ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
МЕТОД
Анализ соматических мутаций в генах RAS-каскада свободно циркулирущей ДНК плазмы крови пациентов с колоректальным раком методом усиленной аллель-специфической
Информация об авторах
Лаборатория молекулярной биологии и цитогенетики,Российский научный центр рентгенорадиологии, Москва
Для корреспонденции: Снигирева Галина Петровна
ул. Профсоюзная, д. 86, г. Москва, 117997; ur.liam@lag_ins
Информация о статье
Благодарности: авторы благодарят Андрея Зарецкого из компании «Евроген» (Москва) за помощь и ценные советы при проведении молекулярно- генетического исследования.
Вклад авторов в работу: Е. Н. Телышева — анализ литературы, планирование исследования, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи; Г. П. Снигирева — планирование исследования, интерпретация данных, подготовка черновика рукописи.
Статья получена: 08.08.2017
Статья принята к печати: 17.08.2017
Опубликовано online: 29.10.2017
|
Выбор тактики лечения пациентов с учетом индивидуальных молекулярно-генетических характеристик опухоли лежит в основе персонифицированного подхода в онкологии. Такой подход позволяет существенно повысить качество и эффективность лечения за счет воздействия таргетными препаратами на генетические нарушения в опухоли. Как показали многочисленные исследования, генетический профиль опухоли является уникальной характеристикой конкретного больного и отражает изменения не только в генах, участвующих в развитии данного заболевания, но и случайные изменения в разных участках генома [1, 2].
Анализ молекулярно-генетических маркеров проводится, как правило, на образцах опухолевой ткани, получаемых при хирургической операции или с помощью биопсии до начала лечения. Однако эти методы сопряжены с серьезными трудностями, связанными с получением материала для исследования, его обработкой, а также информативностью: для опухолей характерна молекулярная гетерогенность [3, 4]. При этом и анализ материала, полученного только из одной части опухоли, не дает полного представления о молекулярно-генетическом профиле опухоли и ее метастазов, а многократная биопсия разных участков опухоли трудоемка и дорогостояща.
Как известно, молекулярно-генетические нарушения, возникшие в процессе канцерогенеза, могут быть выявлены не только в самой опухолевой ткани или ее метастазе, но и в плазме или сыворотке крови пациента с помощью анализа циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК), которая выполняет роль онкомаркера [5, 6]. Анализ внеклеточной ДНК называют жидкостной биопсией, и этот метод позволяет преодолеть ограничения, связанные с получением образцов опухолевой ткани и работой с ними, являясь идеальным инструментом для исследования молекулярно-генетических нарушений у пациентов с онкологическими заболеваниями [7]. Взятие пробы крови является минимально инвазивной процедурой, которая может быть осуществлена в любое время в течение курса терапии, что позволяет наблюдать за молекулярными изменениями в опухоли в динамике [8, 9].
Содержание цоДНК в плазме крови очень небольшое: ее количество зависит от стадии заболевания и часто составляет менее 1 % от общего количества свободно циркулирующей ДНК (сцДНК) [10, 11]. По этой причине для обнаружения молекулярно-генетических нарушений в цоДНК необходимы высокочувствительные методы анализа, такие как секвенирование нового поколения (next generation sequencing, NGS) и цифровая полимеразная цепная реакция (ПЦР; droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR). Высокая чувствительность этих методов при анализе соматических мутаций в сцДНК плазмы крови была подтверждена неоднократно [12, 13, 14]. Однако их рутинное применение в онкологии ограничено из-за крайне высокой стоимости одного исследования, а в случае с NGS — также из-за неоправданной избыточности получаемой информации.
Одним из перспективных методов анализа сцДНК плазмы крови является метод усиленной аллель-специфической ПЦР, разработанный компанией «Евроген» (Россия) специально для работы с биологическими образцами, содержащими небольшое количество мутантной ДНК. Принцип метода заключается в сочетании аллель-специфической ПЦР с блокадой амплификации аллеля «дикого типа» — так же, как при использовании метода мутационно-специфической ПЦР [15]. Две пары праймеров подбирают таким образом, чтобы амплифицировать целевой фрагмент с одной конкретной мутацией для анализа. Одним из преимуществ метода является короткая длина ПЦР-продукта — всего лишь 90 п. о., что важно при анализе сцДНК, присутствующей в кровотоке в крайне фрагментированном виде. Теоретически данный метод позволяет анализировать любые мутации. На сегодняшний день с его помощью можно проверить на 7 ключевых мутаций ген KRAS (6 замен в кодоне 12 — p.G12D, p.G12V, p.G12C, p.G12S, p.G12A, p.G12R и замену в кодоне 13 — р.G13D) и на 5 мутаций — ген BRAF (p.V600E, p.V600E-2, p.V600K, p.V600K-2, p.V600D). Чувствительность метода усиленной аллель-специфической ПЦР составляет не менее 10 копий ДНК с мутацией, а избирательность — 0,1–1,0 % (в зависимости от количества исходной ДНК), при этом частота ложноположительных результатов не превышает 0,05 %.
