Взаимодействие кишечной микробиоты и организма хозяина

Микробиота человека — это эволюционно сложившееся сообщество микроорганизмов, обитающих в организме (на коже, в мочеполовой системе, желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) и т. д.) и являющихся его нормальным и необходимым компонентом. Микроорганизмы, составляющие микробиоту, являются симбионтами и поддерживают нормальное функционирование как организма хозяина, так и самого микробного сообщества. Самая крупная популяция микроорганизмов-симбионтов обитает в толстом отделе кишечника: в нем сконцентрировано около 60 % всей микрофлоры человека [1, 2]. Состав микробиоты и ее функции зависят от пола и возраста человека, характера питания, экологических и социальных условий жизни, а также от состояния здоровья человека и приема им различных лекарственных средств, в том числе антибиотиков [3, 4].

Микробиота, в частности, кишечная микробиота, способна существенно влиять на здоровье человека. Являясь основным резервуаром микроорганизмов, биоценоз тонкого и толстого отделов кишечника воздействует на работу не только ЖКТ, но и других жизненно важных органов и систем [1, 5]. Одной из наиболее значимых функций кишечной микробиоты является ее активное участие в формировании колонизационной резистентности организма хозяина. Эта функция выработалась в ходе длительного эволюционного взаимодействия человека и микроорганизмов, при котором шел непрерывный селективный отбор наиболее адаптированных бактериальных популяций. Помимо этого, кишечная микробиота способна активизировать иммунную, гормональную и нервную (включая мозг) системы хозяина. Иммуностимулирующая функция микробиоты обусловлена в первую очередь бифидобактериями и лактобациллами [1, 6]. Кишечная микробиота также участвует в синтезе биологически активных веществ — витаминов и гормонов; вовлечена в метаболизм белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот; регулирует газовый состав кишечника и др. [4].

Изменения в кишечной микробиоте, вызванные внешними факторами, могут быть причиной дисбактериоза, характеризующегося увеличением числа потенциально патогенных организмов (патобионтов) [2, 7], а также могут приводить к возникновению различных метаболических и воспалительных заболеваний, висцеральных болей и даже опосредованных изменений в функционировании центральной нервной системы (ЦНС), которые, в свою очередь, могут быть причиной поведенческих и когнитивных нарушений [2, 8, 9, 10]. Также известно, что изменения в составе микробиоты кишечника часто сопутствуют таким заболеваниям, как ожирение, аллергия, диабет 2 типа, заболеваниям сердечно-сосудистой системы и аутоиммунным нарушениям [2, 11]. Число факторов, негативно воздействующих на состав и функционирование микробиоты человека, с каждым годом только возрастает: загрязнение окружающей среды (жизнь в мегаполисах) [12], неправильное питание (рост популярности фаст-фуда) [13], стрессы [14]. Известно также, что развитие дисбиотических расстройств кишечника может быть в большой степени обусловлено антибактериальной терапией, которая зачастую является причиной гибели ценной для человека симбионтной микрофлоры и стимулируюет искусственную селекцию болезнетворных антибиотико-резистентных штаммов [1].

Симбиотические отношения между организмом хозяина и его микробиотой крайне важны. Микробное сообщество ЖКТ человека является чутким индикатором физиологического состояния организма хозяина, реагирующим на многие факторы [1, 4]. В связи с этим микробиота может быть рассмотрена в качестве потенциальной терапевтической мишени для лечения и/или коррекции различных патологий, в том числе дисбиотических состояний. Существуют различные подходы и стратегии по регуляции микробиома человека: диеты, употребление про- и пребиотиков, хирургические вмешательства. Некоторые авторы описывают положительное воздействие на состояние кишечной микробиоты физических нагрузок в сочетании с функциональной диетой [15, 16]. Мы предлагаем использовать селективные ингибиторы, воздействующие на отдельные бактериальные роды и/или даже виды, — замедляющие рост бактерий, снижающие вирулентность патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и способствующие таким образом восстановлению таксономического состава кишечной микробиоты. Мишенью для таких ингибиторов у бактерий могут служить cерин-треониновые протеинкиназы (СТПК) эукариотического типа.

Классификация СТПК грамположительных бактерий

Фосфорилирование и дефосфорилирование белка являются одними из основных механизмов регуляции различных молекулярных процессов в клетке. В среднем бактериальный фосфопротеом содержит порядка ста сайтов фосфорилирования. Заметным исключением, известным на сегодняшний день, является фосфопротеом Mycobacterium tuberculosis, содержащий около 500 сайтов [17]. Для эукариотических фосфопротеомов эти числа на порядок больше [18].

