2017 / 05

Следующая статья

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Иммунологическая память, формируемая в ответ на вакцинацию противотуберкулезной рекомбинантной вакциной «ГамТБвак»: клинические исследования вакцины на здоровых добровольцах

Д. А. Клейменов1, Е. П. Мазунина1, В. Г. Лунин1, Е. Ю. Коптев1, В. А. Мануйлов1,2, В. А. Гущин1, А. П. Ткачук1
Информация об авторах

1 Лаборатория трансляционной биомедицины,
Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи, Москва

2 Институт молекулярной медицины,
Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова (Сеченовский университет), Москва

3 Кафедра вирусологии, биологический факультет,
Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва

Для корреспонденции: Денис Александрович Клейменов
ул. Гамалеи, д. 18, г. Москва, 123098; ur.relbmar@tel00001

Информация о статье

Финансирование: работа выполнена при поддержке Министерства здравоохранения РФ и ФАНО России (государственное задание № 0574- 2014-0023).

Вклад авторов в работу: Д. А. Клейменов — анализ литературы, планирование исследования, подготовка к исследованию, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи, подготовка финальной версии рукописи; Е. П. Мазунина — анализ литературы, планирование исследования, подготовка к исследованию, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи; В. Г. Лунин — анализ литературы, планирование исследования, подготовка к исследованию, подготовка черновика рукописи; Е. Ю. Коптев, В. А. Мануйлов — анализ литературы, подготовка к исследованию, подготовка черновика рукописи; В. А. Гущин — анализ литературы, планирование исследования, подготовка к исследованию, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи, подготовка финальной версии рукописи; А. П. Ткачук — анализ литературы, планирование исследования, подготовка к исследованию, подготовка черновика рукописи, критический анализ рукописи.

Статья получена: 20.09.2017 Статья принята к печати: 20.10.2017 Опубликовано online: 13.01.2018
|

Согласно расчетам, приведенным в [1], за последние 200 лет от туберкулеза умерло более одного миллиарда человек. Это больше, чем количество людей, скончавшихся в тот же период от оспы, малярии, чумы, гриппа, холеры и СПИДа вместе взятых. К концу XIX в. каждая пятая из смертей от любых причин была связана с туберкулезом [1]. Ситуация изменилась после введения вакцины БЦЖ (BCG, Bacillus Calmette–Guérin) в 20-х гг. 20 в., и в какой-то момент была надежда полностью победить туберкулез, учитывая радикальное снижение заболеваемости в Европе и Америке [2]. Прогресс в борьбе с туберкулезом остановился во многом по причине свойств самой вакцины БЦЖ. Так, было установлено, что вакцинация БЦЖ защищает детей в раннем возрасте от милиарного туберкулеза и туберкулезного менингита, но не способна обеспечить высокую степень защиты от аэрозольных форм инфекции подростков и взрослых. Кроме того, выяснилось, что эффективность вакцинации варьирует от высокой в северных районах Европы и Северной Америки до ничтожной в южных экваториальных районах мира [2]. Таким образом, несмотря на наличие вакцины БЦЖ и на то, что в настоящее время туберкулез является достаточно успешно излечимым заболеванием, он по-прежнему входит в тройку основных причин смерти от инфекционных заболеваний. В 2015 г. зафиксировано 10,4 млн новых случаев активного туберкулеза, и не менее 1,8 млн человек погибли от этой болезни [3].

Другой стороной проблемы туберкулеза является увеличение заболеваемости его мультирезистентными формами. Известно, что в 2015 г. было зафиксировано около полумиллиона новых случаев туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-туберкулеза). Основная проблема МЛУ-туберкулеза — очень высокая стоимость лечения (более $ 10 000 за курс) при прогнозе выздоровления лишь в 50 % случаев. Уже сейчас, по оценкам экспертов, около 50 млн человек во всем мире являются латентно инфицированными МЛУ-туберкулезом. Между тем вероятность перехода латентной формы в активную может быть более 10 % в течение жизни [4]. В России особенно остро стоит проблема распространения МЛУ-туберкулеза. Так, в общей мировой заболеваемости МЛУ-туберкулезом совместный вклад Индии, Китая и России — 45 % [3]. Общая заболеваемость туберкулезом в самой России остается высокой и составляет в среднем 115 на 100 000 жителей, а в отдельных регионах показатель доходит до 160 случаев [5].

