Нейро-компьютерные интерфейсы используют в медицине для создания нейропротезов, сопоставимых по отзывчивости на ментальные команды пользователя со здоровыми органами тела [1, 2, 3]. Возможна передача информации и в обратном направлении, от компьютера к мозгу: с помощью электрической стимуляции восстанавливают утраченные сенсорные функции, например слуховую [4] или зрительную [5]. Однако интересной исследовательской задачей является передача информации как таковой — знаний и опыта. Было показано, что использование нелинейной динамической модели с множественными входами/выходами позволяет осуществлять «передачу» определенного пространственно-временного паттерна, зарегистрированного в гиппокампе одной крысы, в гиппокамп другой, что приводит к  достоверному изменению поведения второго животного [6].

Известно, что нейронные сети, составляющие основу когнитивной деятельности, не имеют четкой локализации в структурах головного мозга, а распределены в них [7, 8]. В связи с этим возникает потребность в перепрограммировании нейронных сетей. Опубликованные работы, посвященные изучению характера спонтанной активности в нейросетях in vitro и  возможностям ее внешней модификации [9, 10, 11, 12, 13], свидетельствуют о способности сетей первичных диссоциированных культур нейронов из области коры и гиппокампа на мультиэлектродных матрицах (multielectrode array, MEA) управлять отключением внешней стимуляции посредством изменения своей активности на выбранном экспериментатором электроде. Впервые такое обучение нейрональной культуры было продемонстрировано Shahaf и Marom [14], а затем успешно воспроизведено другими исследователями [15, 16, 17, 18].

По мере формирования сети из диссоциированной культуры нейронов возникает спонтанная биоэлектрическая активность, регистрируемая электродами матрицы. Так, в первые дни развития культуры в условиях отсутствия внешней стимуляции регистрируются только отдельные потенциалы действия, но с течением времени они группируются, образуя пачки [19]. В настоящей работе мы предположили, что спонтанная пачечная активность должна сводиться к небольшому числу стереотипных паттернов и применение кластерного анализа позволит идентифицировать один или несколько доминантных. Поскольку внешняя стимуляция нарушает сложившуюся последовательность активаций, сеть изменит активность, чтобы отключить стимуляцию и вернуться к типичному паттерну. Тогда кластерный анализ после стимуляции (обучения) должен будет выявить возвращение исходного типа активности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры

Первичную культуру готовили из тканей гиппокампа новорожденных мышей линии C57BL/6. Основные правила содержания и ухода за экспериментальными животными соответствовали нормативам, данным в Приказе Минздрава России № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики в Российской Федерации». Эксперимент был одобрен постановлением локального этического комитета по вопросам биомедицинских исследований Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (протокол № 1 от 09.07.2015).

Клетки культивировали на 60-канальных мультиэлектродных матрицах 60StimMEA200/30-ITO (Multichannel Systems, Германия). Предварительно дно чашек обработали поли-L-лизином для лучшей адгезии клеток. Исходная плотность культуры составила 300 000 клеток/мм³. Их диссоциирование достигалось путем обработки 0,25 % трипсином (Invitrogen 25200-056, США). Поддержание жизнеспособности нейронов осуществляли в культуральной нейробазальной среде NeurobasalTM (Invitrogen 21103- 049) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen 17504-044), глутамином (Invitrogen 25030-024) и пенициллин-стрептомицином (Life Technologies 15140122, США) в инкубаторе GALAXY 170S (New Brunswick Scientific, США) при постоянных условиях: температуре 37 ˚C, 100 % влажности и содержании 5 % CO₂ в воздухе. Развитие глии не подавляли, поскольку глиальные клетки были необходимы для длительного сохранения жизнеспособности культуры в условиях in vitro. Половину объема среды меняли на новую каждые три дня.

Биоэлектрическую активность клеток регистрировали с  помощью установки MEA1060-Up-BC-Standard (Multichannel Systems). Для получения данных использовали программное обеспечение, поставляемое производителем с установкой.

Для регистрации динамики спонтанной пачечной активности использовали две культуры. Регистрацию осуществляли с 4-го дня жизни (day in vitro, DIV) до гибели культур. Для дальнейшей обработки использовали данные с момента появления спонтанной пачечной активности до ее прекращения. Для обучения использовали одну культуру в возрасте 24 DIV.

Протокол обучения нейрональной культуры in vitro

1) Фоновая регистрация биоэлектрической активности культуры в течение 1 ч.

2) Стимуляция одиночными импульсами биполярной прямоугольной формы амплитудой от –300 до 300 мВ отдельно по каждому электроду для выбора электрода, вызвавшего наиболее интенсивный ответ культуры.

3) 5 циклов стимуляции по выбранному в п. 2 электроду. Каждый цикл состоит из пятиминутной серии прямоугольных импульсов с двухминутными перерывами. Задержка между импульсами в серии подбирается для каждого эксперимента таким образом, чтобы каждый импульс вызывал популяционную пачку активности. По результатам стимуляции выбирается регистрирующий электрод, для которого электрическая активность в течение  30–80 мс после подачи стимула была наименьшей.

4) Регистрация спонтанной биоэлектрической активности культуры в течение 1 ч.

5) 20 циклов обучения. Критерием успешности обучения является увеличение в два раза вероятности зарегистрировать спайковую активность на заданном временном интервале на выбранном в п. 3 электроде. Обучение заключается в стимуляция в соответствии с п. 3, но с условием, что при достижении критерия успешности обучения стимуляция прекращается и дается двухминутный отдых.

6) Регистрация спонтанной биоэлектрической активности культуры в течение 1 ч.

