Нейросенсорная несиндромальная тугоухость — наследственное заболевание (OMIM #220290), связанное с врожденным нарушением слуховой функции. Среди наследственных нарушений слуха в развитых странах чаще всего встречается аутосомно-рецессивная несиндромальная тугоухость, связанная с мутацией в гене GJB, кодирующем белок коннексин 26. Известно более 90 мутаций гена GJB2, ассоциированных с тугоухостью, однако для популяций России и Европы наиболее значимой является мутация 35delG, приводящая к появлению преждевременного стоп-кодона. Частота носительства мутации GJB2:35delG может варьировать от 1 : 100 до 1 : 30 для европейских популяций и от 1 : 50 до 1 : 25 для некоторых российских популяций [1, 2, 3, 4, 5].

Галактоземия — наследственное заболевание, обусловленное пониженной активностью ферментов, участвующих в превращении галактозы в глюкозу. Галактоза поступает в организм с пищей в составе дисахарида лактозы (молочный сахар). Считают, что патологические повреждения обусловлены накоплением в клетках больных больших количеств галактозо-1-фосфата, что приводит к нарушению клеточного метаболизма. Наибольшие изменения возникают в печени, почках, хрусталике глаза, мозге. Без лечения больные погибают в первые месяцы жизни от инфекций, сепсиса или печеночной недостаточности, у всех больных развивается умственная отсталость с характерными нарушениями речи (хаотичная речь). При раннем назначении диеты дети могут развиться нормально. В основе патогенеза болезни — снижение активности фермента галактозо-1-фосфат уридилтрансферазы, обусловленное мутациями в гене GALT. В норме фермент катализирует продукцию глюкозо-1-фосфата и уридилдифосфат-галактозы из галактозо-1-фосфат и уридилдифосфат-глюкозы. Галактоземия наследуется по аутосомно-рецессивному типу, в российской популяции встречается в среднем у 1 на 20 000 новорожденных. Наиболее значимыми для российской популяции являются мутации Q188R, K285N, M142K, L358P, IVS3-2A>C [6, 7].

Целью данного исследования было установление частоты распространенных в российской популяции мутаций в генах GJB2 и GALT у доноров первичной кроводачи, идентифицирующих себя как русских и постоянно проживающих на территории Российской Федерации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве материала для настоящего исследования использовали коллекцию периферической крови 1000 здоровых индивидов (доноров первичной кроводачи, идентифицирующих себя как русских).

Выделение ДНК проводили из 0,1 мл периферической крови при помощи набора реагентов «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» («ДНК-Технология», Россия). Методика выделения основана на лизисе биоматериала с последующими сорбцией ДНК на носителе, отмывке примесей, элюцией ДНК с сорбента. Полученные образцы ДНК сразу использовали для генотипирования либо хранили при −20 °С. Концентрация ДНК, определенная на специализированном флуориметре Qubit (Invitrogen, США), составляла в среднем 50–100 мкг/мл.

Определение замен одиночных нуклеотидов проводили с использованием комплекта реагентов «Скрининг моногенных заболеваний» («ДНК-Технология», Россия). Принцип их действия основан на применении метода примыкающих проб (adjacent probes, kissing probes) [8, 9]. Комплект реагентов позволяет выявлять 5 мутаций в гене GJB2, ассоциированные с развитием несиндромальной нейросенсорной тугоухости, а также 1 мутацию в гене GALT, ассоциированную с развитием галактоземии.

В каждый из комплектов реагентов входят амплификационные смеси для определения конкретной мутации. Каждая из смесей содержит праймеры, общие для дикого и мутантного вариантов нуклеотидной последовательности, один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции и два сиквенс-специфичных олигонуклеотида (пробы), несущих различные флуорофоры. Олигонуклеотидные пробы, соответствующие тому или иному варианту последовательности, мечены различными флуорофорами, что позволяет определять оба варианта в одной пробирке.