Глобальным планом ВОЗ является сокращение заболеваемости туберкулезом на 90 % и смертности от туберкулеза на 95 % к 2035 г. [3]. Эта амбициозная цель не может быть достигнута без разработки новых высокоэффективных вакцин. Из разрабатываемых на сегодняшний день вакцин существенную долю составляют рекомбинантные, включающие в свой состав антигены Mycobacterium tuberculosis, некоторые их которых присутствуют в БЦЖ [6]. Композиции антигенов в таких вакцинах определяются тем, что они разрабатываются как бустерные вакцины, которые направлены на усиление иммунитета, сформированного БЦЖ, а не для первичной вакцинации новорожденных [7]. Примером такого препарата является разработанная авторами рекомбинантная вакцина «ГамТБвак», состоящая из двух фьюжен-белков микобактериальных антигенов (Ag85A и ESAT6-CFP10), слитых с декстран-связывающим доменом (dextran-binding domain, DBD), иммобилизованным на декстране. Адъювант вакцины представлен ДЭАЭ-декстраном и CpG-олигонуклеотидами (агонист рецептора TLR9). Обоснование выбора антигенной композиции вакцины и ее формуляции представлено в нашей предыдущей работе [8].

Доклинические исследования показали высокую иммуногенность и эффективность композиции «ГамТБвак» в модельных экспериментах на мышах и морских свинках [8]. На обеих инфекционных моделях «ГамТБвак» проявила защитный эффект против штамма H37Rv M. tuberculosis как при аэрозольном, так и при внутривенном заражении. Как и предполагалось, «ГамТБвак» показала особенно сильный эффект в случае применения ее в качестве бустерной вакцины на фоне предшествующей иммунизации БЦЖ. Успешное завершение доклинических исследований позволило нам начать клинические исследования по изучению безопасности и иммуногенности вакцины на здоровых добровольцах (далее — КИ) (разрешение Минздрава России от 10.04.2015 № 179; протокол исследования доступен в международной базе данных NIH [9]). В настоящей работе представлены первые результаты экспериментов по изучению иммуногенности вакцины на здоровых БЦЖ-вакцинированных добровольцах.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Дизайн и протокол клинического исследования

Клинические исследования проводились в соответствии с законодательством Российской Федерации, с соблюдением отечественных и международных регуляторных и этических норм [10, 11, 12, 13]. Всего в КИ фазы I/IIa (изучение безопасности и иммуногенности) принимали участие 60 здоровых БЦЖ-вакцинированных добровольцев обоих полов в возрасте от 18 до 49 лет. Дизайн протокола исследования предполагал три этапа (рис. 1). Одним из критериев невключения на этапе скрининга (помимо фармакологических или острых клинических показателей) был положительный результат на наличие латентной туберкулезной инфекции, определяемый лабораторно тестом QuantiFERON-TB Gold (Qiagen, США) [14, 15]. На первом этапе КИ с участием 24 добровольцев изучали безопасность однократного введения вакцины «ГамТБвак», при этом 12 человек получали плацебо, а 12 — 1⁄4 предполагаемой дозы применения. Оценку безопасности проводили при наступлении нежелательных явлений (по классификации ВОЗ, цит. по [16]) в течение 20 нед. наблюдения после введения препарата, включающего медицинское обследование (медицинский осмотр, электрокардиограмма, общие анализы мочи и крови, рентгенограмма органов грудной клетки и др.). Второй этап КИ был посвящен изучению иммуногенности препарата при двукратном введении с двухмесяч- ным интервалом и проходил с участием 12 добровольцев, каждый из которых получил по 1⁄4 предполагаемой дозы применения препарата. Иммуногенность вакцины на данном этапе оценивали по изменению параметров клеточного и гуморального иммунитета испытуемых (см. ниже) в течение 20 нед. после введения препарата. На третьем этапе КИ (который по состоянию на момент выхода публикации завершается и результаты которого не включены в настоящую работу), проводимом для подбора оптимальной дозы, участвуют еще 24 добровольца, половина из которых получила дозу в 1⁄2 рекомендуемой, а оставшиеся — полную (максимальную) дозу вакцины.

