ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
Вестник РГМУ
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОБЗОР
Возникновение новых инфекций в XXI веке и способы их идентификации с использованием высокопроизводительного секвенирования (NGS)
Информация об авторах
1 Отдел физических методов измерения, НИИ физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского,
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва
2 Факультет биоинформатики и биоинженерии,
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва
3 Лаборатория трансляционной биомедицины,
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи, Москва
Для корреспонденции: Макаров Валентин Владимирович
ул. Ленинские горы, д. 1, стр. 40, г. Москва, 119991; moc.liamg@enitnelavvorakam
Информация о статье
Финансирование: работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований, грант № 15–54–04004.
Вклад всех авторов в работу равнозначен: подбор и анализ литературы, планирование структуры статьи, интерпретация данных литературы, подготовка черновика рукописи, внесение исправлений, проверка соответствия ссылок контексту в рукописи, литературная правка.
Статья получена: 03.02.2017
Статья принята к печати: 08.02.2017
Опубликовано online: 11.03.2017
|
Вспышки инфекционных заболеваний представляют собой постоянную угрозу для глобального здравоохранения. Обнаружению и изучению новых возбудителей уделяют много внимания, примеры — коронавирус ближневосточного респираторного синдрома, вирус Эбола в Заире или вирус Зики в Южной Америке. Факторы, влияющие на появление новых патогенов, приведены в таблице. Тем не менее значительно чаще эпидемии вызывают известные патогены, такие как полиовирус, грипп или холерный вибрион.
Большинство эпидемий возникает из-за внешних, климатологических или географических, факторов. Однако иногда их причиной становится антропогенное воздействие. К примеру, некоторые из зоонозов переходят к человеку, потому что исчезают места обитания их природных резервуаров — животных-хозяев. Вырубка лесов в горных районах может привести к наводнениям и затоплению населенных пунктов, что косвенно приводит к вспышкам холеры и других инфекционных заболеваний. Отдельной категорией таких «антропогенных» эпидемий являются целенаправленные манипуляции с патогенами, к примеру, утечка из лабораторий модифицированных биологических агентов, которые либо сами по себе, либо в результате горизонтального переноса генов вирулентности от других биологических объектов могут становиться серьезной биологической угрозой. Механизмы появления новых патогенов приведены на рис. 1.
К сожалению, на сегодняшний день отсутствуют четкие алгоритмы и готовые коммерческие приложения для идентификации новых патогенных организмов, поэтому в случае их возникновения задачи идентификации и определения характеристик патогена приходится решать с помощью индивидуальных лабораторных подходов. В обзоре подробно рассматриваются случаи возникновения новых инфицирующих агентов в XXI веке, а также обсуждается возможность разработки унифицированного подхода к выявлению патогенов с использованием новых технологий секвенирования.
Примеры и механизмы появления новых патогенов в XXI веке
Новые коронавирусы
В XXI веке человечество уже столкнулось с появлением как минимум 9 новых патогенов (рис. 2). Так, одним из глобальных вызовов мировой системе здравоохранения стало появление в 2002 г. в Китае нового, неизвестного ранее возбудителя атипичной пневмонии. В ноябре 2002 г. в г. Фошан провинции Гуандун скончался фермер, и, хотя диагноз не был точно установлен, стало ясно, что он пал жертвой нового опасного заболевания. Первым этапом признания начала эпидемии стало 27 ноября 2002 г., когда канадская Глобальная разведывательная сеть по здравоохранению (Global Public Health Intelligence Network), являющаяся частью Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), выпустила оповещение о начале серьезной эпидемии в Китае. Затем ВОЗ, после того как получила результаты расследования о вспышке заболевания, запросила информацию у китайских властей. Но об эпидемии стало по-настоящему широко известно только после выхода заболевания за пределы Китая: в феврале 2003 г. в госпитале Ханоя скоропостижно скончался американский бизнесмен, заразившийся пневмонией в Китае. Скорость, с которой новое заболевание вызвало его смерть, поразила общественность. К 15 марта заболевание было названо тяжелым острым респираторным синдромом (ТОРС) [1, 2, 3], а к 27 марта возбудитель был идентифицирован как совершенно новый коронавирус и был назван коронавирусом ТОРС [4, 5, 6]. С ноября 2002 г. по июль 2003 г. ТОРС перенесли в общей сложности 8 098 пациентов в 25 странах, и 774 случая закончились смертью больных. В определенных популяциях [7] и возрастных группах [8] смертность была очень высокой и могла достигать 40–55 % от числа заболевших. Дальнейшие локальные вспышки заболевания были зарегистрированы в конце 2003 г. и начале 2004 г. в Сингапуре, Тайване, Пекине и Гуанчжоу в результате случайных лабораторных утечек и передачи вируса от животных к человеку [9]. Эти случаи были напрямую связаны с отменой запрета на разделку пальмовых куниц на рынках и в ресторанах, который был введен на время вспышки атипичной пневмонии [10].
