В качестве основных причин развития пародонтита традиционно рассматриваются генетическая предрасположенность, влияние факторов среды (таких как уровень гигиены полости рта, диета, курение, наличие ортодонтических конструкций и др.), а также бактериальная инфекция. И если в патогенезе агрессивных форм пародонтита, как принято считать, ведущую роль играет генетическая составляющая [1], то основной причиной возникновения хронического пародонтита, по мнению большинства авторов, является именно инфицирование поверхности пародонта патогенными бактериями [2, 3]. В полости рта выявлено около 700 видов микроорганизмов, однако в качестве основных пародонтопатогенов называют, как правило, виды Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythensis, Treponema denticola [4–9].

В исследовании L. Ximenez-Fyvie и соавт. [10] виды P. gingivalis, T. forsythensis и T. denticola предложено выделить в «красный комплекс» микроорганизмов, обладающих устойчивостью in vivo и in vitro. Кроме того, в глубоких пародонтальных карманах отмечена повышенная обсемененность Fusobacterium nucleatum, представителями рода Prevotella, Eikenella corrodens, Peptostreptococcus micros и Campylobacter rectus, вероятно, участвующими в развитии бактериальной инфекции.

Виды рода Prevotella рассматриваются в качестве опасных пародонтопатогенов и в исследовании N. Suzuki и соавт. [9] наряду с P. gingivalis, Bacteroides forsythus, Fusobacterium, Campylobacter и Treponema. В ряде исследований [11, 12] приводятся факты выявления на пародонте здоровых людей опасных пародонтопатогенов, хотя степень обсемененности ими у здоровых лиц в среднем оказывалась существенно ниже, чем у пациентов с пародонтитом.
В связи с этим существует необходимость анализировать не столько качественные, сколько количественные соотношения бактерий в консорциумах пародонта. В исследовании K. Torrungruang и соавт. [13] впервые представлены статистически достоверные количественные данные о наличии пародонтопатогенов на пародонте здоровых лиц и пациентов с хроническим пародонтитом, полученные с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.
При этом в отношении P. intermedia делается вывод о склонности этого патогена к коинфекции с T. denticola. В то же время сам вид P. intermedia представляется авторам менее значимым с точки зрения риска развития хронического пародонтита, чем P. gingivalis, T. forsythensis и T. denticola.

С учетом вышесказанного целью настоящего исследования было уточнение роли P. intermedia в качестве этиологического фактора хронического пародонтита на основании данных измерения количественной представленности этого микроорганизма у пациентов с хроническим пародонтитом и лиц контрольной группы.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Клинический материал был собран на базе Центрального научно-исследовательского института стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Министерства здравоохранения РФ.
Все пациенты дали информированное согласие, в котором были подробно описаны условия участия в исследовании. Обследованы 153 пациента в возрасте от 16 до 70 лет без тяжелой соматической патологии. Основную группу составили 78 человек — пациенты с гингивитом (n = 2), хроническим пародонтитом легкой степени (n = 12), средней (n = 37) и тяжелой (n = 27), средний возраст — 42,6 ± 11,3 года. В контрольную группу вошли 75 человек (лица без признаков пародонтита), средний возраст — 27,7 ± 10,8 года.
В представленной выборке женщины составили 92 человека (41 пациентка с хроническим пародонтитом и 51 — контрольной группы), мужчины — 61 (основная группа — 34 пациента, контрольная — 27). Главным критерием для постановки диагноза «хронический генерализованный пародонтит» считали разрушение зубодесневого прикрепления. Степень тяжести устанавливали на основании оценки глубины пародонтальных карманов и выраженности деструкции костной ткани.

