При диагностике опухолевых заболеваний с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) обязательным условием является использование гадолинийсодержащих магнитно-резонансных контрастных средств, среди которых наиболее часто применяют гадопентетовую кислоту (Gd-ДТПА, лекарственная форма — препарат «Магневист»). МРТ с использованием Gd-ДТПА обладает большой диагностической информативностью, однако в ряде случаев применение Gd-ДТПА ограничено опасностью высвобождения гадолиния из хелатора при замедлении ее выделения из организма и возможностью развития нефрогенного системного фиброза [1]. Поэтому актуальным является поиск хелаторов гадолиния с повышенной релаксирующей (контрастирующей) способностью, что позволит снизить необходимую дозу контрастного средства и, следовательно, уменьшить риск развития нефрогенного системного фиброза. Для этого может быть перспективным использование циклических углеводородов, главным образом α-, β- и γ-циклодекстринов (ЦД) [2], которые уже нашли широкое применение в фармации для обеспечения растворимости труднорастворимых лекарственных средств, а также в иных отраслях науки и техники [3].

Наибольшая значимость ЦД как в исследовательских, так и в прикладных задачах заключается в его способности избирательно образовывать комплексы включения с другими молекулами, ионами и даже радикалами. Комплексы могут быть получены в растворе, а также в твердофазном состоянии. В частности, известны сенсоры на основе ЦД, и изучен механизм их действия [4].

В настоящее время в нашей стране отсутствуют отечественные гадолинийсодержащие контрастные препараты, что серьезно ограничивает визуализацию патологических очагов, главным образом онкологических, а также контроль за эффективностью мероприятий по их терапии.

Таким образом, циклодекстрины представляют интерес как основа для создания контрастных препаратов с гадолинием. Наличие доступных гидроксильных связей на поверхности молекулы и способность образовывать соединения включения делает циклодекстрины перспективной основой для создания контрастных препаратов. Неоднократные попытки модификации различных циклодекстринов гадолинием показали существенное увеличение релаксивности гадолиния в данных комплексах [5, 6], однако их визуализирующая способность in vivo изучена не была.

Основными требованиями к комплексному соединению на основе ЦД являются: размеры молекулы не более 5,0 нм; молекула должна быть нетоксичной и стабильной в физиологических условиях в течение нескольких часов; химическая связь между комплексным соединением Gd³⁺ и ЦД должна расщепляться в организме; комплекс Gd³⁺ должен быть стабильным в диапазоне величин pH водного раствора 6,0-8,0.

Главная цель работы — экспериментальная оценка релаксирующей активности Gd-ДТПА, соединенной с β-циклодекстрином сложноэфирной связью, и изучение визуализации опухолей с помощью нового комплекса по сравнению с «Магневистом».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использовали следующие реагенты: диэтилентриаминопентауксусная кислота квалификации ч. д. а., т. пл. не ниже 219 °С; β-циклодекстрин (β-ЦД, Aldrich, США), чистота более 99 %; Gd(NO₃)₃•6H₂O (Aldrich, США), чистота 99,99 %; органические растворители квалификации ч. д. а. или х. ч. Синтез гадопентетовой кислоты, соединенной с β-ЦД, проводили в соответствии с патентом [7]. Всего было синтезировано 5 образцов, характеристики которых приведены в табл. 1. В качестве препарата сравнения использовали «Магневист» (Bayer, Германия). Полученные образцы в лекарственной форме (водный раствор с величиной pH 7,2 ± 0,2) имели концентрацию гадолиния 0,3 М.