Как у бактерий, так и у человека серин-треониновые протеинкиназы являются одними из основных компонентов систем передачи сигналов [19, 20]. СТПК эукариотического типа были идентифицированы в бактериях [21, 22, 23, 24, 25] около 20 лет назад. На сегодняшний день известно, что они участвуют в регуляции таких важных процессов, как деление и рост клетки [26, 27, 28], образование биопленок [29], ответ на окислительный стресс [30], спорообразование [31]. СТПК играют важную роль в формировании вирулентности и патогенности у болезнетворных бактерий [21, 32, 33]. Эти ферменты также участвуют в патогенезе заболеваний, вызываемых различными микроорганизмами, например M. tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus и др. [20, 25].

Молекулярный механизм ингибирования СТПК — это конкурентное взаимодействие веществ с сайтом связывания АТФ. По этой причине селективное ингибирование СТПК патогенных и условно-патогенных микроорганизмов АТФ-конкурентными ингибиторами представляет собой привлекательный подход по коррекции состава и функционального состояния микробиоты человека.

Ранее нами была предложена классификация СТПК эукариотического типа грамположительных бактерий [19]. В работе были рассмотрены СТПК различных групп микроорганизмов: патогенных и непатогенных представителей родов Mycobacterium, Staphylococcus, Actinomyces и др. и пробиотических представителей симбионтной микробиоты человека родов Bifidobacterium и Lactobacillus. В основу классификации лег анализ физико-химических свойств 9 аминокислотных остатков, экспонированных в область связывания аденина. Аминокислотные остатки отбирали по результатам визуального анализа пространственных струткур бактериальных СТПК, доступных в банке данных Protein Data Bank [34] и параллельно проводили анализ аминокислотных последовательностей бактеральных СТПК (в том числе было выполнено множественное выравнивание всех последовательностей бактериальных протеинкиназ) [19].

При анализе структур  СТПК были идентифицированы аминокислотные остатки, взаимодействующие с АТФ. Особое внимание было уделено области связывания аденина — структурно более вариабельной по сравнению с областями связывания фосфата и рибозы. Неинформативные для классификации аминокислотные остатки, например консервативные для всех рассмотренных структур или вносящие вклад в связывание АТФ только атомами своей основной цепи, были исключены из рассмотрения. При анализе последовательностей СТПК грамположительных бактерий высококонсервативные аминокислотные остатки, характерные как для эукариотических, так и для бактериальных протеинкиназ, нами не рассматривались, а особое внимание было уделено заменам в консервативных для эукариотических киназ позициях, не влияющим на функциональность бактериальных киназ. При анализе последовательностей каталитических доменов бактериальных СТПК наше внимание также привлек V-субдомен (СТПК содержат 12 консервативных субдоменов, характерных как для эукариотических, так и для бактериальных СТПК [35, 36]). У эукариотических протеинкиназ V-субдомен — довольно вариабельная область по сравнению с другими субдоменами, не содерджащая какого-либо консервтаивного мотива. Однако в V-субдомене расположены аминокислотные остатки, входящие в состав шарнирного участка, соединяющего две доли каталитического домена, и, меняя ориентацию каталитического и белок-связывающего участков, можно регулировать активность СТПК. В связи с этим V-субдомен, в частности, последовательность, относящаяся к шарнирному участку, представляет интерес для создания функциональной классификации СТПК.

Таким образом, по результатам визуального анализа структур СТПК и их аминокислотных последовательнстей нами были отобраны 9 вариабельных аминокислотных остатков, боковые цепи которых экспонированы в область связывания аденина: Leu17, Val25, Ala38, Val72, Met92, Tyr94, Val95, Met145 и Met155 (остатки пронумерованы в соответствии с СТПК PknB M. tuberculosis) (рис. 1).

Выбранные остатки составили «сигнатуру» аденин-связывающего кармана. Консервативность рассматриваемых сигнатурных остатков различна. На основе анализа сигнатуры из 9 аминокислотных остатков и была проведена классификация СТПК грамположительных бактерий. По итогам классификации все киназы были разделены на 20 групп (рис. 2). Стоит отметить, что главным критерием группировки было наличие специфичной комбинации доноров/акцепторов водородной связи и ароматических остатков в конкретных положениях сигнатуры аденин-связывающего кармана. Тринадцать из 20 групп оказались родоспецифичными, а некоторые из оставшихся семи групп содержали представителей только патогенных микроорганизмов [19]. Таким образом, классификация СТПК также позволила разделить исследуемые бактериальные роды и виды на группы. Так как для каждой группы характерна специфичная конфигурация области связывания аденина (форма, объем и глубина области связывания), то было выдвинуто предположение, что селективные ингибиторы, нацеленные на одну из групп, не будут (или будут очень слабо) взаимодействовать с киназами из других групп. В связи с этим, практическим применением классификации может стать ее использование при разработке АТФ-конкурентных ингибиторов бактериальных СТПК эукариотического типа.

