ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
МЕТОД
Модификация метода анализа результатов редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 на предимплантационных эмбрионах мыши
Информация об авторах
1 Marlin Biotech, Москва
2 Институт биологии гена, Москва, Россия
3 Кафедра неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики, лечебный факультет,
Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва
Для корреспонденции: Димитриева Татьяна Владимировна
ул. Вавилова, д. 34/5, г. Москва, 119334; moc.liamg@at.aveirtimid
Информация о статье
Благодарности: авторы выражают благодарность Центру коллективного пользования Института биологии гена РАН за предоставленное для экспериментов оборудование.
Статья получена: 16.06.2016
Статья принята к печати: 21.06.2016
Опубликовано online: 05.01.2017
|
Рис. 1. Амплификация участка интрона 8 гена дистрофина DMD с использованием разного количества матрицы
Бластоцисты были лизированы по методу Sakurai и соавт. [19] с модификациями в конечном объеме 20 мкл. Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали от 1 до 10 мкл раствора тотальной ДНК. В качестве контроля к каждому образцу использовали соответствующий объем воды из последней промывки, обработанной аналогичным образом. Продукты ПЦР разделяли в 2 % агарозном геле с интеркалирующим красителем. Маркер длин фрагментов ДНК — NL001 («Евроген», Россия).
Рис. 2. Детекция вставок и делеций в интроне 34 гена дистрофина DMD после микроинъекций комплекса sg34 с белком Cas9
Фрагмент интрона вокруг сайта узнавания g34 амплифицировали с инъецированных и контрольных эмбрионов. Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) отжигали на контрольный ампликон и обрабатывали эндонуклеазой I фага Т7. В образцах, содержавших вставки и делеции, произошло расщепление на 2 фрагмента. Такие образцы отмечены на рисунке символом * (А). Границы вставок и делеций в выборочных образцах были определены секвенированием по Сэнгеру (Б). Продукты ПЦР разделяли в 2 % агарозном геле с интеркалирующим красителем. Маркер длин фрагментов ДНК — NL002 («Евроген», Россия).
Рис. 3. Детекция вставки по месту разрыва в интроне 8 гена дистрофина DMD после микроинъекций комплекса sg31 с белком Cas9 и матрицей для репарации
Фрагмент интрона вокруг сайта узнавания g31 амплифицировали с инъецированных и контрольных эмбрионов. Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) обрабатывали эндонуклеазой BamHI, сайт узнавания которой был закодирован в матрице для репарации. В образцах, содержавших вставку, произошло расщепление на 2 фрагмента. Такие образцы отмечены на рисунке символом * (А). Наличие вставки в выборочных образцах было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. (Б). Продукты ПЦР разделяли в 2 % агарозном геле с интеркалирующим красителем. Маркер длин фрагментов ДНК — NL002 («Евроген», Россия).