Содержание Gd в образцах определяли на рентгенофлуоресцентном анализаторе Х-Арт М (ЗАО «Комита», Санкт-Петербург). Навеску вещества растворяли в дистиллированной воде объемом, необходимым для получения раствора с концентрацией субстанции 30 мг/мл. В специальную кювету вносили 1 мл приготовленного раствора вещества. К полученному раствору добавляли 1 мл дистиллированной воды для дальнейшего забора 1 мл полученного раствора, который помещали в кювету для рентгенофлуоресцентного анализа, затем проводили измерение. Такие объемы были выбраны для обеспечения полного смачивания поверхности кюветы и стандартизации измерений. Количественное содержание лигандов (хелаторов) и комплексов в синтезированных образцах проводили методом масс-спектрометрии. Спектры ESI-MS регистрировали на приборе Agilent LS/MS 1100 SL (Agilent Technologies, США) с ионизацией пробы электрораспылением (ESI) в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов, масс-анализатор типа ионной ловушки. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Т₁-релаксометрию проводили на МР-томографе ClinScan фирмы Bruker BioSpin, Германия (величина магнитной индукции 7 Тл, резонансная частота 300 МГц для 1) находили с помощью последовательности Turbo Inversion Recovery [8]. Интенсивность сигнала от каждой пробирки измеряли с использованием программы ImageJ (National Institutes of Health, США). Величины Т₁ исследуемых веществ рассчитывали с помощью уравнения, где SI — интенсивность сигнала; Т₁ — время спин-решеточной релаксации; TI — время инверсии; TR — время повтора импульсной последовательности; ТЕ — время появления эхо-сигнала; α — угол отклонения импульса.

Расчеты производили с помощью программного пакета Mathcad (РТС, США). Визуализирующую способность полученных образцов оценивали по величинам Т₁ на МР-томографе ClinScan (Bruker BioSpin, Германия) с напряженностью поля 7 Тл (300 МГц для ¹Н) с использованием двухсегментной поверхностной принимающей катушки. После получения быстрых ортогональных Т1-взвешенных изображений (ВИ) получали Т2-взвешенные изображения с частотным подавлением сигнала от жировой ткани во фронтальной плоскости с помощью импульсной последовательности Turbo Spin Echo с параметрами: TR = 2220 мс, ТЕ = 49 мс, толщина среза 1 мм, 16 срезов, матрица 320 х 320, поле обзора 50 мм, траектория заполнения К-пространства — BLADE (охват 100 %). Получали также Т2ВИ с частотным подавлением сигнала жировой ткани в аксиальной проекции: Turbo Spin Echo, TR = 3310 мс, ТЕ = 51 мс, толщина среза 1 мм, 26 срезов, матрица 256 х 256, поле обзора 40 мм. Перед проведением МРТ животных наркотизировали хлоралгидратом натрия на физиологическом растворе в дозе 6 мг хлоралгидрата натрия на мышь. Время наступления наркотического сна варьировало от 4 до 10 мин. Снимали контрольные интактные картины МРТ в течение 20 мин в разных позициях. Далее животным вводили «Магневист» (препарат сравнения) или исследуемое соединение в количестве около 1 мг Gd/мышь (2 10^–3 ммоля «Магневиста», 1,5 10^–3 ммоля исследуемого К14-1) ретроорбитально и проводили МРТ в динамике (рис. 1, рис. 2, рис. 3, рис. 4). По окончании эксперимента животных эвтаназировали.

Для сравнительной оценки накопления препарата анализировали интенсивность сигнала в области опухоли до и после введения вещества К14-1 или «Магневиста» в одинаковых дозах 2 10^–3 ммоля Для этого на МР-снимках выделяли область опухоли и такую же область на контрлатеральной половине и считали среднюю интенсивность сигнала (Sl_с и Sl_n соответственно). Дополнительно также выделяли область вне лабораторного животного, чтобы оценить средний уровень шума (SN). Степень контрастирования (CNR) каждого препарата на определенный момент времени определяли по формуле.

Кроме того, проводили сравнительную оценку изменения уровня накопления гадолиния в опухоли и нормальной ткани. Для этого определяли нормированную по шуму интенсивность сигнала (SNR) от опухоли и от здоровой ткани в каждый момент времени:

График зависимости величины SNR от времени, прошедшего после внутривенного введения вещества К14-1 и «Магневиста» мышам с трансплантированной аденокарциномой молочной железы, приведен на рис. 5.

Биологические исследования

В работе использовали мышей линии C57BL/6 обоего пола массой 18-20 г и крыс линии Wistar обоего пола массой 150-200 г, полученных из питомника «Столбовая». Все животные имели ветеринарное свидетельство (форма № 1).