Содержимое пародонтальных карманов получали с помощью стерильных бумажных эндодонтических штифтов (размером № 25), которые помещали в пробирку с реактивом «Проба-Рапид» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) объемом 0,5 мл. Клинический материал от каждого пациента собирали дважды.
Суммарную бактериальную ДНК пародонтального смыва пациентов выделяли с помощью набора реагентов «Проба-ГС» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) в соответствии с инструкцией. Препарат ДНК, соответствующий 1/10 объема одного смыва (50 мкл), растворяли в 50 мкл элюирующего раствора. В качестве матрицы для проведения одной ПЦР использовали 5 мкл полученного препарата.

В целях нормирования сигнала (учета разброса в количестве взятого биоматериала и эффективности экстракции ДНК) для каждого образца определяли величину «относительного Ct».
Для этого из величины «абсолютного Ct» для специфического набора праймеров и зонда, усредненной по двум образцам одной серии, вычитали усредненную величину Ct общей бактериальной массы для тех же двух образцов серии. Статистической обработке подвергали данные, выраженные в форме «относительного Ct». Для анализа данных применяли параметр «пороговой обсемененности» пародонта патогенами A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis и T. denticola, что позволяло отличить патологическую обсемененность (∆Ct <15), способную служить причиной возникновения пародонтита, от нормальной (∆Ct >15), встречающейся у лиц без выраженного поражения пародонта или склонности к нему. Данный подход к анализу результатов был рассмотрен в заявке на патент РФ № 2015120411 (Шибаева, Кудыкина, Трубникова и др. Способ оценки обсемененности пародонта патогенными бактериями с применением полимеразной цепной реакции в реальном времени).
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета Statistica 8.0 для Windows по стандартным методикам вариационной статистики для непараметрических данных, сравнение полученных величин осуществляли путем анализа параметров Манна–Уитни.
При анализе взаимосвязей внутри пары количественных или порядковых качественных признаков использовали корреляционный анализ по методу Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты сравнения полученных данных, нормированных на содержание общей 16S рДНК в образце, в виде параметра Ct были проанализированы с помощью критерия Манна–Уитни (в составе программы Statistica). Данный подход позволил выявить вклад каждого из патогенов в развитие патологии пародонта, а также исследовать склонность пародонтопатогенов к коинфекции. Была проверена гипотеза о наличии статистически значимых различий между основной и контрольной группами по представленности в консорциуме пародонта каждого из исследуемых видов патогенов. Анализ осуществляли во всей выборке (без разделения по полу), а также отдельно в выборке мужчин и в выборке женщин (табл. 1).

Сравнительный анализ обеих групп показал наличие сильной связи между обсемененностью пародонта патогенами P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythensis, T. denticola и патологическим состоянием пародонта: значение параметра Z составляло 6,2; 5,6; 8,3; 7,2 соответственно. Только для такого опасного пародонтопатогена, как A. actinomycetemcomitans, не было выявлено разницы в значениях ∆Ct в контрольной и основной группах. При сравнительном анализе полученных данных отдельно у мужчин и женщин отличий от результатов для всей выборки выявлено не было, однако ввиду дробления выборки на меньшие по размеру группы произошло снижение значений Z и p. Полученные результаты свидетельствуют, что P. intermedia нельзя назвать наиболее распространенным пародонтопатогеном. В контрольной группе патологическая обсемененность этим микроорганизмом зафиксирована только в 7,7 % случаев, а в основной группе пациентов — в 55 %. Для сравнения: пародонтопатогены «красного комплекса» обнаружены в существенно большем количестве случаев:

• gingivalis: норма — 33 %, патология — 76 %;
• forsythensis: норма — 40 %, патология — 95 %;
• denticola: норма — 19 %, патология — 76 %.