Специфичные противовирусные агенты не были доступны во время борьбы со вспышкой ТОРС [11], и основными средствами являлись поддерживающая терапия и антибиотики для противодействия вторичной бактериальной инфекции [12]. При этом эпидемия атипичной пневмонии была локализована в первую очередь благодаря высокоэффективным мерам глобального общественного здравоохранения [13], среди которых были отслеживание контактов и карантин лиц с подозрением на инфекцию и зараженных пациентов [14]. В настоящий момент коронавирус ТОРС больше не циркулирует в человеческой популяции, но обнаружение природных резервуаров коронавирусов, предковых по отношению к короновирусу ТОРС, (летучие мыши и другие млекопитающие) свидетельствует о потенциальной угрозе повторного возникновения эпидемии [15].
Детекция нового вируса на тот момент была нетривиальной задачей, однако ученые успешно с ней справились. Клинические образцы от пациентов с ТОРС изучали с использованием клеточных культур и молекулярных методов. Вирус был выделен в культуре клеток, затем с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) со случайными (рандомными) праймерами была определена РНК вируса длиной до 300 нуклеотидов. Генетические характеристики вируса показали, что он лишь отдаленно родствен известным коронавирусам (сходство нуклеотидных последовательностей составило от 50 до 60 %). На основании идентифицированных последовательностей были созданы наборы для специфической высокочувствительной детекции нового вируса с помощью ПЦР и ПЦР в «реальном времени» (ПЦР-РВ). Вирус обнаруживался в различных клинических образцах от пациентов с ТОРС, но не в образцах контрольной группы. Высокие концентрации вирусной РНК (до 100 млн молекул на 1 мл) были найдены в мокроте зараженных пациентов. В чрезвычайно низких концентрациях РНК вируса была также обнаружена в плазме крови пациентов с острой фазой заболевания и в кале в конце выздоровления [4]. Несмотря на то, что эпидемия ТОРС была успешно остановлена, этот коронавирус был не единственным представляющим определенную опасность для населения Земли коронавирусом, открытым в XXI веке.
В 2003 г. 7-месячный ребенок, госпитализированный с обструктивным бронхитом и конъюнктивитом, был обследован на присутствие в организме нескольких респираторных вирусов с целью выявления возбудителя, однако все методы диагностики дали отрицательные результаты. Группа исследователей во главе с Лией ван дер Хук использовала модифицированный метод определения вирусов, основанный на анализе полиморфизмов длин фрагментов рестрикции вирусной кДНК (Virus-Discovery-cDNA-AFLP, VIDISCA). Данный метод основан на ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) вирусной РНК с последующим ограниченнным расщеплением кДНК с помощью частощепящих рестриктаз. Результаты показали определенное сходство обнаруженных последовательностей с последовательностями известных коронавирусов, тем не менее различия были достаточными, чтобы указать на открытие нового вида коронавируса, позднее названного коронавирусом человека NL63 [16].
71-летний пациент из Китая попал в больницу с пневмонией в январе 2004 г. Попытки размножить вирус в культуре клеток, ОТ-ПЦР и прямое обнаружение антигена из аспирата носоглотки указали на отсутствие в организме больного известных респираторных вирусов. ОТ-ПЦР на консервативную область гена полимеразы коронавирусов подтвердила наличие коронавируса, однако попытки культивирования возбудителя были безуспешными. Частичное секвенирование генома коронавируса показало высокую гомологичность его последовательности последовательностям других вирусов рода βCoV, включая HCoV-OC43, но она имела иное происхождение. Этот коронавирус человека, названный HCoV-HKU1, через некоторое время удалось выделить из аспирата другой пациентки [17]. Позднее также вирус удалось воспроизвести в культуре клеток реснитчатого эпителия дыхательных путей человека, однако его культивирование по-прежнему остается сложной задачей. С момента открытия HCoV-HKU1 удалось показать, что этот вирус распространен глобально, а ретроспективный анализ хранящихся назофарингеальных препаратов подтвердил его существование по крайней мере с 1995 г. [18].