В настоящей работе представлены результаты анализа мутаций в генах RAS-каскада (KRAS, BRAF) в сцДНК плазмы крови пациентов с колоректальным раком (КРР) методом усиленной аллель-специфической ПЦР.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
В исследование были включены пациенты, которые проходили обследование и лечение в Российском научном центре рентгенорадиологии (г. Москва) в 2010–2016 гг. Критерием включения в исследование являлось наличие у пациента морфологически подтвержденной злокачественной эпителиальной опухоли ободочной или прямой кишки.
Основываясь на результатах молекулярно-генетического исследования операционного материала больных КРР (метод ПЦР в «реальном времени» с последующим секвенированием по Сэнгеру), для участия в исследовании отобрали 46 человек, у которых в опухолевой ткани были выявлены активирующие мутации в гене KRAS (экзон 2: кодоны 12 и 13) или BRAF (экзон 15: кодон 600) [16]. В группу исследования включили 46 человек (18 женщин и 28 мужчин) в возрасте от 48 до 86 лет (средний возраст — 67,1 ± 8,8 года).
У 13 пациентов (28 %) была стадия I заболевания, у 10 (22 %) — стадия II, также у 10—стадия III и еще у 13 — стадия IV (табл. 1). По гистологической структуре практически все опухоли являлись аденокарциномами различной степени дифференцировки: у 4 участников исследования опухоль была низкодифференцированной, у 25 — умереннодифференцированной, у 16 — высокодифференцированной, в одном случае аденокарцинома была слизеобразующей.
Все пациенты получили хирургическое лечение: в 85 % случаев (39 человек) операция носила радикальный характер, в 15 % случаев (7 человек со стадией IV заболевания) — нерадикальный. Пациентам проводили молекулярно-генетическое исследование для обнаружения мутаций, выявленных в ткани опухоли: в гене KRAS — мутаций p.G12D, p.G13D, p.G12V, p.G12C, p.G12S, p.G12A, в гене BRAF — мутации p.V600E, наиболее распространенной при КРР. Для этого до хирургического вмешательства (n = 46) и через 5 дней после него (n = 35) у пациентов брали кровь. По имеющимся в литературе данным, период полувыведения сцДНК из плазмы крови составляет около 15 ч и зависит от локализации опухоли, ее гистологического типа и от стадии заболевания [17, 18]. Таким образом, отбор крови на 5 сутки после операции гарантировал полное выведение цоДНК из кровяного русла в случае удаления опухоли. Кровь отбирали в объеме 15 мл в пробирки с ЭДТА, в течение часа после взятия крови плазму отделяли от клеточного дебриса путем центрифугирования в течение 15 мин при 4 °С в три этапа: при 1 400, 3 400 и 4 400 об/мин соответственно. Аликвоты плазмы (по 5 мл) хранили до проведения исследования при –80 °С.
Свободно циркулирующую ДНК выделяли из плазмы с помощью набора QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Нидерланды) по протоколу производителя. Объем элюата для каждого образца составил 20 мкл. Концентрацию выделенной сцДНК измеряли методом ПЦР в «реальном времени» с использованием набора «XY-Детект» («Синтол», Россия) в соответствии с протоколом производителя.
Для исследования сцДНК на наличие мутаций в генах KRAS и BRAF применяли метод усиленной аллель-специфической ПЦР в «реальном времени» с использованием наборов реагентов фирмы «Евроген» (Россия) на приборе 7500 real-time PCR systems (Applied Biosystems, США). Каждый образец сцДНК в исследование брали в объеме 10 мкл.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программных пакетов Statistica 8 (StatSoft, США) и Microsoft Excel 2013. Сравнение вариационных рядов проводили с использованием U-критерия Манна–Уитни.
Исследование было одобрено этическим комитетом Российского научного центра рентгенорадиологии (протокол № 3 от 17 марта 2014 г.). Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Молекулярно-генетическое исследование сцДНК плазмы крови, полученной до операции, показало, что у 24 пациентов (52 %) в циркулирующей опухолевой ДНК присутствуют мутации в экзоне 2 гена KRAS или экзоне 15 гена BRAF, а в цоДНК других 22 пациентов их нет (табл. 1). Мы проанализировали распределение пациентов по подгруппам в зависимости от стадии заболевания и установили, что в группе больных с мутациями в генах RAS-каскада большинство (15 человек, 63 %) имели стадию III или IV, а в группе больных без мутаций в цоДНК большинство (10 человек, 45 %) имели стадию I заболевания.