С учетом этого наблюдения вся исследуемая выборка вне зависимости от диагноза была разделена по признаку патологической обсемененности P. intermedia, т. е. в основную группу были отнесены пациенты со значением ∆Ct <15 (патологический уровень обсемененности), в контрольную — с ∆Ct >15 (допустимый уровень обсемененности). С помощью критерия Манна–Уитни была проверена гипотеза о наличии статистически значимых различий между группами по представленности каждого из исследуемых патогенов (табл. 2). Согласно полученным результатам патологическая обсемененность пародонта P. intermedia имеет сильную связь с наличием в первую очередь T. forsythensis (Z = 6,5, p <0,001). Значимые корреляции отмечены также для T. denticola (Z = 6,0, p <0,001) и P. gingivalis (Z = 5,1, p <0,001). Патологическая обсемененность P. intermedia, как показало проведенное исследование, не коррелирует с A. actinomycetemcomitans.

Для установления парных корреляций между гиперколонизацией пародонта P. intermedia и другими патогенами определяли коэффициент корреляции Спирмена. Исследование проводили для всей выборки (табл. 3), а также отдельно для контрольной группы (табл. 4) и группы пациентов с хроническим пародонтитом (табл. 5). Полученные результаты полностью подтвердили существенную роль P. intermedia в составе комплекса с P. gingivalis, T. forsythensis и T. denticola в развитии пародонтита. Анализ всей выборки показал, что самая сильная связь наблюдается в отношении колонизации пародонта парой T. forsythensis / T. denticola.

Несколько меньшая, но высокая взаимосвязь выявлена в парах P. gingivalis / T. forsythensis, P. intermedia / T. forsythensis, P. intermedia / T. denticola и P. gingivalis / T. denticola. Связь средней силы получена для пары P. gingivalis / P. intermedia. Сходные корреляции наблюдались и при анализе пациентов основной группы с той лишь разницей, что значение коэффициента корреляции для пары P. gingivalis / T. forsythensis несколько больше, а для пары P. gingivalis / P. intermedia — меньше. При использовании корреляционного теста A. actinomycetemcomitans не проявил склонности к коинфекции с пародонтопатогенами «красного комплекса». Напротив, при анализе данных контрольной группы прослеживалась слабая тенденция к конкуренции между ним и другими патогенами: P. gingivalis и T. denticola.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Применение критерия Манна–Уитни позволило подтвердить существенное влияние пародонтопатогенов «красного комплекса» — P. gingivalis, P. intermedia,T. forsythensis, T. denticola — на развитие хронического пародонтита. Однако достоверность различий между основной и контрольной группами, полученных для P. intermedia, оказалась ниже, чем для остальных пародонтопатогенов. Это, вероятно, связано с относительной редкостью P. intermedia у пациентов (7,7 % — в случае нормы, 55 % — в случае патологии). Более того, не было зафиксировано ни одного случая заболевания пародонтитом, при котором наблюдалась бы патологическая обсемененность P. intermedia без одновременной патологической колонизации пародонта каким-либо патогеном «красного комплекса».

Таким образом, применительно к P. intermedia невозможно говорить о ее поведении при моноинфекции, в отличие, например, от P. gingivalis. Подтверждение этого факта было получено при разделении выборки по признаку наличия/отсутствия патологической обсемененности пародонта P. intermedia.

При этом была выявлена выраженная тенденция к формированию комплекса этого патогена с T. forsythensis, а также с T. denticola и P. gingivalis. Эти результаты полностью подтвердились и при исследовании корреляций по методу Спирмена: патологическая обсемененность P. intermedia показывает связь высокой силы с наличием на пародонте комплекса T. forsythensis / T. denticolа, в то время как корреляция с гиперколонизацией пародонта P. gingivalis заметно слабее.

ВЫВОДЫ

Можно утверждать, что P. intermedia является достаточно опасным пародонтопатогеном. Обнаружение этого микроорганизма на пародонте с высокой долей вероятности позволяет прогнозировать тяжелое течение хронического пародонтита. Это заключение дает основание рассматривать уровень колонизации пародонта P. intermedia как важный диагностический критерий. При этом P. intermedia не выступает в роли инициатора патологических процессов, но вносит значительный вклад в развитие сочетанной инфекции пародонта, участвуя в коинфекции с комплексом T. forsythensis / T. denticola.