При идентификации замен одиночных нуклеотидов проводили ПЦР, затем понижали температуру реакционной смеси для гибридизации полученной матрицы с олигонуклеотидными пробами. Определение генотипа выполняли после ПЦР и гибридизации путем измерения уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Данное измерение проходило в режиме «реального времени», в результате были получены кривые плавления (рисунок). Если анализируемый образец содержал только один вариант нуклеотидной последовательности гена, т. е. был гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для пробы, образующей совершенный дуплекс, была существенно выше, нежели для пробы, образующей несовершенный дуплекс. Если же анализировали гетерозиготный образец, содержащий оба варианта нуклеотидной последовательности, оба варианта проб могли образовать совершенный дуплекс, поэтому температуры их плавления были практически одинаковы.

Применяемый подход выгодно отличается от большинства молекулярно-генетических методов определения полиморфизмов одиночных нуклеотидов, в т. ч. использующих технологию TaqMan. Определение генотипа происходит дважды, независимо по двум каналам флуоресценции, что существенно повышает надежность генотипирования и практически нереализуемо другими способами.

Полимеразную цепную реакцию и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора DTprime («ДНК-Технология», Россия). Использовали следующий температурный режим амплификации: 94 °С — 10 с, 64 °С — 30 с в течение 50 циклов. По завершении реакции амплификации реакционную смесь остужали до 25 °С со скоростью 2 °С/с. Кривые плавления получали следующим образом: температуру реакционной смеси повышали с 25 до 75 °С с шагом в 1 °С, измеряя уровень флуоресценции на каждом шаге. В ходе выполнения работы применяли комплекс отечественного оборудования для автоматизирования основных этапов проведения исследований, что позволило проводить генотипирование до 100 образцов по 40 мутациям в день.

В качестве подтверждающего метода проводили выборочное автоматическое секвенирование ДНК по Сэнгеру с применением автоматического секвенатора ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США), использовали реактивы и рекомендации производителя. Во всех случаях были получены идентичные результаты генотипирования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полученные результаты по частотам встречаемости мутаций в генах GJB2 и GALT у 1000 здоровых индивидов (доноров первичной кроводачи, идентифицирующих себя как русских и постоянно проживающих на территории Российской Федерации) представлены в таблице. При генотипировании 1000 доноров первичной кроводачи были обнаружены 37 носителей мутаций в гене GJB2, ассоциированных с развитием нейросенсорной тугоухости (частота в выборке составила 3,7 %, или 1 : 27) и 6 носителей мутаций в гене GALT, ассоциированных с развитием галактоземии (частота в выборке — 0,6 %, или 1 : 167). Выявлен 1 случай сочетанного носительства мутаций. Всего обнаружены 42 носителя мутаций в генах GJB2 и GALT (частота в выборке — 4,2 %, или 1 : 24).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Всего обнаружены 42 носителя мутаций в генах GJB2 и GALT (частота в выборке — 4,2 %, или 1 : 24), при этом в нашем исследовании выявлен 1 случай сочетанного носительства мутаций. Результаты настоящего исследования в целом согласуются с опубликованными данными для российской популяции [1, 3, 4, 5], но нами была получена несколько более высокая, чем в среднем для европейских популяций, частота носительства мутации GJB2:35delG — единственной из обнаруженных в данном исследовании мутаций, ассоциированных с несиндромальной тугоухостью.

ВЫВОДЫ

В результате исследования были установлены частоты распространенных в российской популяции мутаций в генах GJB2 и GALT у здоровых индивидов. Всего обнаружены 42 носителя мутаций (частота в выборке — 4,2 %, или 1 : 24). Подобная достаточно высокая частота распространения носительства наследственных заболеваний позволяет сделать предположение о необходимости проведения не только неонатального скрининга, но и молекулярно-генетической диагностики в составе комплекса мероприятий при планировании беременности, в том числе при решении вопроса о применении вспомогательных репродуктивных технологий для преодоления бесплодия.

Наиболее подходящей платформой для таких исследований является ПЦР «в реальном времени». Данный подход открывает принципиально новые возможности для массового высокопропускного генотипирования, позволяет роботизировать работу лаборатории при высокой надежности получаемых результатов.