В июне 2012 г. мир узнал о появлении совершенно нового штамма коронавируса человека. Образец мокроты был отобран у 60-летнего мужчины с тяжелым респираторным заболеванием доктором Сулейманом Факихом в больнице в Джидде (Саудовская Аравия). Анализы на распространенные вирусные респираторные инфекции не позволили выявить биологический агент, вызвавший заболевание. Образец мокроты был отправлен в Роттердам (Нидерланды), где вирус был идентифицирован как новый коронавирус, условно названный HCoV-EMC (человеческий коронавирус из Erasmus Medical College). Пациент позднее умер вследствие острой пневмонии и последующей почечной недостаточности [19]. С момента открытия этого патогена были определены и описаны в научной литературе несколько новых изолятов, в разных базах данных и СМИ — под разными названиями. Для изучения вируса была организована научная группа из вирусологов, занимающихся коронавирусами. Для того чтобы избежать путаницы в исследованиях для нового вируса было выбрано название «коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС)», которое было согласовано первооткрывателями вируса, ВОЗ и Министерством здравоохранения Саудовской Аравии [19].
С июня 2012 г. и до 7 февраля 2014 г. были зарегиcтрированы 182 случая заболевания БВРС, из которых 79 закончились смертельным исходом. По данным ВОЗ на 11 июня 2014 г., вирус вызвал 699 лабораторно подтвержденных случаев болезни, из которых 209 закончились смертью пациентов [20]. Статистика показывает, что в течение 4 месяцев число случаев заболевания увеличилось более чем в 3 раза, т. е. эпидемия далека от своего завершения. Летальность, составляющая до 30 %, значительно выше среди пациентов с сопутствующими заболеваниями: большое число случаев БВРС зарегистрировано у пациентов с иммунодефицитом или другими основными заболеваниями [21, 22]. Кроме того, существует серьезная угроза внутрибольничной передачи инфекции [23].
Клиническая картина заболевания похожа на симптомы ОРВИ и включает ряд патологических состояний дыхательных путей с такими распространенными симптомами, как кашель, лихорадка и желудочно-кишечные нарушения [24], до начала пневмонии [21]. При БВРС также наблюдались острый респираторный синдром (ОРС), почечная недостаточность, перикардит и диссеминированное внутрисосудистое свертывание [24]. Вероятность пандемической вспышки невелик, т. к. вирус, по всей видимости, неспособен к эффективной передаче от человека к человеку [24] и передается только при устойчивом контакте [25], например, в семьях [26], среди медицинских работников [27] и в результате внутрибольничной передачи [28], особенно если у пациента ослаблен иммунитет.
Происхождение этого вируса пока до конца непонятно. Возможно, произошла первичная передача инфекции от верблюда к человеку.
Таким образом, за последнее десятилетие было открыто 4 новых коронавируса, два из которых являются крайне опасными, в то время как два других были обнаружены почти случайно и практически не выделялись на фоне ОРВИ. Эти данные указывают на то, что появление новых высокопатогенных штаммов — событие весьма вероятное, для которого порой достаточно нескольких нуклеотидных замен в составе генома вируса.
Метапневмовирус человека
В 2001 г. новый вирус был выявлен у 28 пациентов в Нидерландах. Симптомы заболевания, вызванного им, были похожи на симптомы заболевания, вызываемого респираторно-синцитиальным вирусом (РСЧ). Нескольким пациентам потребовалась госпитализация и даже подключение к системе искусственной вентиляции легких. Вирусные изоляты были культивированы в культурах клеток почек человекообразных обезьян (tМК), и цитопатические эффекты, вызванные вирусом, были во многом идентичны тем, что вызывает РСЧ. Электронная микроскопия супернатанта зараженных клеток выявила парамиксовирусоподобные частицы. Однако результаты ПЦР-РВ с праймерами для детекции известных парамиксовирусов были отрицательными. Тогда для получения информации о последовательности неизвестного вируса использовали ОТ-ПЦР с рандомными праймерами. На основании сходства последовательностей и организации генов заключили, что исследуемый вирус является ближайшим родственником птичьего пневмовируса; его идентифицировали как новый вид рода Metapneumovirus — метапневмовирус человека (МПВЧ) [29], и он стал первым вирусом этого рода, способным инфицировать людей. Хотя МПВЧ был обнаружен только в 2001 г., филогенетический анализ показал, что вирус циркулировал в человеческой популяции в течение примерно 50 лет [30, 31]. От 7 до 19 % всех случаев респираторных инфекций у детей (и госпитализированных, и получавших помощь амбулаторно) были обусловлены МПВЧ [32, 33, 34]. Как сообщается, этот вирус является вторым по частоте обнаружения среди вирусов, вызывающих инфекции дыхательных путей [35].
