Актин и актин-связывающие белки являются компонентами цитоскелета клетки, формирующими систему микрофиламентов. Они вовлечены во множество процессов, такие как рост, подвижность, деление клетки, регуляция транскрипции, клеточно-матриксные и межклеточные взаимодействия. Актиновый цитоскелет также участвует в сигнальных каскадах, во внутриклеточном транспорте белков и органелл [1]. В клетках постоянно идут энергозависимые процессы полимеризации и деполимеризации актина, а сборка его новых нитей (микрофиламентов) сопровождается формированием специализированных структур, таких как стресс-фибриллы, филоподии, ламеллоподии и др. Перестройки актина и актин-связывающих белков могут указывать на нарушения в работе клетки и быть признаком ее злокачественной трансформации [2]. Раковые клетки используют различные механизмы для выживания и роста опухоли, в том числе изменение адгезивных и механических свойств. Структура актинового цитоскелета может определять такие характеристики опухолевых клеток, как ригидность, подвижность и инвазивность [3].

Исследование структуры актинового цитоскелета важно для понимания механизма действия того или иного противоопухолевого препарата. Так, посредством визуализации изменений в системе актиновых волокон был продемонстрирован эффект воздействия малых интерферирующих РНК, применяемых для ингибирования пролиферации раковых клеток [4]. Характер организации актина послужил также одним из критериев восприимчивости клеток рака легкого к химиопрепаратам [5]. Кроме того, актин как потенциальный регулятор развития опухолей и метастазов может сам выступать мишенью для химиотерапии [6, 7]. Однако доступные на сегодня соединения, специфически нарушающие организацию микрофиламентов, высокотоксичны и пока не нашли применения в клинической практике.

Перспективным представляется исследование особенностей реакции актиновой сети на терапию противоопухолевыми препаратами, адаптированными для лечения онкологических больных. Злокачественные опухоли, как правило, гетерогенны, и для их успешной элиминации необходимо уничтожение самых агрессивных клеточных популяций. Показано, что в клетках, способных к формированию метастазов, наблюдаются наиболее выраженные перестройки актинового цитоскелета [8, 9]. Определение характера реорганизации актина в ответ на стандартную химиотерапию важно для обнаружения потенциально метастазирующих клеток опухоли.

Целью нашего исследования являлось изучение структурных перестроек в системе актинового цитоскелета в опухолевых клетках при воздействии противоопухолевых препаратов паклитаксела и цисплатина, используемых в клинической практике.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на клеточной линии HeLa Kyoto (рак шейки матки человека). Клетки культивировали в среде DMEM («ПанЭко», Россия) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (10 %) (HyClone, GE Healthcare Life Sciences, США), глутамина (2 mM) («ПанЭко»), стрептомицина (50 мкг/мл) («ПанЭко») и  пенициллина (50 ед./мл) («ПанЭко») в условиях содержания в воздухе 5 % СО, и при температуре 37 °C.

Применяли препараты паклитаксел («Таксол», Bristol- Myers Squibb, США) и цисплатин («Цисплатин-Тева», Teva Pharmachemie, Нидерланды). В качестве контрольного соединения использовали цитохалазин D (Enzo Life Sciences, США) — ингибитор полимеризации актина. Для вычисления полулетальных концентраций препаратов использовали МТТ-тест [10], время инкубации клеток с препаратом — 24 ч. Показания оптической плотности красителя считывали на планшетном фотометре Synergy Мх (BioTek, США) на длинах волн 570 и 630 нм.

Клетки высевали на чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм FluoroDish (WPI, США) в количестве 200 тыс. На следующие сутки в опытных чашках производили замену питательной среды на среду с препаратом в полулетальной концентрации и инкубировали культуру в течение 24 ч в стандартных условиях. Контролем служили клетки без добавления препарата. После этого клетки единожды промывали раствором DPBS («ПанЭко»), добавляли 1 мл среды FluoroBrite DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) и окрашивали.

Для мечения актина использовали краситель SiR-actin (Spirochrome, Швейцария) в концентрации 0,5 мкМ, для мечения ядер — краситель Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific) в концентрации 5 мкг/мл. Окрашивали в течение 30 мин, после чего проводили флуоресцентную визуализацию. SiR-actin [11] обеспечивал мечение эндогенного актина в живых клетках без фиксации и отмывок образца после окрашивания. Эксперимент включал микросъемку контрольного образца и образцов (по одному) с паклитакселом, цисплатином и цитохалазином D. Каждый образец оценивали в 10 полях зрения.