Наработка рекомбинантных антигенов M. tuberculosis

Для экспрессии антигенов, входящих в состав вакцины (Ag85A, ESAT6-CFP10), слитых с декстран-связывающим доменом [8], использовали клетки Escherichia coli штамма BL21(DE3) pLysS, культуры растили на питательной среде LB (lysogeny broth), содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл хлорамфеникола, при температуре 37 °C и перемешивании. Индукцию экспрессии проводили при оптической плотности культуры 0,7–1 (при 600 нм) путем добавления к суспензии изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 0,5 мМ и продолжали инкубацию при 30 °C в течение 4 ч при перемешивании. Бактериальную культуру E. coli после проведения экспрессии центрифугировали 20 мин при 6000 g и 4 °С. Осадок бактерий лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl с pH 8, 200 мМ NaCl, Тритон-X100 0,1 % по объему, после растворения клеток в буфере добавляли лизоцим до 25 мкг/мл и инкубировали в течение 30 мин при RT, затем проводили обработку ультразвуком. В зависимости от используемого метода выделение рекомбинантных антигенов проводили либо из фракции осадка после лизиса клеток, либо из фракции супернатанта. Центрифугирования лизата проводили при 17 000 g в течение 20 мин.

Препараты Ag85A-his8, DBD-his8, ESAT6-his8 получали из лизатов культур-продуцентов, несущих экспрессионный вектор pET42b с соответствующими вставками генов, кодирующих белки M. tuberculosis. Экспрессируемые белки оказывались в нерастворимой фракции лизата — тельцах включения. Перед растворением телец включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, мы проводили три раунда их отмывки от растворимых белковых и небелковых примесей лизирующим буфером, осаждая центрифугированием. Растворенные в 8 М мочевине микобактериальные антигены ренатурировали с помощью пульс-ренатурации и проводили очистку на аффинной хроматографической колонке HisPrep FF 16/10 (GE, США) по стандартному протоколу, рекомендованному производителем.

Препарат антигена CFP10 получали из лизатов культур-продуцентов, несущих экспрессионный вектор pTXB1, с соответствующей вставкой гена, кодирующего белок CFP10. Очистку растворимого белка CFP10 проводили с использованием аффинного хроматического сорбента Chitin Resin (NEB, США) по стандартному протоколу, рекомендованному производителем.

Определение клеточного иммунитета

Для определения Т-клеточной популяции, чувствительной к антигенам M. tuberculosis, использовали подход, известный как IGRA-тест (interferon-gamma release assay [17, 18]), в ранее описанной нами модификации [19]. Кратко, для этого 100 мкл цельной крови, отобранной в вакуумную пробирку с гепарином лития в качестве антикоагулянта и содержащей лейкоцитарную фракцию, добавляли к 600 мкл полной ростовой среды (90 % среда 199, 10 % эмбриональная телячья сыворотка, 2 мМ L-глутамин, 10 мМ HEPES, 50 мкг/мл гентамицина сульфат; производитель компонентов — «ПанЭко», Россия). Описанным образом для каждой пробы получали четыре аликвоты. В два раствора добавляли рекомбинантные антигены, входящие в состав вакцины «ГамТБвак»: DBD-Ag85А и DBD-ESAT6-CFP10, с конечной концентрацией в ПРС 50 мкг/мл. Отдельно в среду с кровью добавляли неспецифический индуктор интерферона-гамма в лимфоцитах (конканавалин А из Canavalia ensiformis производства Sigma-Aldrich, Германия) в качестве положительного контроля стимуляции и отрицательный контроль (стерильный бессолевой 20 мМ ТРИС, рН 7,5). Таким образом, для каждого из образцов крови проводили четыре реакции стимуляции в отдельных пробирках: антигенами DBD-Ag85А, DBD-ESAT6- CFP10, положительным и отрицательным контролями. Среду с кровью, содержащую живые лимфоциты, стимулирующие антигены и контроли, инкубировали в течение 72 ч в стерильных влажных условиях при +37 °С. После завершения инкубации количество интерферона-гамма в среде определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора А-8752 гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ («Вектор-Бест», Россия). Положительный ответ на стимуляцию учитывали как превышение уровня интерферона-гамма над уровнем спонтанной продукции в образце с отрицательным контролем [15, 19]. Для каждого из 12 участников данного этапа исследования забор крови и стимуляцию клеток антигенами проводили перед введением вакцины (0-й день) и на 1, 42, 63, 98 и 140-й дни после иммунизации.

