Биолюминесценция (БЛ) — это видимое свечение живых организмов. Этот феномен был впервые продемонстрирован in vitro более ста лет назад Dubois [1]. Исследователь смешивал полученные холодным и горячим способами вытяжки из тканей светящихся органов жуков Pyrophorus noctilucus. Экстракт, приготовленный в холодной воде, содержал термолабильный фермент люциферазу, а полученный в горячей воде экстракт содержал термостабильный люциферин. Таким образом, испускание света смесью двух экстрактов было результатом фермент-субстратной реакции. Термин «биолюминесценция» впервые использовал Harvey [2]. Во всех известных биолюминесцентных системах в реакции участвует кислород, в результате происходит образование продукта реакции — оксилюциферина. Переход молекулы оксилюциферина из возбужденного состояния в основное сопровождается световым излучением.

Биолюминесценция широко распространена в царствах животных и грибов, но люминесцентного растения в природе не известно ни одного [3]. Более 30 лет назад была предпринята первая попытка создания искусственного светящегося растения [4]. На основе хорошо изученной БЛ системы светляка было получено биоинженерное растение Nicotiana tabacum путем внедерения в него гена люциферазы. При смешении экстракта такого растения и раствора люциферина и АТФ или же при погружении интактного растения в указанный раствор обнаруживалось БЛ свечение. Изображение светящегося растения было продемонстрировано при его экспозиции на рентгеновской пленке. Позже было выполнено еще несколько работ [5, 6], а недавно даже открыт проект по созданию светящегося растения [7], но принципиально новых результатов не было получено. Результаты наших последних исследований БЛ высших грибов дали основание полагать, что можно достичь большего, используя особенности этой фермент-субстратной системы.

Если у животных биолюминесцентные системы специфичны для каждого таксона, то механизм люминесценции высших грибов, напротив, единообразен [8]. В 1961 г. в БЛ грибов было выделено два этапа [9]. Сначала предшественник люциферина восстанавливается НАД(Ф)Н-зависимым ферментом в истинный люциферин, который затем окисляется кислородом воздуха в результате катализируемой люциферазой реакции и производит видимое световое излучение с длиной волны 520–530 нм [10]. После многочисленных безуспешных попыток [11, 12] предшественник люциферина все же был выделен из плодового тела нелюминесцентного гриба Pholiota squarrosa; им оказался гиспидин (6-(3,4-дигидроксистирил)-4-гидрокси-2-пиранон) [13] — хорошо известный вторичный метаболит растений и грибов [14] (табл. 1). В этой же работе гиспидин удалось энзиматически преобразовать в люциферин, который оказался 3-гидроксилированным производным гиспидина [13] (рис. 1).

Из литературных источников известны работы по выделению гиспидина и его производных из таких растений, как Alpinia zerumbet [15, 16, 17], Pistacia atlantica [18], Peganum harmala [19], Pteris ensiformis Burm [20], Cassia alata [21], Rheum tataricum [22] и прочих (табл. 1). Широкая распространенность гиспидина среди растений и грибов, а также существование похожих соединений среди метаболитов растений натолкнуло нас на мысль о возможности создания автономно люминесцентного биоинженерного растения путем внедрения гена люциферазы в растение, способное синтезировать субстрат этого фермента. Как и другие метаболиты растений, производные гиспидина сейчас являются объектом пристального внимания исследователей, работающих в области фармацевтики. Гиспидин и его производные проявляют биологическую активность, имеют антиоксидантные и противоопухолевые свойства, а также способны предотвращать ожирение, и они рассматриваются в качестве возможной основы для разработки лекарственных средств [16, 17, 18, 19].

Целью нашей работы был поиск субстрата(ов) реакции грибной биолюминесценции в растениях, произрастающих в европейской части России, и выделение соответствующих активных соединений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экстракты растений

Все образцы растений были собраны в июне 2015 г. на биостанции «Озеро Молдино» Московской гимназии на Юго-Западе № 1543 (Тверская область) (табл. 1S, представлена только на сайте журнала). Собирали только листья. Все образцы были заморожены и хранились при температуре −70 °C; некоторые были высушены под вакуумом.