Для мечения альфа-актинина использовали плазмидный вектор pTagRFP-actinin («Евроген», Россия). Клетки были временно трансфицированы им с помощью реагента X-tremeGene 9 (Roche, США) по методике производителя. Спустя сутки после трансфекции клетки инкубировали с препаратом в полулетальной концентрации в течение 24 ч. Перед проведением флуоресцентной микроскопии клетки промывали раствором DPBS и добавляли 1 мл среды MEM (Sigma-Aldrich, США). Исследовали контрольный образец и опытные образцы (по одному) с паклитакселом, цисплатином и цитохалазином D. Каждый образец оценивали в 5-6 полях зрения.

Флуоресцентный имиджинг осуществляли на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti (Nikon, Япония), оснащенном объективом со стократным увеличением, масляной иммерсией Аро TIRF/1.49 (Nikon) и EM-CCD-камерой iXon3 DU-897 (Andor, Великобритания). Для детекции сигнала флуоресценции красителя SiR-actin использовали широкополосный фильтр C-NSTORM QUAD (Nikon) и лазер с длиной волны 640 нм (плотность мощности — 7,8 Вт/см²). Для красителя Hoechst 33342 использовали флуоресцентную лампу Nikon Intensilight и фильтр флуоресценции BV-2A. Актиновый цитоскелет визуализировали с помощью микроскопии полного внутреннего отражения (Total Internal Reflection Fluorescence microscopy, TIRF). Выбор TIRF-режима был обусловлен тем, что он позволяет наблюдать примембранный слой клетки толщиной не более 200 нм, обеспечивая наилучшее соотношение сигнал/шум, и оптимален при проведении локализационной микроскопии сверхвысокого разрешения с детекцией одиночных молекул. Обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения Fiji [12]. Микроскопию сверхвысокого разрешения на основе TagRFP проводили по методике, описанной нами ранее [13].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе исследования мы определили концентрации препаратов, необходимые для проведения химиотерапии выбранной культуры клеток. По результатам МТТ-теста были построены кривые зависимости жизнеспособности клеток HeLa Kyoto от концентрации препаратов, по которым мы рассчитали их полулегальные концентрации: для паклитаксела — 45 нМ для цисплатина — 7 мкМ, для цитохалазина D — 12,5 мкМ.

Затем мы оценили эффекты воздействия препаратов на структуру актинового цитоскелета в опухолевых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии. На рис. 1А показаны типичные клетки HeLa Kyoto в контрольном образце, окрашенные SiR-actin. Актиновый скелет в них характеризуется наличием богатой сети из протяженных стресс-фибрилл, пронизывающих цитоплазму в разных направлениях, имеются выпячивания на ведущем крае клетки с высокой плотностью актина в кортикальном слое, а также детектируется паутинообразная сеть из тонких микрофиламентов, заполняющих всю цитоплазму. В образце с цитохалазином D типичные стресс-фибриллы в клетках не наблюдаются. Для их сборки требуется формирование филаментов актина из мономерного белка, а в присутствии цитохалазина D этот процесс затруднен. Характерно наличие равномерно рассредоточенных по цитоплазме коротких филаментов и точечных структур актина. Только во внешнем примембранном слое наблюдаются редкие остатки стресс-фибрилл. Клетки имеют более округлую форму и лишены выступов на ведущем крае (рис. 2Б). В образце с цисплатином значительные нарушения в организации микрофиламентов не обнаруживаются. Отмечается типичная для клеток HeLa Kyoto неправильная форма с множеством стресс-фибрилл, свойственных распластанным клеткам. Вместе с тем, в отличие от контрольного образца, после воздействия цисплатина отсутствуют сеть из тонких микрофиламентов и скопления актина в кортикальном слое клеток (рис. 1В). В образце с паклитакселом детектируются более сильные перестройки актинового цитоскелета, чем в образце с цисплатином. Так, клетки практически лишены выпячиваний цитоплазмы и демонстрируют тенденцию к ошариванию. Актин сосредоточен в основном в кортикальном слое. В клетках выявляются редкие волокна микрофиламентов при полном отсутствии стресс-фибрилл (рис. 1Г). Следует отметить, что большинство клеток имеет многоядерный фенотип.

Более тонкую оценку изменений в системе микрофиламентов провели с помощью флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, основанной на локализации одиночных молекул флуорофора. Визуализировали ультраструктуру актин-связывающего белка альфа-актинина. В клетках контрольного образца наблюдается обычное распределение альфа-актинина, в норме расположенного вдоль актиновых пучков. Филаменты актин-связывающего белка заполняют всю цитоплазму, формируя небольшие утолщения в области фокальных контактов (рис. 2А). Под воздействием цитохалазина D наблюдается полная разборка волокон альфа-актинина, что согласуется с характером агрегации актина и утратой протяженных стресс-фибрилл. Детектируются точечные (диаметром 200-250 нм) структуры альфа-актинина, равномерно распределенные по клетке (рис. 2Б). После воздействия паклитаксела клетки приобретают округлую форму, теряют выпячивания и стресс-фибриллы. Альфа-актинин концентрируется в кортикальном слое клеток. На субдифракционном изображении видно существенное утолщение фибрилл в области фокальных контактов и их сближение между собой (рис. 2В). Наименее выраженные изменения отмечаются после химиотерапии цисплатином. Клетки неправильной формы имеют характерную исчерченность цитоскелета (рис. 2Г). Среди структурных изменений можно отметить более плотную упаковку волокон альфа-актинина.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В работе был исследован эффект воздействия химиотерапевтических препаратов паклитаксела и цисплатина на структуру актинового цитоскелета.