Выбор экспериментальных моделей проводили в соответствии с требованиями по экспериментальному изучению новых лекарственных средств [9, 10]. Для оценки визуализирующей способности синтезированных соединений методом МРТ были взяты три линии мышиных опухолевых клеток различного гистологического происхождения, полученные из банка клеточных культур РОНЦ им. Н. Н. Блохина: эпидермоидная карцинома легких Льюиса LLC1, аденокарцинома молочной железы Са755 и меланома B16F10.

Трансплантацию опухолевых клеток животным проводили в соответствии с общепринятыми требованиями [9, 10, 11]. Суспензию опухолевых клеток (4 10⁶ клеток на мышь) вводили под кожу бедра. После достижения опухолей одинакового размера (диаметр около 1 см) животных использовали в дальнейших экспериментах.

Оценка острой токсичности. Исследуемые комплексы вводили внутривенно в дозах 3 000, 6 000, 9 000, 12 000 и 15 000 мг/кг однократно. Срок наблюдения за животными составлял 30 сут. Критериями оценки острой токсичности служили число павших животных и сроки их гибели [9].

Оценку цитотоксичности используемых веществ проводили в соответствии с руководством [9] с применением МТТ-теста [12]. Развитие окраски регистрировали с помощью определения оптической плотности при длине волны 530 нм на планшетном фотометре (анализатор иммуноферментных реакций АИФР-01 УНИПЛАН, ЗАО «ПИКОН», Россия). Отношение средней оптической плотности для данной концентрации вещества к средней оптической плотности в контроле принималось как доля выживших клеток. Достоверность отличия образцов от контроля и друг от друга оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни при р <0,05.

Приготовление фибробластов. Извлекали в асептических условиях теменную кость новорожденной крысы. После декапитации и стерилизации поверхности последовательно удаляли кожу и отделяли теменную кость, которая состоит из активно пролиферирующих клеток. Теменную кость площадью 1 см² переносили в бюкс со средой DMEM (НПП «ПанЭко», Россия) и измельчали на фрагменты 1-2 мм³. Затем среду с фрагментами ткани наносили на дно плоскодонных культуральных флаконов Costar (Corning, США) объемом 50 мл и площадью дна 25 см², расположенных под наклоном 45°, инкубировали 30 мин при 37 °C. Прикрепление фрагментов первоначально происходит за счет их адгезии к наклонной поверхности. Через 30 мин среду удаляли, переводили флаконы в горизонтальное положение и вносили 10 мл питательной среды (DMEM с добавлением 20 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл L-глутамина и 40 мкг/мл гентамицина сульфата).

Культивирование фибробластов осуществляли в стерильных условиях, клетки инкубировали при 37 °C в условиях 5 % СО₂. Работа производилась в ламинарном боксе LC (ЗАО «Ламинарные системы», Россия). Через неделю наблюдали образование на поверхности флакона участков клеточного монослоя. Клетки для равномерного распределения подвергали обработке трипсином и еще через 1 нед. получали монослойную культуру.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ GrapthPad Prism (GraphPad Software, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты измерения Т₁-релаксивности полученных образцов Gd-ДТПА-ЦД и препарата «Магневист» приведены в табл. 1. Из них следует, что величина Т₁-релаксивности у всех полученных образцов выше, чем у препарата «Магневист», однако наибольшая релаксивность была зафиксирована у образцов К14-1, К13-1 и К13-2. Синтезированное производное β-ЦД, шифр К14-1, обладает рядом преимуществ относительно препарата сравнения: его Т₁-релаксивность почти на 50 % выше, чем у «Магневиста», а концентрация гадолиния в его лекарственной форме ниже таковой у «Магневиста» на 40 %. Это позволяет добиваться одинаковых результатов по визуализации опухолей при снижении необходимой дозы гадолиния и, соответственно, риска развития осложнений.