Возможности практического применения разработанной классификации: селективные ингибиторы СТПК

В настоящее время интенсивно изучается состав кишечной микробиоты. По предварительным оценкам, экосистема толстой кишки человека содержит более 400 видов бактерий, принадлежащих ограниченному числу таксономических групп [37, 38]. Как правило, представители таких бактериальных типов, как Firmicutes, Bacteroides, Actinobacteria и Proteobacteria, составляют значительную часть микробного сообщества, обитающего в кишечнике взрослого человека [39]. Однако для каждого индивида характерно, по-видимому, уникальное микробное сообщество [37, 40, 41], которое способно значительно меняться под воздействием различных эндо- и экзогенных факторов.

При различных дисбиотических состояниях снижается уровень пробиотической составляющей кишечной микробиоты и происходит рост патогенной микрофлоры, что приводит, в свою очередь, к различным патологиям [5]. На сегодняшний день показана взаимосвязь между микробиотой ЖКТ и многочисленными заболеваниями. Morgan и соавт., например, выявили корреляцию между дисбалансом кишечной микробиоты и такими заболеваниями, как язвенный колит и болезнь Крона [42]. В то время как у здоровых людей преобладают четыре основных бактериальных типа [37, 43], у пациентов с этими патологиями, во-первых, сокращается таксономическое разнообразие родов и видов, и, во-вторых, отмечается более низкая доля (представленность) типа Firmicutes. Вдобавок при болезни Крона изменяются пропорции в представленности родов класса Clostridia [42, 44]. Исследования различных типов псориаза также показали снижение таксономического разнообразия в кишечной микробиоте при этом заболевании, причем изменения были ассоциированы с увеличением численности четырех бактериальных родов, в том числе Corynebacterium, Staphylococcus и Streptococcus [45].

Помимо этого, многочисленные данные свидетельствуют о наличии связи между различными метаболическими заболеваниями и изменениями в составе бактериальных популяций, населяющих ЖКТ. Так, в работе Larsen и соавт. были оценены различия между кишечной микрофлорой людей, страдающих диабетом 2 типа, и лиц без диабета [46]. Было установлено, что у диабетиков значительно снижено количество бактерий типа  Firmicutes и класса Clostridia и повышено количество бактерий рода Lactobacillus по сравнению со здоровыми людьми [46]. Дело в том, что род Lactobacillus представляет собой гетерогенную группу микроорганизмов, обладающих иммуномодулирующими свойствами [47], которые, вероятно, и обуславливают  воспаление у больных сахарным диабетом [46]. В исследованиях Tana и соавт. у пациентов с синдромом раздраженного кишечника (СРК) также была выявлена достоверно более высокая численность бактерий рода Lactobacillus, чем у пацинетов из контрольной группы [48]. Для пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом, напротив, наличие ряда штаммов рода Lactobacillus необходимо. При исследованиях воспаленных образцов слизистых оболочек от пациентов с этими патологиями был обнаружен ряд необходимых микроорганизмов (в том числе рода Lactobacillus и Bifidobacterium), которые способны фактически защищать слизистую оболочку кишечника от различных воспалительных реакций, нежелательных для организма хозяина. Это связано с тем, что часть штаммов рода Lactobacillus, в частности, L. casei и L. plantarum подавляют экспрессию ключевых провоспалительных цитокинов и хемокинов и нейтрализуют провоспалительные эффекты, вызванные Escherichia coli [49].

Учитывая вышеописанное, для восстановления нормального таксономического состава микробиоты можно, используя разработанную классификацию, избирательно влиять, например, на группу бактерий рода Lactobacillus (XIII) [19] в случае диабета 2 типа и СРК или на группу бактерий родов Corynebacterium, Staphylococcus и Streptococcus (IV, X) при псориазе.