Бокавирус человека
Первый бокавирус человека (hBoV) был обнаружен в 2005 г. в назофарингеальном аспирате 282 пациентов с неидентифицированной инфекцией нижних дыхательных путей в Швеции. Исследователи использовали новый метод, который включал этапы обработки образцов ДНКа- зой, чтобы исключить их загрязнение невирусными нуклеиновыми кислотами, с последующей ОТ-ПЦР с неспецифическими праймерами. Анализ полученных последовательностей с помощью методов биоинформатики выявил присутствие в образцах нового парвовируса, высокогомологичного парвовирусам быков и собак (отсюда название рода — Bocavirus). Новый вирус был назван hBoV1 [36]. Три других штамма hBoV были обнаружены в 2010 г. и названы hBoV2, hBoV3 и hBoV4 [37, 38, 39].
HBoV1 — это возбудитель респираторных заболеваний, присутствующий во всех регионах планеты и связанный с примерно 19 % всех вирусных инфекций верхних и нижних дыхательных путей [40, 41, 42]. HBoV1 эффективно инфицирует культуру эпителиальных клеток дыхательных путей человека и приводит к их цитолизу [43, 44, 45]. Эти данные подтверждаются клиническими наблюдениями, указывающими на то, что инфекция действительно проходит в форме респираторного заболевания. Напротив, hBoV2–hBoV4 локализуются в желудочно-кишечном тракте, при этом hBoV2 и, возможно, hBoV3, связаны с гастроэнтеритами [46, 47]. Интересно, что HBoV2 — единственный кишечный бокавирус, изолированный из назофарингеального аспирата, и, следовательно, может также быть связан с респираторными заболеваниями [48, 49]. HBoV1 обнаруживается во всех возрастных группах, но преимущественно среди детей в возрасте от 6–24 мес. [50, 51] и редко — среди взрослых [52, 53, 54, 55, 56]. Передача вируса и заражение им происходят в течение всего года, но чаще в зимние и весенние месяцы [55, 57, 58, 59].
Вирус гриппа
Другим механизмом появления новых патогенных вирусов является рекомбинация их геномов. Характерным примером служит вирус гриппа (ВГ) человека с сегментированным РНК-геномом, который характеризуется высокой изменчивостью. При заражении несколькими различными штаммами ВГ возможна реассортация геномных РНК этих штаммов и образование новых вариантов ВГ с новыми патогенными свойствами. Постоянные изменения в составе двух поверхностных антигенов (гемагглютинина и нейраминидазы) определяют эпидемиологию вируса гриппа.
Водные птицы являются естественными резервуарами ВГ, в которых, похоже, вирус достиг текущего эволюционного статуса в ходе ряда адаптаций. Отряды гусеобразных и ржанкообразных являются исходными хозяевами ВГ с самым высоким разнообразием штаммов: 17 подтипов по гемаглютинину и 9 подтипов по нейраминидазе [60]. Передача вируса наземным птицам или млекопитающим привела к его быстрой эволюции [61]. Некоторые варианты ВГ циркулируют в человеческих популяциях (H1N1, H3N2), среди свиней (H1N1, H1N2), лошадей (H3N8, H7N7) и собак (H3N8) [62]. Свиньи стали одним из главных резервуаров для возникновения пандемических штаммов ВГ вследствие того, что они имеют рецепторы как для ВГ птиц, так и для ВГ человека (2,3-сиаловые кислоты и 2,6-сиаловые кислоты соответственно) [63, 64]. Свиньи — эффективные «смесительные емкости» для вируса, источник новых реассортантных вариантов, которые обладают смешанными (рекомбинантными) геномами и способны вызвать очередную пандемию [61].