При первоначальном скрининге растений в качестве растворителя был использован ацетон. Извлечение целевых компонентов из растительного сырья — хорошо разработанная группа методов [23]. Для получения экстракта часть листа весом 30–500 мг помещали в пробирку объемом 2 мл, содержащую 0,3–1,5 мл растворителя, и смешивали в течение 20 мин в шейкере BioShake XP (Analytik Jena AG, Германия) при скорости 1800 об/мин при комнатной температуре. Затем экстракт переносили в другую пробирку и центрифугировали при температуре 5 °C и ускорении 10 000 g на центрифуге Centrifuge 5424 R (Eppendorf, Германия). После чего полученный раствор мог быть использован для твердофазной экстракции (ТФЭ) или разделения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или же высушен в вакууме на центрифуге miVac Duo (SP Scientific, США). Перед проведением дальнейших операций высушенный остаток повторно растворяли в соответствующем растворителе и центрифугировали. Состав экстрагирующего растворителя для высушенного остатка мог быть отличен от растворителя при первой экстракции, в частности, к органическому растворителю добавляли буферный раствор.

Для выполнения ТФЭ использовали картриджи C18 (500 мг; Phenomenex, США). На картридж наносили исходный экстракт объемом 0,5–1 мл, затем производили смыв образца с сорбента, последовательно меняя состав растворителей (каждая ступень объемом 1–2 мл): вначале смесью ацетонитрила и воды в соотношении 1 : 1, затем ацетонитрилом и ацетоном.

Ферментные экстракты грибов были приготовлены, как описано в работе [13].

Биолюминесцентный анализ

Для анализа смешивали два компонента: экстракт грибного фермента и органический растительный экстракт. Разбавленный экстракт ферментов гриба в объеме 3 мкл и органический растительный экстракт в объеме 3, 10 или 15 мкл добавляли в пробирку, содержащую 100 мкл буфера (при концентрации NaH₂PO₄ 0,2 M и Na₂SO₄ 0,5 M и pH 8,0) с 0,1 % N-додецил-β-D-мальтозида, смесь взбалтывали и немедленно помещали в кювету люминометра Glomax 20/20 (Promega, США). Люминесценцию измеряли в течение 10 с; время интегрирования сигнала составляло 1 с (табл. 2). В качестве органических экстрактов, содержащих потенциальный субстрат, тестировались экстракты из листьев, экстракты из сушеных остатков первых экстрактов, фракции после ТФЭ или же фракции после ВЭЖХ.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Разделение методом ВЭЖХ проводили на хроматографе Nexera X2 (Shimadzu, Япония), оснащенном автодозатором SIL-30AC, диодно-матричным детектором SPD-M20A и коллектором фракций FRC-10A. Были использованы разные хроматографические колонки (табл. 3). Колонки и детектор не термостатировались (находились при комнатной температуре), температура автодозатора составляла 5 °C. Состав подвижной фазы: компонент A — водный раствор ацетата аммония в концентрации 0,02 M при pH 5,5, компонент B — ацетонитрил, метанол или ацетон (состав и градиент подвижной фазы представлены в табл. 3). Ацетонитрил и метанол были со степенью чистоты «для ВЭЖХ», ацетон — «х. ч.».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для обнаружения люцифериноподобных субстратов в таксономически различных растениях был проведен скрининг собранной коллекции 200 образцов. Каждый приготовленный растительный органический экстракт смешивали с раствором грибного фермента и сразу же измеряли его люминесценцию. В итоге было обнаружено 10 люминесцирующих образцов растений (табл. 4).

Если для первоначального скрининга мы использовали один растворитель — ацетон, то для достижения максимальной люминесценции образца с обнаруженным активным субстратом состав растворителей варьировали. Это приводило к некоторой количественной разнице в наблюдаемых значениях БЛ. Высушивание экстракта и повторное растворение в меньшем объеме растворителя позволяло сконцентрировать образец в несколько раз. Для повторного растворения сухого остатка к органическому растворителю мог быть добавлен буфер с тем или иным значением рН, причем значение рН могло быть критичным для сохранности активности экстракта. Так, для работы с замороженными листьями P. natans наилучшими оказались следующие условия: экстракция ацетоном из растения (первый экстракт) и использование смеси ацетона с водно-ацетатным буфером (pH 6,5) в соотношении 7 : 3 для повторного растворения сухого остатка (рис. 2).