Механизм действия паклитаксела, относящегося к классу таксанов, связывают с блокированием работы тубулинового аппарата клетки: стабилизация процесса сборки мономеров бета-тубулина приводит к остановке пролиферации клеток. В работе Murakami и соавт. [14] показано, что терапия соединениями таксанового ряда способствует снижению содержания альфа-актина в стромальных клетках опухоли молочной железы. Наши данные свидетельствуют о том, что, помимо микротрубочек, в реакции клеток рака шейки матки на лечение паклитакселом активно задействована система микрофиламентов. Обнаруженная нами значительная реорганизация актина (разреженные тонкие изогнутые филаменты в отсутствие стресс-фибрилл) согласуется с результатами, полученными на линии клеток рака молочной железы MCF7 при воздействии таксанов [15].

Интересно, что в большинстве клеток после инкубации культуры с паклитакселом мы наблюдали многоядерность. Показано, что связывание химиопрепарата с бега-тубулином ведет к аккумуляции клеток в фазе G2/M, полиплоидии и апоптозу [16, 17]. Перестройки в актиновом цитоскелете, которые мы детектировали в клеточной культуре HeLa Kyoto, также косвенно могут быть связаны с многоядерностью. Известно, что в нормальных многоядерных клетках, например в остеокластах, актин претерпевает значительные изменения и представлен в основном точечными структурами, формирующими подосомы [18]. Показано, что в культуре клеток-производных HeLa наблюдаются гигантские многоядерные клетки, в которых актиновый цитоскелет сосредоточен в микрошипиках на периферии клетки и точечных структурах, подобных подосомам [19].

Что касается цисплатина, то пока не установлено прямой связи его терапевтического эффекта с влиянием на актиновые волокона. Механизм действия цисплатина объясняют способностью ионов платины в его составе образовывать сшивки с пуриновыми основаниями ДНК. Это препятствует репарации ДНК, вызывая ее повреждения, которые индуцируют апоптоз в раковых клетках [20]. Тем не менее, существует ряд работ по проблеме развития устойчивости опухолевых клеток к данному препарату и роли актина в этом процессе. Так, у цисплатин-резистентных клеток отмечается изменение уровня экспрессии различных белков цитоскелета, в том числе актина, проявляющееся в нарушениях свойственной опухолевым клеткам динамики актин-филаминовой системы [21, 22]. Sharma и соавт. сообщили, что в клетках рака яичника OVCAR5, резистентных к цисплатину, наблюдаются значительные отличия в организации и механических свойствах актиновых волокон по сравнению с обычной культурой [23]. В этой работе для визуализации актина применили микроскопию сверхвысокого разрешения, что позволило выявить различия на уровне субдифракционных структур, таких как индивидуальные пучки и уплотнения межклеточных контактов. Согласно полученным нами результатам, цисплатин имеет менее выраженное по сравнению с паклитакселом воздействие на актиновый скелет клеток HeLa Kyoto. Вместе с тем данные микроскопии сверхвысокого разрешения указывают на изменение плотности упаковки микрофиламентов, что потенциально может приводить к затруднению функционирования опухолевой клетки.

ВЫВОДЫ

В данной работе с помощью флуоресцентной микроскопии мы изучили влияние двух химиопрепаратов — паклитаксела и цисплатина — на актиновый цитоскелет клеток рака шейки матки HeLa Kyoto. Было обнаружено, что паклитаксел вызывает сильную перестройку актинового цитоскелета, выражающуюся в разборке стресс-фибрилл, сосредоточении актина в кортикальном слое клеток, утолщении и сближении фокальных контактов. Цисплатин вызывал меньшие изменения: некоторое снижение количества тонких пучков микрофиламентов и более плотную упаковку альфа-актинина. Обнаруженные нами структурные изменения актинового цитоскелета под действием препаратов, не имеющих против него специфической направленности, могут указывать на наличие дополнительной клеточной мишени в борьбе с опухолью. Возможно, такая реорганизация системы микрофиламентов влияет на инвазивные и метастатические свойства клеток солидной опухоли in vivo. Мы планируем продолжить исследование влияния химиотерапии на структуру актинового цитоскелета на мышиных опухолевых моделях.