В табл. 1 также приведены значения концентрации сцДНК и относительного содержания мутантной цоДНК в плазме крови участников исследования. У пациентов с онкоспецифическими мутациями в генах RAS-каскада, выявленных изучаемым методом, содержание сцДНК было выше независимо от стадии заболевания (особенно заметной была разница между подгруппами больных со стадией IV), но различия оказались статистически незначимыми ввиду высокой вариабельности показателя. А вот относительное содержание мутантной цоДНК у пациентов этой группы было достоверно выше, чем в подгруппах пациентов, у которых мутации не были обнаружены (p < 0,01–0,03). В этих подгруппах содержание мутантной цоДНК в плазме крови было ниже порога чувствительности метода, использованного в данной работе, который составляет 0,1%.
Мы проанализировали возможную связь результатов молекулярно-генетического исследования до операции с прогнозом заболевания, появлением метастазов и рецидивом.
Срок наблюдения составил 27 мес. В группе пациентов, у которых выявили мутации в сцДНК плазмы крови изучаемым методом до операции (n = 24), у 19 человек (79 %) заболевание прогрессировало, причем 15 человек впоследствии умерли (табл. 2). Во второй группе больных (n = 22) 17 человек были живы в течение всего срока наблюдения, а у 5 человек было отмечено прогрессирование заболевания, они впоследствии умерли. В табл. 2 приведены данные о концентрации сцДНК и относительном содержании мутантной цоДНК в плазме крови. Значения обоих показателей были достоверно выше в подгруппе пациентов с выявленными в цоДНК мутациями и прогрессированием заболевания по сравнению с подгруппой пациентов с невыявленными мутациями и прогрессированием заболевания. В группе пациентов с не выявленными изучаемым методом мутациями содержание сцДНК и мутантной цоДНК было небольшим, что, по-видимому, и не позволило обнаружить мутации. В то же время в случае с 5 больными без прогрессирования заболевания метод усиленной аллель-специфической ПЦР в «реальном времени» был эффективен, несмотря на низкое содержание сцДНК и цоДНК в плазме крови.
Для 35 из 46 участников исследования сцДНК плазмы крови была проанализирована не только до операции, но и на 5 день после хирургического лечения (табл. 3). В группе больных с выявленными мутациями у 13 человек (76 %) зарегистрировано прогрессирование заболевания, 9 человек из этой группы (53 %) имели стадию IV заболевания, из них 5 получили нерадикальное хирургическое лечение. По-видимому, по факту наличия или отсутствия онкоспецифических мутаций в сцДНК плазмы крови можно судить о степени радикальности хирургической операции, предполагая, что у больных с выявленными мутациями и, соответственно, высоким содержанием мутантной цоДНК, очаги опухоли и метастазов были удалены не полностью или имеются метастазы, которые не были диагностированы.
В группе пациентов, у которых не были выявлены мутации в генах RAS-каскада при молекулярно-генетическом исследовании сцДНК, 14 человек (78 %) были живы на протяжении всего срока наблюдения, а у 4 человек было отмечено прогрессирование заболевания. В этой группе 7 человек имели стадию I заболевания, 5 — стадию II, 5 — стадию III и только 1 — стадию IV.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Как известно, при развитии онкологических заболеваний содержание сцДНК в крови достоверно повышается, но при этом не зависит от локализации опухоли [19]. Имеются данные о связи содержания сцДНК в крови с клиническим течением онкологического заболевания [20], причем более высокое по сравнению с нормой содержание сцДНК в крови часто наблюдается уже на ранних стадиях опухолевого процесса, а также может резко возрастать при метастазировании [21]. При этом концентрация сцДНК может сильно различаться у разных пациентов [10]. Это неудивительно, если учесть, что сцДНК может появляться в крови не только в результате гибели клеток опухоли и окружающих ее тканей, но и при естественном разрушении клеток крови. Вклад в общее содержание сцДНК в крови может вносить также секреция опухолевыми клетками фрагментов нуклеиновых кислот, в том числе амплифицированных. Известно, что амплификация отдельных участков генов — достаточно частое событие при опухолевой патологии. В результате общее количество сцДНК у больных с онкологическими заболеваниями сильно варьирует от пациента к пациенту, что не позволяет использовать концентрацию сцДНК в качестве маркера.
