Сывороточный альбумин как мишень свободных радикалов

Существует большое число данных о том, что САЧ обладает антиоксидантной активностью, которая обусловлена не одной, а по меньшей мере тремя причинами: 1) связыванием металлов переменной валентности, например меди; 2) реакцией со свободными радикалами (ловушка радикалов); 3) образованием при окислительной модификации продуктов, обладающих антиоксидантными свойствами.

Если добавить САЧ к липопротеинам крови, которые быстро окисляются в присутствии ионов меди, то перекисное окисление липидов в липопротеинах резко тормозится [10], однако не исчезает полностью, поскольку в комплексе с альбумином медь сохраняет каталитическую активность. Таким образом, САЧ является антиоксидантом, потому что образует комплекс с ионами меди, но этот комплекс сам по себе может быть прооксидантом, что зависит от количества связанной с альбумином меди в плазме крови и активности этого комплекса. Как уже было отмечено, связывание NO и жирных кислот, а также химическая модификация тиоловой группы Cys-34 делают комплекс Cu/САЧ каталитически активным. Напротив, нативный САЧ полностью подавляет каталитическую активность ионов меди.

Перехватчиком (ловушкой) радикалов в сывороточном альбумине служит прежде всего SH-группа Cys-34, благодаря которой САЧ составляет основную часть активных тиолов в плазме крови [11, 12]. Окисление Cys-34 приводит к образованию сульфеновой кислоты (RSOH), которая в дальнейшем окисляется до сульфиновой (RSO₂H) или сульфоновой (RSO₃H) [13]. Поскольку, как уже было сказано, SH-группы служат защитой от свободнорадикального окисления [14, 15], их концентрация в плазме крови заметно снижается при усилении ОС, в том числе при многих заболеваниях [16, 17, 18], а также при старении [19]. K. Oettl и соавт. методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуоресцентным детектированием исследовали редокс-состояние САЧ (Cys-34) в качестве возможного системного маркера ОС у больных с различными заболеваниями (катарактой, глаукомой, возрастной дегенерацией желтого пятна, сахарным диабетом, диабетической ретинопатией и гипертензией) с осложнениями и без осложнений и с учетом возможных возрастных последствий [20].

Другой аминокислотой, чувствительной к действию свободных радикалов, является метионин. В состав САЧ входят 6 остатков метионина. Действие самых разнообразных окислителей приводит к образованию метионин сульфоксида (MetSO). Однако изменения в свойствах САЧ, вызываемые свободными радикалами, в случае с метионином трактуются не вполне однозначно. Если спроецировать ситуацию на ферменты, то можно обратиться к работе R. Levine и соавт. [21], в которой автор на примере глутамин-синтазы установил, что предпочтительное окисление незащищенных метиониновых остатков ферментов мало сказывается на выполняемых ею биологических функциях. Вместе с тем в работе высказано предположение, что цикл окисления и восстановления метиониновых остатков в биологических системах может служить фактором защиты от активных форм кислорода и предотвращать другие функционально важные изменения в структуре белка.

Третьей мишенью для свободных радикалов в сывороточном альбумине служат ароматические аминокислоты, которые в условиях ОС могут подвергаться окислительной модификации. В состав САЧ входят 18 остатков тирозина и 1 остаток триптофана. Результат окислительной модификации свободных тирозина и триптофана, а также альбумина — усиление защитных свойств белка, поскольку образуются продукты окисления, являющиеся антиоксидантами [22]. В частности, одним из таких продуктов в случае тирозина выступает ДОФА [22].

Таким образом, под действием свободных радикалов САЧ теряет свободную тиоловую группу цистеина, часть тирозиновых и триптофановый остаток. Чем выше уровень ОС в крови человека (по другой терминологии — системного ОС), тем сильнее степень потери тиолов и ароматических аминокислот. Оба этих критерия в настоящее время используются для оценки уровня ОС в клинической практике. Заметим при этом, что ароматические аминокислоты, входящие в состав САЧ, являются природными флуорофорами, а следовательно, изучение их окислительной деструкции можно проводить простым и чувствительным методом регистрации ультрафиолетовой (УФ) флуоресценции. Этому вопросу посвящен ряд работ. Снижение флуоресценции САЧ наблюдали при исследовании влияния гликозилирования [23] и свободных радикалов [24], моделируя сахарный диабет. Авторами была обнаружена четкая корреляция между конформационными изменениями молекулы белка и его антиоксидантными свойствами, подтверждена ключевая роль ионов меди при проявлении прооксидантных свойств альбумина. Аналогичные эффекты снижения интенсивности аналитического сигнала, представляющие полезный индекс деградации аминокислот и демонстрирующие четкую зависимость окисления и конформационных перестроек белка, были обнаружены при исследовании воздействия индивидуального гидроксильного радикала (•OH) и его комбинации с супероксидным анион-радикалом (•OH + •О^2–) на белки [25]; при изучении окисления тиоловых групп и увеличения числа фруктозаминов у пациентов, страдающих обструктивным апноэ сна [26]; при оценке структурных изменений белка, опосредованных взаимодействием с пероксинитритом (окислением триптофана и цистеина, нитрованием тирозина, формированием дитирозина, продуцированием 2,4-реактивного динитрофенилгидразина, карбонилов и фрагментацией молекулы) [27]; при моделировании «мягкого» ОС, вызванного действием аскорбата, кислорода и следовых количеств металлов [28]; наконец, при исследовании корреляции роста окислительной модификации САЧ с увеличением степени тяжести печеночной недостаточности, характеризующейся повышенным содержанием карбонильных групп и одновременно окислением Cys-34 [29].

В последнее время было показано, что окислительная модификация белков усиливается в результате их гликозилирования [30]. В работе J. V. Hunt, S. P. Wolff [30] этот факт был продемонстирирован на примере триптофана. Более того, многими наблюдениями установлено, что гликозилирование и окисление тесно связаны друг с другом: гликозилирование не только усиливает процесс окисления, но и само усиливается им (для описания этого свойства был даже введен термин «glycoxidation» — гликооксидация, от англ. glucosylation и oxidation) [31]. F. Monacelli и соавт. [31] с помощью флуоресцентной спектроскопии и метода кругового дихроизма исследовали конечные продукты окисления и гликозилирования, а также конформационные изменения САЧ после инкубации с рибозой, аскорбиновой кислотой (АК) и диэтилентриамин-пентауксусной кислотой (ДТПК) в различных комбинациях. Установлено, что рибоза вызывает значительное повышение уровня пентозидина (маркера гликозилирования), при этом АК и ДТПК предотвращают его накопление, особенно на более поздних стадиях инкубации. Рибоза умеренно увеличивала содержание продуктов окисления белка, в то время как АК сильно ингибировала их формирование. Кроме того, рибоза в комбинации с АК способствовала дополнительному увеличению образования продуктов окисления, а ДТПК затормаживала АК-индуцированное образование продуктов окисления белка. Методом кругового дихроизма получены результаты, позволяющие утверждать, что АК и ДТПК являются сильными модификаторами α-спиральной части структуры САЧ, в то время как рибоза влияет на структуру белка только на более поздних стадиях инкубации.