Пандемия — самое страшное проявление вируса гриппа, когда заражены одновременно 20–40 % человеческой популяции по всему миру. Одна из первых документально зафиксированных пандемий вируса гриппа произошла в 1918 г., когда от смертельной «испанки» (штамм H1N1) погибли 25 млн человек [60]. За ней последовали «азиатcкий грипп» (штамм H2N2) в феврале 1957 г., «гонг-конгский грипп» (штамм H3N2) в 1968 г., «русский грипп» (штамм H1N1) в 1977 г. и «свиной грипп» (штамм H1N1) в 2009 г. Последний стал первой и пока единственной пандемией XXI века. Штамм H1N1 являлся реассортантом между евразийским вирусом свиного гриппа и североамериканским тройным реассортантом H1N2 [65, 66]. По сравнению со своим зловещим предком он относительно менее вирулентен, но все-таки стал причиной смерти от дыхательной и сердечно-сосудистой недостаточности более 200 и 83 тыс. человек соответственно [67].
С момента идентификации нового штамма вируса птичьего гриппа H7N9 30 марта 2013 г. китайскими властями были зарегистрированы 135 лабораторно подтвержденных случаев инфекции и 45 смертей, данные о которых поступили из Шанхая, Аньхоя, Цзянсу и Чжэцзяня [68]. Единственный случай заболевания за пределами Китая был зафиксирован в Тайване, но и тогда первичное заражение произошло в Китае [69]. Это первые случаи инфицирования людей вариантом H7N9 вируса птичьего гриппа [70, 71]. Ранее нелетальные вирусные инфекции, вызванные штаммами вируса гриппа подгруппы Н7 (H7N2, H7N3, H7N5), наблюдались по всей Европе и в США [72]. Исключением стала единственная смерть от штамма H7N7 в Нидерландах в 2003 г. [73, 74]. Интересно, что указанные инфекционные вспышки совпадали со вспышками гриппа у домашней птицы, но для варианта H7N9 такая закономерность отмечена не была. Случаи заражения H7N9 не выглядят эпидемиологически связанными, но возможность передачи инфекции от человека к человеку, по всей видимости, все же существует [75]. Задержки в развитии серологических реакций у лиц, инфицированных штаммом H7N9, осложняют серологическую детекцию вируса [76]. Кроме того, у домашней птицы отмечено латентное течение заболевания (в отличие от инфекции, вызываемой штаммом H5N1), что существенно затрудняет определение источника и способа передачи патогена и, следовательно, увеличивает риск пандемии.
Кишечная палочка, продуцирующая шига-токсин
Еще одним вариантом возникновения новых патогенных организмов является приобретение хорошо известными организмами новых свойств, таких как продукция токсинов или устойчивость к антибиотикам. Примером результата такой генетической перестройки является эпидемия, которая была вызвана штаммом О104:Н4 энтерогемморагической кишечной палочки в 2011 г. в Германии. Это была самая серьезная вспышка инфекции из когда-либо зарегистрированных, вызванных кишечной палочкой, продуцирующей шига-токсин (шига-токсин продуцирующая кишечная палочка, ШПКП): в общей сложности были зафиксированы 3 842 случая инфекции, в том числе 2 987 случаев лабораторно подтвержденного гастроэнтерита (из них — 18 смертей) и 855 случаев гемолитико-уремического синдрома (35 смертей) [77]. Вспышка началась 8 мая, достигла своего пика 22 мая и 4 июля полностью закончилась. Возможно, эпидемию удалось остановить путем предупреждения людей о потреблении ими загрязненных продуктов питания, но также возможно, что зараженные продукты просто перестали поступать на рынки. Были публично раскритикованы запоздалые и вначале ложные заявления о связи инфекции с огурцами и капустой, которые на деле не имели к ней отношения [77]. 10 июня в качестве источника инфекции немецкими властями были объявлены проростки пажитника, импортировавшиеся из Египта [78].
Эпидемиологический анализ инфекции, изначально передающейся через пищу, становится сложнее производить, когда патоген начинает передаваться от человека к человеку. Такой способ инфицирования был отмечен примерно в 20 % домохозяйств с первичным пациентом, инфицированным через пищу хорошо охарактеризован- ным родственным штаммом энтерогемморагической кишечной палочки O157:H7 [79]. Вторичная передача в быту у взрослых пациентов также была выявлена и для штамма O104:H4 во Франции [80] и Нидерландах [81] за счет наблюдавшейся задержки начала инфекции по сравнению со стандартным временем инкубации (от 7 до 9 дней для O104:H4). Вторичные трансмиссии также были отмечены в Гессене (Германия), который находился за пределами главного очага эпидемии на севере страны [82]. Исследования также документально подтвердили передачу инфекции не только в семьях, но и в больницах и даже в микробиологической лаборатории.