Детекция спайков и пачечных событий

Исходный сигнал подвергали цифровой обработке высокочастотным фильтром Баттерворта 2-го порядка с полосой пропускания сигнала от 200 Гц, что позволяло исключить низкочастотные помехи. Присутствие потенциала действия детектировали, если амплитуда сигнала превышала 4 стандартных отклонения. В этом случае находили максимум амплитуды, что и считали временем возникновения спайк.

Пачечное событие (пачка) возникает на одном элекроде, и характеризуется взрывной генерацией импульсов в  течение непродолжительного времени (0,1–3,0 с в зависимости от возраста культуры и плотности ее посадки) и обычно сопровождается низкочастотной (1–5 Гц) компонентой сигнала. Детекцию пачек осуществляли путем выявления низкочастотной компоненты в заданном окне и детекции спайков в окрестностях этой компоненты. Началом и концом пачки считали время возникновения первого и последнего спайка соответственно.

Популяционными пачечными событиями называют пачки, которые наблюдаются синхронно (с небольшими задержками — порядка 0,002–0,05 с) более чем на половине всех активных электродов. Началом популяционной пачки считается время возникновения первого пачечного события.

Анализ паттернов

В качестве вектора признаков пачечного события V_k использовали фронт активации пачек (activation pattern) [10]. Размерность вектора V_k равна количеству активных электродов (т. е. электродов, на которых наблюдалась хотя бы одна пачка): формула, где t_k(i) — начало активности на i-том электроде, t^k _start — время начала популяционного пачечного события. Если при данной пачке на электроде не было зафиксировано активности, но при других пачках она присутствовала, то соответствующая компонента вектора принимает среднее значение остальных компонент вектора.

В качестве метрики использовали коэффициент корреляции Пирсона, а метода кластеризации — метод взвешенного попарного среднего [20].

Для получения кластеров необходимо в упорядоченной последовательности векторов признаков найти расстояния между соседними векторами, после чего на основании полученных расстояний определить пороговое значение th. Соседние векторы, расстояния между которыми меньше порогового, образуют кластеры.

Пороговое значении th, определяли следующим образом. Строили график зависимости максимальной удаленности кластеров D от числа кластеров n в порядке возрастания. Тогда формула, где argmax — функция, вычисляющая максимальное значение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Кластерный анализ спонтанной пачечной активности нейронов двух культур в возрасте 10…30 DIV (рис. 1) показал, что в  обоих случаях более чем 50 % фронтов активации пачек принадлежали к  одному доминирующему кластеру (№ 7 на рис. 1А и № 5 на рис. 1В). Большинство прочих популяционных пачек (40 %) распределились по двум равным по размеру кластерам (№ 6 и 9 на рис. 1А и № 4 и 6 на рис. 1В). Доминирующие паттерны пачечной активности нейронов были стабильны, несмотря на внешние воздействия на культуру, связанные со сменой среды и перемещением культуры из инкубатора к  регистрирующей установке и обратно.

В эксперименте по обучению нейрональной сети для стимуляции (п. 2 протокола обучения) был выбран 22-й электрод, а для прекращения стимуляции (п. 3 протокола обучения) — 12-й. Условием завершения стимуляции являлось обнаружение 5 и более спайков в окне 50-80 мс после стимулирующего импульса.

Результаты кластерного анализа спонтанной пачечной активности, зарегистрированной на этапах 1, 4 и 6 протокола обучения, приведены на рис. 2. Перед стимуляцией (этап 1) популяционные пачки формировали два больших кластера № 15 и 18. После стимуляции без обратной связи (этап 4) число пачек, соответствовавших кластерам № 15 и 18, уменьшилось, а  кластерам № 2 и 4 — увеличилось. После стимуляции с обратной связью (этап 6) число пачек в доминирующих кластерах № 15 и 18 осталось на промежуточном уровне, а остальная часть активности переключилась из кластеров № 2 и 4 в кластер № 3.

Доминирующая спонтанная пачечная активность до стимуляции и таковая после стимуляции имели различные паттерны активаций (рис. 3). Кластеры № 3 и 4 были схожи между собой, но отличались от кластеров № 15 и 18, которые в значительной степени перекрывались. Кластер № 2 сочетал в себе черты тех и других.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Согласно нашей гипотезе, спонтанная пачечная активность нейронных сетей in vitro должна характеризоваться самоорганизацией и  повторением паттернов активности. Наш эксперимент и результаты других исследователей [13, 21, 22] подтверждают, что самоорганизация нейронов при созревании культуры приводит к появлению ограниченного числа динамических режимов, каждый из которых представлен своим собственным типом активности — аттрактором. Таким образом, нейроны in vitro способны производить и поддерживать некоторую последовательность активаций, что необходимо для сохранения памятного следа.

Второе предположение высказанной гипотезы — устойчивость паттернов спонтанной пачечной активности к внешним воздействиям, в том числе внешней электрической стимуляции. Наши результаты показывают, что состав паттернов не зависит от наличия обратной связи при стимуляции и изменяется только частота их встречаемости. Это позволяет предположить, что обучение в живых нейронных сетях является результатом генерации вариаций существующих паттернов с последующим выбором подходящего шаблона для решения «проблемы». Так, в протоколе, использованном нами в исследовании, «проблема» была определена с помощью внешней стимуляции, которую можно отключить, предоставив «решение».

ВЫВОДЫ

Исследование спонтанной пачечной активности нейронных сетей in vitro показало, что динамика активности сети сводится к небольшому числу аттракторов. Изменение пачечной активности при внешней стимуляции показало, что доминирующий аттрактор спонтанной активности не разрушается, однако увеличивается разнообразие паттернов. Можно предположить, что обучение осуществляется в основном через переключение между существующими динамическими аттракторами нейрональной активности.