Косвенно судить о количестве циркулирующей опухолевой ДНК можно, анализируя определенные онкоассоциированные мутации. При этом важно учитывать, что содержание мутантной цоДНК может значительно отличаться от общего содержания цоДНК: быть ниже за счет гетерогенности новообразования [22]. По этой причине не всегда, особенно на ранних стадиях заболевания, удается определить присутствие цоДНК в плазме крови. В свою очередь, это может приводить к ложноотрицательным результатам и, соответственно, снижать чувствительность метода, используемого для анализа сцДНК. Это подтверждают данные нашего исследования, в котором нам не удалось выявить мутации в генах RAS-каскада у пациентов с ранними стадиями заболевания.
В работе Rachiglio и соавт. [13], посвященной исследованию цоДНК плазмы крови 44 пациентов с немелкоклеточным раком легкого и 35 пациентов с колоректальным раком, продемонстрированы возможности методов NGS и цифровой ПЦР. Генетические изменения (мутации в гене EGFR) в сцДНК, аналогичные выявленным при анализе опухолевой ткани, методом NGS были обнаружены у 77,3 % больных с немелкоклеточным раком легкого и у 2 больных, у которых в опухолевой ткани стандартным методом ПЦР был выявлен дикий тип EGFR. Метод цифровой ПЦР подтвердил наличие мутаций у этих 2 больных как в первичной опухоли, так и в плазме крови. В этом же исследовании в 100 % случаев (6/6) методом NGS в плазме крови были подтверждены мутации в гене KRAS, выявленные стандартным методом ПЦР у пациентов, обследованных до хирургического лечения. В то же время у прооперированных пациентов мутации были обнаружены методом NGS только в 46,2 % случаев (6/13). Авторы полагают, что метод обладает высокой чувствительностью для анализа мутаций цоДНК плазмы крови, однако она зависит от присутствия в организме опухолевого очага и гетерогенности драйверных мутаций.
В другом исследовании методом таргетного секвенирования анализировали образцы плазмы крови и ткани опухоли на наличие соматических драйверных мутаций у 58 пациентов с немелкоклеточным раком легкого [12]. Авторами были выявлены часто встречающиеся драйверные мутации в генах EGFR, KRAS, PIK3CA и TP53, а также более редкие мутации в других генах в цоДНК плазмы крови и ДНК опухолевой ткани, при этом общая конкордантность метода исследования составила 50,4 %, а чувствительность и специфичность — 53,8 и 47,3 % соответственно. Также ими было отмечено, что уровень содержания сцДНК коррелирует с некоторыми клиническими характеристиками больных, включая стадию заболевания и подтип опухоли.
В работе Тu и соавт. [14] при исследовании образцов опухолевой ткани и плазмы крови 19 пациентов с колоректальным раком методом капельной цифровой ПЦР было показано соответствие полученных данных по выявленным мутациям в 73 % случаев.
Результаты нашего исследования, а также данные литературы свидетельствуют о том, что жидкостную биопсию, основанную на анализе цоДНК плазмы крови, можно применять в качестве дополнительного метода диагностики онкологических заболеваний, но преимущественно на более поздних стадиях заболевания, а также в тех случаях, когда биопсия по какой-либо причине трудновыполнима или может вызвать осложнения. На сегодняшний день клиническое значение анализа сцДНК, по-видимому, связано с применением в качестве прогностического исследования при индивидуальном мониторинге заболевания. Нами показано, что у пациентов с мутациями в цоДНК, выявленными методом усиленной аллель-специфической ПЦР как до операции, так и на 5 день после хирургического лечения, заболевание прогрессирует. На основании анализа онкоспецифических изменений в плазме крови до и после лечения можно делать предположения о степени агрессивности опухоли и возможном метастазировании, оценивать эффективность терапии и вносить коррективы в лечение при отсутствии необходимого ответа на него.
ВЫВОДЫ
По-прежнему существуют проблемы, ограничивающие внедрение в рутинную клиническую практику метода жидкостной биопсии. В частности, сохраняется потребность в дешевых, но высокочувствительных методах анализа сцДНК плазмы крови больных с онкологическими заболеваниями. Представленные в работе промежуточные результаты исследования сцДНК плазмы крови пациентов с колоректальным раком стадий I–IV продемонстрировали, что метод усиленной аллель-специфической ПЦР в «реальном времени» более эффективен при выявлении онкоспецифических мутаций на более поздних стадиях заболевания. Возможно, метод сможет занять достойное место среди инструментов молекулярной диагностики в онкологии. Усилия должны быть направленны на его валидацию, а также оценку возможности его применения в различных клинических ситуациях.