Все экстракты люминесцентно активных растений были проверены на стабильность. Они были высушены и растворены повторно, затем выдержаны в течение нескольких часов при температуре 0 °C и при комнатной температуре. Измерение БЛ активности после каждой операции показало, что все субстраты нестабильны (табл. 4). В результате сушки люминесцентная активность снижалась более чем на 50 %. Самая большая величина интенсивности биолюминесценции была установлена для экстракта P. natans, и она уменьшилась на порядок после того, как экстракт выдержали некоторое время при комнатной температуре.

При выдержке экстрактов на льду обнаружено заметное увеличение во времени БЛ активности экстрактов, по крайней мере в течение нескольких часов. Его наблюдали для многих образцов растений (табл. 4, рис. 3, A, Б). В частности, для R. nigrum зафиксировано 10-кратное увеличение. Временные зависимости биолюминесцентной активности различались не только для разных видов растений, но и для экстрактов одного вида, полученных из растительного материала, обработанного по-разному (свежих, сушеных и замороженных листьев), а также экстрактов и полученных методом ТФЭ фракций тех же экстрактов. Экстракты сухих листьев B. pendula проявили стабильность, зато уровень биолюминесценции экстрактов замороженных и свежих листьев значительно увеличился (рис. 3, В). Кроме того, часто (но не всегда) 10-секундные кинетические кривые при измерении БЛ экстрактов B. pendula были восходящими, хотя обычно они являются нисходящими (рис. 4).

Основываясь на том, что самое большое значение люминесценции исходного экстракта было зафиксировано у образцов P. natans, этот вид был выбран в качестве кандидата для продолжения эксперимента, а именно выделения биолюминесцентного субстрата методом ВЭЖХ. Оптимизированный состав подвижной фазы для ВЭЖХ на колонке типа С18 отличался по сравнению с условиями для выделения 3-гидроксигиспидина: как компонент A использовали водно-ацетатный буфер в концентрации 0,02 M при pH 5,5 (в отличие от 0,1 % муравьиной кислоты для 3-гидроксигиспидина). Содержание органического компонента В было увеличено и при градиентном элюировании достигало 95 %.

Фракции после ВЭЖХ были высушены вакуумно, заново растворены с 20-кратным концентрированием, после чего была измерена их БЛ активность (рис. 5). В полученном хроматографическом профиле образца были отмечены две области, содержащие люминесцентно активные компоненты, что указывало на содержание более чем одного субстрата. Контур ультрафиолетового/видимого излучения в диапазоне 200–800 нм свидетельствовал о наличии многих неразделенных компонентов в областях люминесцентной активности.

Для получения большего количества нестабильного субстрата при хроматографировании мы вносили различные модификации в используемый нами метод, а также выбирали для тестирования другие виды растений. На рис. 6 показан результат одного из разделений. В качестве материала использованы свежие листья B. pendula. Исходный экстракт из 400 мг листьев экстрагировали в 1500 мкл метанола и 1000 мкл этого экстракта фракционировали на картриджах C18. Была измерена активность фракций, и самая активная из них в объеме 800 мкл без предварительного высушивания была внесена на полупрепаративную колонку C18. После измерения БЛ активности фракций на 45-минутной хроматограмме было выявлено много активных зон. В самых активных фракциях в начале хроматограммы обнаружились многочисленные неразделенные пики, несколько активных фракций присутствовали в конце хроматограммы. Никакой корреляции между основными хроматографическими пиками и люминесцентной активностью установить было невозможно. Следует отметить, что биолюминесцентная активность, как правило, сопровождалась наличием зеленой окраски фракций (поглощение около 650 нм). Была проведена попытка разделения отдельных фракций на той же колонке, но из-за химической нестабильности биолюминесцентная активность после повторной хроматографии не выявилась.

В следующем опыте была сделана попытка использовать ацетон в качестве компонента подвижной фазы для ВЭЖХ. Ацетон не вполне подходит при спектрофотометрическом детектировании, так как поглощает в нижней области спектра (300 нм и менее). Учитывая имеющиеся данные, мы предположили, что биолюминесцентные субстраты должны поглощать в области более 300 нм, и это позволяет использовать ацетон. Полученная хроматограмма и профиль активности показаны на рис. 7. Результаты измерений указывают на присутствие нескольких активных компонентов. Однако величина активности и соответствующая масса активных компонентов были недостаточно высокими, чтобы перейти к второй ступени хроматографии.

