения при р ˂ 0,05. По результатам значимая (р ˂ 0,001) корреляция стажа с уровнем самооценки (rs= 0,72). Средняя оценка по тестам составила исследования общий уровень самооценки всех респондентов составил 2,1 ± 0,92 балла. Обнаружена статистически 2,6 ± 1,76 баллов из 9 максимально возможных. Незначимой оказалась корреляция тестовой оценки со стажем работы (rs= – 0,08, р = 0,3) и с самооценкой (rs= – 0,006, р = 0,9).
Статья получена: 24.04.2018
Опубликовано online: 06.07.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.023
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 4634
Оригинальное исследование Экспериментальные подходы к таргетному редактированию гена CFTR с помощью CRISPR-Cas9
С. А. Смирнихина, А. А. Анучина, К. С. Кочергин-Никитский, Э. П. Адильгереева, В. Д. Якушина, А. В. Лавров
Муковисцидоз — тяжелое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутациями в гене CFTR, основной из которых в европейской популяции является F508del. Патогенетическая терапия существенно улучшила прогноз для жизни у пациентов с муковисцидозом, однако генная терапия не оказалась такой эффективной, как ожидалось. Геномное редактирование, в том числе с помощью CRISPR-Cas9, открывает новые возможности для этиотропного лечения, так как позволяет исправить мутации в клетках. Целью исследования было сравнение эффективности коррекции мутации F508del с помощью различных комбинаций направляющих РНК и Cas9 и повышение эффективности редактирования. Работу проводили на культуре клеток HEK293T, эффективность редактирования генома оценивали с помощью анализа T7E1, как на геномном, так и на плазмидном сайтах. Наиболее эффективной оказалась комбинация SaCas9 вместе с РНК на мутацию F508del — произошло редактирование 29% аллелей. Комбинация аналогичной направляющей РНК на F508del для SpCas9 показала небольшую эффективность редактирования, что связано с низкой экспрессией направляющей РНК. Были предприняты попытки увеличения экспрессии данной РНК с помощью разных подходов, однако повышения эффективности ее работы получено не было. Стабилизация направляющей РНК путем добавления в последовательность G-квадруплекса, укорочения и добавления GG в 5′-область также не принесла результатов. Вероятно, низкая эффективность работы использованной направляющей РНК обусловлена ее нуклеотидной последовательностью, что ограничивает ее использование.
Статья получена: 15.03.2018
Опубликовано online: 04.07.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.022
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 5115
Оригинальное исследование Cas13a: получение и использование для определения вирусной РНК
А. С. Савинова, Е. Ю. Коптев, Е. В. Усачев, А. П. Ткачук, В. А. Гущин
Использование CRISPR-Cas систем для редактирования геномов организмов в последнее время стало одним из магистральных научных направлений. Между тем белки системы CAS можно применять для разработки методов молекулярной диагностики. Традиционные подходы к идентификации микроорганизмов имеют ряд недостатков: они времязатратны (культуральные методы диагностики), недостаточно чувствительны (иммунологические методы), имеют высокую себестоимость и методически сложны (ПЦР, секвенирование). Целью работы было получение функционально активного препарата белка Cas13а и изучение его поведения в различных условиях, в том числе при изменении концентрации мишени, для дальнейшего использования в диагностических целях. Была создана генетическая экспрессионная конструкция, имеющая на 5'-конце T7-промотер и ген сas13a бактерии <i>Leptotrichia wadei</i>. Получены препараты функционально активной программируемой РНКазы белка Cas13a, направляющей РНК, а также РНК вируса гриппа Б (РНК-мишень). Функциональную активность РНКазы белка Cas13a определяли по появлению флуоресцентного сигнала в реакционной смеси, содержащей направляющую РНК, РНК-мишень, молекулярный РНК-маячок. Показано, что полученный препарат белка Cas13a способен специфически выявлять мишень на примере фрагментов РНК вируса гриппа Б и не обладает неспецифическими видами РНКазной активности. Данное исследование может стать основой для создания нового быстрого специфичного и чувствительного метода идентификации микроорганизмов.
Статья получена: 31.05.2018
Опубликовано online: 01.07.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.021
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 5260
Метод Алгоритм хирургического лечения больных с рассекающим остеохондритом коленного сустава
К. А. Егиазарян, Г. Д. Лазишвили, И. В. Храменкова, М. А. Шпак, Д. А. Бадриев
Наиболее часто рассекающий остеохондрит коленного сустава, или болезнь Кёнига, встречается у активных молодых людей, занятых физическим трудом, спортом, т. е. представителей социально активной прослойки населения. Несмотря на разнообразие современных методик хирургического лечения болезни, остается много спорных вопросов по их применению, отсутствует оптимальный подход и ограничена доступность качественных биоматериалов, требующихся при вмешательстве. Проведенный анализ результатов лечения пациентов за несколько лет показал высокую актуальность и необходимость решения многих вопросов этой проблемы. В работе представлен алгоритм хирургического лечения рассекающего остеохондрита коленного сустава. Обоснованы показания к оперативному вмешательству, предложены оптимальные способы коррекции локальных дефектов хряща в зависимости от стадии его поражения и возраста пациента, даны рекомендации, основанные на практическом опыте авторов.
Статья получена: 16.05.2018
Опубликовано online: 27.06.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.020
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 5876
Оригинальное исследование Поиск и анализ CRISPR-Cas системы в штамме Escherichia coli HS и детектируемых спейсерами его CRISPR-кассеты фаговых рас методами биоинформатики
Е. И. Иванова, Ю. П. Джиоев, А. Ю. Борисенко, Н. П. Перетолчина, Л. А. Степаненко, Е. В. Григорова, А. И. Парамонов, У. М. Немченко, Т. В. Туник, Е. А. Кунгурцева
CRISPR-Cas система — это иммунная система прокариот, обеспечивающая защиту от чужеродных репликонов, в первую очередь вирусов и плазмид. Устойчивость к повторным инфекциям приобретается в результате включения в состав CRISPR-кассет коротких последовательностей, или спейсеров, комплементарных участкам соответствующих вирусных или плазмидных геномов. В настоящее время эшерихиозные инфекции остаются серьезной проблемой практической медицины. Вследствие их крайней устойчивости к терапии с использованием антибиотиков необходима разработка новых подходов лечения. Целью исследования был поиск структур CRISPR-Cas систем в геномной последовательности штамма Escherichia coli HS. Использовали методы программного моделирования MacSyFinder (Macromolecular System Finder, ver. 1.0.2.). Поиск точной гомологии последовательностей осуществляли посредством установленных вспомогательных пакетов makeblastdb (ver. 2.2.28), HMMER (ver. 3.0). В результате методами биоинформатики была выявлена одна CRISPR-Cas система и расшифрованы спейсерные последовательности CRISPR-кассеты у штамма Escherichia coli HS. С помощью последовательностей спейсеров CRISPR-кассеты были определены комплементарные им протоспейсерные участки нескольких типов фагов, что позволяет оценить степень их устойчивости к этим чужеродным генетическим элементам.
Статья получена: 15.03.2018
Опубликовано online: 27.06.2018
DOI: 10.24075/vrgmu.2018.019
Комментарии 0
ПРОСМОТРЫ 4815