Работы с животными проводили в соответствии с международными рекомендациями [13]. Внутривенное введение исследуемых образцов крысам при оценке острой токсичности в дозах 3 000-6 000 мг/кг не оказывало токсического воздействия как на самцов, так и на самок. Летальный эффект наблюдали у самцов и самок, начиная с дозы 9 000 мг/кг массы тела. Гибель животных наступала не ранее первых суток после введения. У животных, получивших сублетальные дозы, на протяжении всего срока наблюдения не происходило потери массы тела. При аутопсии животных визуализированных изменений внутренних органов не отмечено. Самцы были более чувствительны к Gd-ДТПА-ЦД по сравнению с самками (в дозах 12 000,15 000 мг/кг массы тела выжило 2 из 6 самок и 1 из 6 самцов). Величина LD₅₀ составила (7 ± 1) ммоль/кг.

Образец К14-1 не проявлял достоверной токсичности относительно фибробластов крысы во всех изученных концентрациях (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

По основным критериям, определяющим визуализационную способность соединений в методе МРТ, таким как максимальное содержание парамагнитного иона Gd³⁺ и наибольшая величина релаксивности (табл. 1), для in vivo оценки диагностической способности в МРТ были отобраны образцы К13-1, К13-2, К14-1, К14-2. Наилучшие результаты получены при визуализации указанных экспериментальных опухолей при использовании соединения с шифром К14-1 (рис. 1, рис. 2, рис. 3, рис. 4). При сравнении диагностической информативности «Магневиста» и производного р-ЦД, шифр К14-1, видно, что качество визуализации патологического очага практически не отличается друг от друга, хотя вводимые количества гадолиния в составе Gd-ДТПА, соединенной с β-ЦД ковалентной связью, на 40 % меньше, чем в случае «Магневиста». Следует отметить, что при одинаковом введенном количестве Gd животным с трансплантированными опухолями производное β-ЦД, шифр К14-1, повышает магнитно-резонансный сигнал в хорошо васкуляризованных опухолях, например в аденокарциноме молочной железы Са755, в большей степени, чем «Магневист», что является существенным преимуществом производного β-ЦД (рис. 5).

Оценку цитотоксической активности проводили по жизнеспособности клеток в присутствии различных концентраций К14-1 и препарата сравнения «Магневист» на культурах опухолевых клеток: эпидермоидная карцинома легких Льюиса LLC1; меланома В16; аденокарцинома молочной железы Са755. Результаты всех тестов по определению цитотоксической активности К14-1, проведенных на клеточных линиях B16F10, LLC1, Са755, показали схожие результаты торможения роста клеток: IС₅₀ = (1 ÷ 2) 10^–4 М; IС₅₀ = (0,2 ÷ 0,5) 10^–4 М. Поскольку рассчитанное значение IС₅₀ для К14-1 укладывается в принятые требования для цитотоксичности активных соединений (IС₅₀ ≤ 10^–4 М), можно констатировать, что полученное соединение, шифр К14-1, не обладает выраженной цитотоксичностью.

Объектом для оценки биологической активности соединений гадолиния были также нормальные фибробласты теменной кости крысы. Они легко поддаются культивации in vitro и позволяют поддерживать культуру на протяжении длительного времени. Фибробласты являются тест-объектом при оценке токсичности различных соединений [10].

Образец К14-1 не проявлял достоверной токсичности относительно фибробластов крысы. Наибольшую токсичность на фибробластах показал «Магневист». В концентрации 10 и 1 % «Магневист» снижал жизнеспособность клеток на 83 и 27 % соответственно (табл. 2).

ВЫВОДЫ

Контрастное средство для МРТ-исследований — препарат «Магневист» и модифицированный комплекс Gd-ДТПА-ЦД (образец К14-1) обладают близкой визуализационной способностью у мышей с экспериментальными опухолями.

Образец К14-1 отличается оригинальностью, имеет простую схему получения, обладает высокой релаксивностью, что позволяет вводить в организм гадолиния на 40-50 % меньше по сравнению с «Магневистом», и тем самым снизить вероятность проявления побочных эффектов, в частности, нефрогенного системного фиброза. Преимуществом Gd-ДТПА-ЦД перед «Магневистом» является более высокое контрастное усиление изображения высоковаскуляризованных опухолей.