И наконец, кроме вышеперечисленного, для экстракта P. natans мы применили двумерную хроматографию с быстрым разделением на полярной колонке и последующим разделением самой активной фракции на колонке с обращенной фазой (рис. 8). Чтобы минимизировать потери вещества и сохранить максимальное количество субстрата, исходные экстракты и фракции перед измерением активности не высушивались. Самая активная фракция, отмеченная между 3 и 3,5 мин хроматограммы на первой колонке, была сконцентрирована до 100 мкл и нанесена на вторую колонку. На хроматограмме второго разделения было выделено два пика в районе 11,5 и 12 мин, но разделение было неполным, а интенсивность люминесценции оказалась низкой.

Была проведена оценка потерь активных соединений в P. natans на каждом шаге разделения путем соответствующего измерения БЛ (табл. 5). Рассчитывали общую активность растворов исходных экстрактов и фракций с учетом изменения их объемов. Оказалось, что потери происходили после каждой операции и к концу эксперимента сохранялось лишь 0,2 % исходной величины активности.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение образцов листьев растений, содержащих соединения с БЛ активностью, показало, что наша первоначальная гипотеза о присутствии в них гиспидина или 3-гидроксигиспидина не подтвердилась. Во всех случаях для реакции люминесценции не требовалось присутствия НАД(Ф)Н, что указывало на большее сходство активных растительных компонентов, необходимых для люминесценции, с грибным люциферином, но не с гипидином. Однако при выборе условий хроматографии, аналогичных тем, что были использованы при выделении грибного люциферина [13], никаких активных компонентов во фракциях ВЭЖХ выявить не удавалось.

Наличие многих активных фракций при хроматографическом разделении экстрактов свидетельствует о том, что каждое растение синтезирует не одно, а несколько соединений, являющихся субстратами для люциферазы гриба. Кроме того, различие хроматографических условий для разделения компонентов экстрактов разных растений показывает, что наборы таких соединений весьма разнообразны.

Обнаруженное при выдержке экстрактов на льду аномальное увеличение во времени биолюминесцентной активности органических экстрактов позволяет предполагать, что в них могут протекать реакции, приводящие к снижению концентрации одних активных соединений и повышению концентрации других соединений. Однако ни одного стабильного субстрата обнаружить не удалось, так как люминесценция экстрактов всех 10 растений быстро снижалась при комнатной температуре.

Нами были применены различные модификации методов подготовки экстрактов и их сепарации, чтобы определить, какой вариант позволит удовлетворить противоречивым требованиям максимального извлечения, максимальной сохранности и селективного выделения индивидуального нестабильного соединения из сложной смеси растительного экстракта. В одних случаях экстракты предварительно фракционировали с помощью ТФЭ перед проведением ВЭЖХ, а в других — сразу вводились на хроматографическую колонку. Для дополнительного концентрирования мы пробовали сушить экстракты и повторно растворять в меньшем объеме растворителя, это же касалось растворов хроматографических фракций перед измерением люминесценции; использовали разные органические растворители как компоненты подвижной фазы для ВЭЖХ; применили последовательную хроматографию на колонках разной полярности (двумерную хроматографию).

К сожалению, стабильность всех обнаруженных активных соединений оказалась недостаточной для достижения поставленной цели — выделения какого-либо субстрата в количестве, достаточном для установления его структуры и свойств.

ВЫВОДЫ

В природе не существует биолюминесцентных растений, поэтому их создание методами синтетической биологии представляет собой интересную задачу. В результате проведенного исследования мы выяснили, что некоторые компоненты растений могут реагировать с люциферазой гриба и реакция сопровождается люминесценцией. Все потенциальные субстраты, содержащиеся в изученных в данной работе растениях, оказались химически нестабильными, что не позволило провести их выделение и охарактеризовать химическую структуру. Тем не менее настоящая работа позволяет сделать следующие выводы, полезные для дальнейших попыток создания автономно люминесцентных растений: люминесцентные субстраты люциферазы, имеющиеся в экстрактах растительного сырья, не идентичны грибному люциферину (3-гидроксигиспидину); изученные виды растений синтезируют множество различных активных соединений. Таким образом, наше исследование можно считать первым шагом в создании люминесцентного растения. По-видимому, наиболее перспективным направлением дальнейшей работы по созданию люминесцентных растений представляется поиск генов, ответственных за синтез 3-гидроксигиспидина, а также гена люциферазы грибов, и экспрессия этих генов в трансгенных растениях.