Секвенирование генома штамма О104:Н4, обнаруженного в Германии, было выполнено в кратчайшие сроки сразу несколькими группами исследователей. Первая последовательность была получена в Пекинском институте геномики, где изучали образец, переданный исследователями из Университета Гамбурга. Китайские ученые выполнили секвенирование генома бактерии за 3 дня, используя платформу Ion Torrent. Первая аннотированная последовательность генома была опубликована группой из Геттингенского университета. При этом были использованы геномные секвенаторы Flex [83], Ion Torrent [84] и PacBio RS [85]. Важно, что в результате использования комбинированного подхода с применением нескольких технологий высокопроизводительного секвенирования было достигнуто высокое качество сборки (по длине прочтения, по числу ошибок в последовательностях, по числу пропусков и пр.). Картирование последовательностей продемонстрировало сходство полученного штамма с четырьмя другими штаммами энтерогемморагической кишечной палочки, вызвавшими вспышки инфекций, в том числе штаммом энтероагрегативной кишечной палочки (ЭАКП), выделенной в конце 1990-х гг. у проживавших в Центральной Африке пациентов с ВИЧ-инфекцией, которые страдали от постоянной диареи [86]. Однако африканский штамм не содержал профага Stx2 [84]. Mellmann и соавт. предложили схему эволюции штамма O104:H4, согласно которой предковый штамм преобразовался в O104:H4 вследствие удаления и приобретения мобильных ДНК-элементов путем горизонтального переноса [83]: немецкий вариант патогена получил плазмиды, несущие гены одного из типов фимбрий/пилей (ААР/I), и потерял плазмиды, несущие гены фимбрий AAF/III и термостойкого энтеротоксина Аста, а, кроме того, приобрел плазмиду, несущую гены ферментов TEM-1 и CTX-M-15, определяющих устойчивость к антибиотикам. Сравнение эпидемических штаммов между собой также показало наличие крупномасштабных делеций, вставок и инверсий между изолятами, подтвердив, таким образом, существенную геномную мобильность. Исследователи также установили, что именно эти структурно различающиеся регионы содержат участки, кодирующие факторы вирулентности.
Почему штамм O104:H4 отличался крайне высокой вирулентностью? По результатам изучения генома и генов вирулентности оказалось, что у этого штамма необычное сочетание генов вирулентности из штаммов ШПКП (профаг Stx2, длинные полярные фимбрии, устойчивость к теллуритам, система потребления железа) и штаммов ЭАКП (AAF/I, регулятор транскрипции AggR, дисперсин Aap и энтеротоксин шигеллы Set1) [87]. Последние из описанных локализуются в основном на вирулентной плазмиде pAA [83]. Таким образом, в геноме O104:H4 два различных мобильных элемента, профаг Stx2 и плазмида pAA, обеспечивают вирулентность возбудителя, что достаточно необычно. Возможно, именно такое сочетание факторов вирулентности штаммов ШПКП и ЭАКП привело к появлению этого необыкновенно опасного патогена: он вызывает цитотоксическое повреждение эпителия кишечника, облегчающее системную адсорбцию шига-токсина, что, в свою очередь, может объяснить высокую распространенность случаев гемолитико-уремического синдрома в ходе эпидемии в Германии. Несмотря на наличие в геноме штамма O104:H4 двух генов устойчивости к антибиотикам, эпидемиологическая ситуация, в частности, количество летальных исходов, была менее печальной, чем могла бы быть, если бы вирус обладал мультирезистентностью к более широкому ряду антибиотиков.
Антибиотикорезистентность и супербактерии
Штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) становятся все более распространенными причинами внутрибольничных инфекций, начиная с первых случаев в 1980-х гг. [88]. Многие страны, в том числе и Россия, столкнулись с растущим числом инфекций, устойчивых к лечению традиционными антибиотиками. Следует отметить, что основными очагами развития и распространения инфекций, вызываемых такими патогенами, как метициллин-устойчивый золотистый стафилококк, ванкомицин-устойчивый энтерококк и многие грамотрицательные бактерии с МЛУ, стали палаты интенсивной терапии [89].
Грамотрицательные бактерии, устойчивые к карбапенемам, являются одной из самых больших проблем. Карбапенемы — предпочитетельные препараты (препараты выбора, drug of choice) при лечении многих инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями [90]. Тем не менее широкое использование карбапенемов способствовало развитию устойчивости к ним среди этих патогенов. Наиболее часто встречающимися микроорганизмами, устойчивыми к карбапенемам, являются синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и энтеробактерии [91].