Кроме того, большинство СТПК являются ключевыми регуляторами роста бактерий: их ингибирование может приводить к замедлению роста микроорганизмов. Воздействуя селективными ингибиторами на группы СТПК, включающие СТПК симбионтов человека, можно менять состав кишечной микрофлоры человека, не убивая при этом «свои» микроорганизмы, а лишь замедляя их рост и функционирование. Примером такого воздействия может служить ингибирование роста бактерий, относящихся к группам III и IV разработанной классификации, — условно-патогенных представителей нормальной микрофлоры человека родов Actinomyces и Corynebacterium [19]. Таким образом, подбирая ингибиторы для СТПК определенных групп микроорганизмов, можно пытаться регулировать состав человеческой микробиоты.

Не стоит забывать, что не исключена возможность нецелевого ингибирования протеинкиназ человека в связи со структурным сходством участков связывания АТФ у человека и бактерий. Хотя идентичность каталитических доменов бактериальных и человеческих киназ обычно составляет не более 30 %, следует обратить внимание на протеинкиназы человека при разработке селективных ингибиторов бактериальных СТПК. В человеческом киноме насчитывается порядка 518 протеинкиназ. При помощи множественного выравнивания нами было установлено, что 324 из них содержат «хэнковские домены», характерные для исследуемых нами СТПК эукариотического типа. Для распределения человеческих киназ по группам согласно разработанной классификации мы идентифицировали у отобранных 324 киназ 9 аминокислотных остатков, составляющих сигнатуру. По результатам проведенной работы оказалось, что человеческие киназы попадают только в 4 группы предложенной классификации: I, II, VIII и XII (рис. 3). Причем из всех рассмотренных человеческих протеинкиназ лишь 8,6 %  попали в группы к бактериальным киназам. Стоит отметить, что ингибирование протеинкиназ человека, не попавших ни в одну из групп, ингибиторами, нацеленными на СТПК из рассматриваемых групп, кажется нам маловероятным в связи с различиями в их сайтах связывания.

Рассмотрим случай, при котором мы хотим получить селективные ингибиторы СТПК патогенных микроорганизмов. Такие ингибиторы должны быть избирательны не только по отношению к человеческим протеинкиназам, но и к СТПК микроорганизмов-симбионтов. Таким образом, необходимо разделить группы, содержащие СТПК патогенных микроорганизмов, СТПК симбионтов и протеинкиназы человека на три кластера и посмотреть, какие из групп характерны только для киназ патогенов. Для этого нами была построена диаграмма Венна (рис. 3).

На рис. 3 видно, что при разработке селективных ингибиторов СТПК патогенных микроорганизмов в первую очередь стоит обратить внимание на киназы из следующих четырех групп: VII, X, XVIII и XIX (таблица), — т. к. в них входят исключительно киназы патогенных микроорганизмов и вероятность взаимодействия ингибиторов, нацеленных на эти группы, с протеинкиназами человека или с СТПК бактерий-симбионтов будет минимальна.

В группы VII и XIX входят СТПК M. tuberculosis: PknK и PknI. PknK вовлечена в регуляцию трансляции на различных фазах роста, участвует в адаптивных механизмах и в патогенезе у микобактерий [50, 51]. Также экспериментально показано, что экспрессия pknK выше у вирулентного штамма M. tuberculosis H37Rv, чем у авирулентного H37Ra [50]. PknI является близким гомологом киназы Stk1 Streptococcus agalactiae, участвующим в формировании вирулентности [52]. В связи с вышеизложенным можно предположить, что ингибирование данных киназ будет способствовать замедлению роста штаммов M. tuberculosis и снижению их патогенности и вирулентности.

В группу X входят СТПК рода Staphylococcus. СТПК стафилококков являются модуляторами структуры клеточной стенки, а также вовлечены в формирование вирулентности [53]. Таким образом, ингибирование киназ данной группы, так же, как и групп, описанных выше, будет способствовать уменьшению вирулентности штаммов Staphylococcus.

Группа XVIII представлена протеинкиназой рода Bacillus YbdM, которая фосфорилирует двухкомпонентную систему DegS/U. Эта система, в свою очередь, влияет на образование биопленок, формирование сложных колоний и подвижность микроорганизмов [54]. Следовательно, воздействие на эту группу СТПК селективными ингибиторами будет нарушать течение вышеописанных процессов.