Синегнойная палочка вызывает тяжелые инвазивные заболевания у пациентов с ослабленным иммунитетом или находящихся в критическом состоянии. Изоляты P. aeruginosa, полученные от больных отделений интенсивной терапии, показывали устойчивость к карбапенемам примерно в 28–37 % случаев [92, 93]. А. baumannii также является одним из основных возбудителей внутрибольничных инфекций. Изначально этот патоген был восприимчив к имипенему в большинстве медучреждений. Затем его карбапенем-устойчивые штаммы показали быстрый рост во всем мире, и в некоторых отделениях интенсивной терапии в 50–60 % случаев внутрибольничные инфекции, вызванные ими, не поддаются лечению имипенемом [94, 95]. Многие энтеробактерии, широкий спектр бета-лактамаз-продуцирующих кишечных палочек и штаммы Klebsiella pneumoniae, устойчивые к карбапенемам, также являются проблемой в отделениях интенсивной терапии, поскольку карбапенемы считаются последним средством для лечения вызываемых ими инфекций [96].
Считается, что основной движущей силой выработки карбапенемовой устойчивости было интенсивное использование цефалоспоринов третьего поколения, азтреонама и имипенема. Появление в XXI веке полностью устойчивых к антибиотикам бактериальных штаммов, так называемых «супербактерий», — это серьезный вызов современной медицине. Новые опасные патогены могут возникать не только за счет приобретения генов устойчивости, но и за счет активации ряда «скрытых» генов устойчивости вследствие всего нескольких значимых нуклеотидных замен в них. Подобные генно-инженерные модификации — обычное явление для микроорганизмов. В этом контексте приобретает значимость изучение бактериального резистома — совокупности всех генов устойчивости микробиологического сообщества — для эффективного выявления и борьбы с патогенами.
Концепция резистома антибиотиков основана на понимании того, что почвенные актинобактерии и многие другие микроорганизмы являются высокопродуктивными производителями антимикробных соединений. Очевидно, что для сохранения жизнеспособности у микроорганизма должны возникать/развиваться не только механизмы защиты от антибиотиков, но и способность продуцировать антибиотики. В результате многие компоненты резистома развились задолго до того, как применение антибиотиков стало клинически значимым и распространенным [97]. Ряд исследований подтвердил это. Метагеномный анализ образцов древней ДНК, собранных из зоны вечной мерзлоты, продемонстрировал присутствие генов устойчивости к бета-лактамным, тетрациклиновым и гликопептидным антибиотикам [98]. Важным открытием явилось то, что, как оказалось, древние гены устойчивости к гликопептидам (vanHAX) филогенетически кластеризуются с современными последовательностями из гликопептид-продуцирующих организмов, а биохимический анализ одного из важнейших продуктов генов устойчивости к гликопептидам — VanА — показал, что его функции и 3D-структура существенно не изменились в течение тысячелетий [99]. В другом исследовании бактерии, собранные в пещерах, изолированных от поверхности в течение более четырех миллионов лет, оказались фенотипически устойчивыми к 14 различным антибиотикам [100]. Генотипирование и биохимические исследования показали, что гены устойчивости присутствуют в микробном пангеноме независимо от селективного давления со стороны человека [100].
Несмотря на то, что самостоятельное и древнее происхождение резистома стало очевидным, современное и довольно мощное селективное давление на его формирование и трансформацию в результате деятельности человека хорошо известно. Протогены устойчивости не формируют устойчивый фенотип, но имеют потенциал превращения в полноценные гены устойчивости в результате мутации и/или изменений в контексте. Мутации фермента, приводящие к переходу его из одного функционального класса в другой, представляются маловероятными, а вот изменение, в том числе расширение спектра субстратной специфичности ферментов при сохранении функции кажется более вероятным. Структурные исследования продемонстрировали эволюционную близость между линкозамидами и аминогликозиднуклеотидилтрансферазами и полимеразами, и это позволяет предположить, что предковые полимеразы являлись протогенами устойчивости, которые в процессе эволюции развились в эти антибиотико-модифицирующие гены [101].