Протеинкиназы человека, чьи сигнатуры совпали с сигнатурами бактериальных протеинкиназ, относятся к киназам из следующих классов: AGC[1], CAMK[2], CMGC[3], STE[4], — и к семействам протеинкиназ, не классифицирванным на данный момент (например, семействам IKK и NEK). Роль этих протеинкиназ в организме человека различна. Например, киназы семейства ROCK участвуют в осуществлении ряда функций, в том числе Rho-индуцированного образования актиновых стрессорных волокон и очагов адгезии, а также в таких процессах, как активация тромбоцитов, сокращение гладкой мускулатуры различных органов, хемотаксис нейтрофилов и многих других [55]. РАK-киназы фосфорилируют и регулируют активность ряда цитоскелетных белков; также в ряде статей была описана их роль в регуляции активности MAPK в клетках млекопитающих [56, 57]. Для киназ семейства NDR описано участие в эмбриональном развитии, в нейрологических процессах и биологии рака [58]. При этом нельзя однозначно сказать, что игибирования указанных киназ человека следует избегать в любых случаях. Это не так, потому что, например, повышенная экспрессия ROCK-киназ ассоциирована с рядом заболевний (раком мочевого пузяры, карциномой груди и др.), а с киназой PAK1 связаны такие заболевания суставов, как остеоартрит и ревматоидный артрит, т. к. активация ряда сигнальных путей, в которых данная киназа является одним из основных медиаторов, приводит к повышению экспрессии маркерных генов, имеющих отношение к остеоартриту [59].

Таким образом, регуляция таксономического состава человеческой микробиоты — это комплексная задача, требующая для своего решения привлечения специалистов из различных областей: для ее решения необходимо не только хорошо понимать генетику микроорганизмов, но и разбираться в процессах, происходящих в клетках человека. Помимо этого, т. к. данная задача требует анализа большого массива данных и построения пространственных структур хотя бы для представителей основных групп киназ, необходимо участие биоинформатиков и химиков.

ВЫВОДЫ

В последнее время различные группы исследователей пришли к пониманию того, что микробиота человека чрезвычайно важна для его здоровья. Наиболее многочисленная и разнообразная по видовому составу популяция микроорганизмов сосредоточена в желудочно-кишечном тракте. Микроорганизмы, составляющие микробиоту ЖКТ, коэволюционируют с человеком. Нарушение таксономического баланса кишечной микробиоты может быть причиной различных патологий, в том числе язвенного колита, болезни Крона, диабета и др.

При разработке подходов по восстановлению таксономического состава микробиоты необходимо сочетать эффективность и селективность предлагаемых соединений для ингибирования роста микроорганизмов. Стоит подчеркнуть, что коррекция таксономического дисбаланса включает воздействие не только на патогенные микроорганизмы, но и на микроорганизмы-симбионты. Следовательно, требуется «мягкий» инструмент воздействия на кишечную микробиоту, который будет замедлять рост нежелательных групп бактерий, снижать вирулентность патогенной составляющей микрофлоры при заболеваниях и минимально затрагивать протеинкиназы человека. Таким инструментом могут стать предлагаемые нами селективные ингибиторы бактериальных СТПК.

Сама идея использования направленных ингибиторов СТПК не нова [20, 60, 61]. Ранее, при сравнении киназ человека и различных паразитов (Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania), нами было показано, что, несмотря на довольно консервативную стурктуру каталитического домена и, в частности, сайтов связывания, разработка селективно действующих препаратов возможна [62]. Разрабтанная классификация СТПК является первым важным шагом на пути к созданию эффективных селективных ингибиторов бактериальных протеинкиназ.

Можно предложить следующий алгоритм разработки селективных ингибиторов СТПК: (1) сравнительный анализ таксономического состава микробиоты здорового и больного человека и выделение тех групп бактерий (родов и/или видов), количество которых возросло при патологии; (2) анализ групп, содержащих СТПК данных микроорганизмов; (3) in silico поиск ингибиторов (низкомолекулярных соединений) для протеинкиназ выделенных групп (моделирование пространственных структур, молекулярный докинг); (4) экспериментальная проверка предложенных соединений. При этом на этапах (2) и (3) также нужно будет учитывать следующее: информацию о функциях СТПК микроорганизмов-мишеней; СТПК бактерий, входящих в отобранные группы, но не являющихся мишенями; наличие предвартельной пространственной структуры или даже нескольких структур для типичных представителей протеинкиназ из каждой группы для более быстрого отбора ингибирующих соединений.

[1] AGC — класс протеинкиназ, активность которых регулируется циклическим АМФ/ГМФ. Также в этот класс входят так называемые протеинкиназы C, активность которых может реулироваться диацилглицеролом, фосфолипидами и ионами кальция.

[2] CAMK — Са-кальмодулин-зависимые протеинкиназы.

[3] CMGC — класс протеинкиназ, в который входят циклинзависимые протеинкиназы (C), так называемые МАР-киназы (М) и ферменты, способные фосфорилировать гликогенсинтазу (G).

[4] STE — серин/треониновые киназы, первоначально идентифицированные в дрожжах.