По аналогии выявленные консервативные структурные элементы и биохимические механизмы позволяют предположить, что протеинкиназы и белковые ацетилтрансферазы имеют общих предков с протогенами устойчивости, из которых сформировались гены устойчивости к аминогликозидам [102, 103]. Более того, даже сами гены устойчивости могут быть протогенами устойчивости для других лекарственных препаратов. К примеру, аминогликозид- ацетилтрансфераза acc(60)-la-cr обеспечивает также устойчивость к хинолонам [102]. Предковый фермент acc(60)-la обеспечивает устойчивость к аминогликозиду канамицину, а мутаций двух аминокислотных остатков в его составе — Trp102Arg и Asp179Tyr — оказалось достаточно для распространения его субстратной специфичности на некоторые хинолоновые антибиотики, например ципрофлоксацин, причем без потери аминогликозид- ацетилтрансферазной активности.
Частота встречаемости протогенов устойчивости в резистоме неизвестна, и для приобретения ими клинической значимости требуются значительные эволюционные события. Однако приведенные выше примеры подчеркивают потенциал ферментов для расширения своего «портфолио» потенциальных субстратов и их возможную значимую роль в возникновении новых генов устойчивости.
Подобно протогенам устойчивости «молчащие» гены устойчивости не способны формировать резистентный фенотип в их текущем структурном состоянии. В отличие от протогенов эти гены могут быть детектированы в резистоме на основании гомологии между их последовательностями и последовательностями известных генов устойчивости. Например, два фенотипически чувствительных к антибиотикам штамма Citrobacter freundii, изолированые в эпоху до использования антибиотиков, содержат гены AmpC бета-лактамазы [103]. Мутации, приводящие к экспрессии AmpC в данных штаммах, сопровождаются клинической устойчивостью к цефалоспоринам расширенного спектра действия. Salmonella enterica дикого типа, культивируемая на богатой питательной среде, чувствительна к аминогликозидам стрептомицину и спектиномицину. Однако тот же штамм устойчив при выращивании на минимальной среде при активации гена aadA аминогликозид-аденилтрансферазы [104]. Когда aadA был суперэкспрессирован в индуцибельной плазмиде, минимальная ингибирующая концентрация стрептомицина также существенно увеличилась дозозависимым способом. Таким образом, общий уровень экспрессии гена устойчивости, вероятно, имеет решающее значение в процессе формирования устойчивого фенотипа.
Если мутация — это «рабочая лошадка» эволюции, то горизонтальный перенос генов — это «волшебная палочка», способная мгновенно преобразовать неактивный ген устойчивости в функциональный за счет увеличения числа копий гена или же изменения контекста, обеспечивающего экспрессию гена под «сильным» промотором. Однажды попав в состав мобильного элемента, гены устойчивости получают возможность фактически неограниченно распространяться по микробному пангеному, где они могут накапливать дальнейшие мутации, улучшающие функцию и расширяющие спектр возможных субстратов кодируемых ими ферментов, в ответ на селективное давление со стороны окружающей среды.
Чтобы оценить вклад генов, способных к горизонтальному переносу в составе генома патогенов человека, достаточно взглянуть на золотистый стафиллококк: на мобильные элементы приходится 15–20 % его генома, они включают бактериофаги, островки патогенности, плазмиды, транспозоны и стафилококковые кассетные хромосомы [105]. Эти мобильные элементы накопились в геноме возбудителя под селективным давлением, но их источник — бактерии, которые некогда сосуществовали с золотистым стафиллококком. В то время как детали сетевых взаимодействий между патогенными микроорганизмами и комменсалами остаются в значительной степени неясными, становится все более очевидным, что основные резервуары генов резистентности, доступные патогенам, находятся в человеческом микробиоме [106]. Например, функциональные метагеномные библиотеки, полученные из объединенных проб микробиомов кишечника от младенцев, детей и подростков, содержали данные о генах устойчивости к 14 антибиотикам [107]. Более того, все библиотеки содержали данные о генах устойчивости к тетрациклину, триметоприму, триметоприм-сульфаметоксазолу, D-циклосерину, хлорамфениколу и пенициллину, а многие — к аминогликозидам, глицилциклинам и бета-лактамам. Примерно 3 % от общего числа генов резистентности к антибиотикам в данных библиотеках оказались ассоциированы с мобильными элементами, такими как транспозоны или интегроны [108]. Последствия применения антибиотиков для кишечной микрофлоры активно изучаются. К примеру, удалось показать, что использование антибиотиков, особенно метронидазола и бета-лактамов, снижает общее микробное разнообразие в желудочно-кишечном тракте [108]. Подо