Проведение суспензионного иммунологического анализа для определения гуморального иммунитета

Для серологического определения уровня антител отдельно к антигенам Ag85А, ESAT6, CFP10, DBD, а также к их фьюжен-формам DBD-Ag85А, DBD-ESAT6-CFP10, с использованием полученных рекомбинантных белков были разработаны шесть соответствующих моноплексных тест-систем на основе технологии xMAP (Luminex Corporation, США) [20].

Оптимальные для каждого антигена или фьюжен-формы количества (от 5 до 20 мкг/106 микросфер) коньюгировали с 6 регионами (таблица). Сенсибилизацию микросфер выполняли в соответствии с протоколом, приведенным в официальном издании компании Luminex «The xMAP Cookbook, 3rd ed.» [20], методом карбодиимидной химии.

Микросферы (1 × 106 шт) активировали 10 мкл 50 мг/мл (в дист. H2O) 1-Этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимид гидрохлорид (EDC) и 10 мкл 50 мг/мл (в дист. H2O) N-гидроксисульфосукцинимида натриевая соль (s-NHS) в 80 мкл активирующего буферного раствора (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2) в течение 20 мин при 25 °С с вращением 20 об/мин. После этого активированные микросферы промывали два раза и ресуспендировали в 500 мкл буферного раствора для связывания (50 мM MES, pH 5,0) с добавлением каждого из антигенов к своему региону. После инкубации в течение 2 ч в темноте при 25 °С с вращением 20 об/мин и трех этапов промывки блокирующим буферным раствором микросферы ресуспендировали в 1 мл буферного раствора для хранения и использовали для анализа не менее чем через 16 ч. Подсчет микросфер, оставшихся после процедуры сенсибилизации, осуществляли с помощью автоматического счетчика клеток TC20 (Bio-RAD Laboratories, США). В качестве блокирующего буферного раствора/буферного раствора для хранения сенсибилизированных микросфер использовали PBS-TBN (PBS, 0,1 % BSA, 0,02 % Tween-20, 0,05 % NaN3).

Процедуру постановки иммунологического анализа проводили по схеме непрямого серологического исследования в соответствии с протоколом [20]. В лунку планшета (96-луночный, полистирол, Microlon, плоскодонный прозрачный; Greiner, Австрия) добавляли 50 мкл PBS-TBN с 2500 микросферами одного региона и 50 мкл сыворотки, предварительно разведенной PBS-TBN в 50 раз (итоговое разведение сыворотки 1 : 100). Смесь инкубировали на шейкере-термостате PST-60HL-4 (Biosan, Латвия) 60 мин, при +25 °C и 800 об/мин. Далее проводили отмывку с по- мощью ручного магнитного сепаратора MILLIPLEX (Merck Millipore, Германия): 2 цикла добавления–перемешивания на шейкере, 30 с, 800 об/мин — удаления 100 мкл PBS- TBN в каждой лунке (такие условия отмывки применяли на всех этапах). Затем микросферы ресуспендировали в 50 мкл PBS-TBN и к ним добавляли 50 мкл препарата козьих антител против IgG человека, коньюгированных с фикоэритрином (One Lambda/Thermo Fisher Scientific Inc., США) в концентрации 5 мкг/мг в PBS-TBN. Итоговое разведение коньюгата в каждой лунке соответствовало 2,5 мкг/мл. Смесь вновь инкубировали на шейкере-термостате 30 мин, при +25 °C и 800 об/мин,а затем вновь отмывали. По окончании отмывки ресуспендировали микросферы в 100 мкл PBS-TBN. Для обработки результатов использовали анализатор MAGPIX (Luminex, США). В расчет брали не менее 100 микросфер каждого региона на лунку.

Количественный учет результатов детекции антител осуществляли в единицах MFI (median fluorescence intensity). Для каждого образца из полученного значения вычиталось значение отрицательного контроля (нормальная кроличья сыворотка). Для каждого из 12 участников данного этапа исследования забор сыворотки крови и определение уровня антител ко всем перечисленным антигенам проводили перед введением вакцины (0-й день) и на 1, 42, 63, 98 и 140-й дни после иммунизации.

Статистическая обработка данных

Обработку данных проводили с использованием программ MS Excel и GraphPad Prism 6. Статистическую значимость различий для клеточного и гуморального ответа определяли с использованием критерия Вилкоксона для сопряженных пар. Различия считали значимыми при значении p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Безопасность вакцины «ГамТБвак» в минимальной дозе

В ходе КИ (рис. 1) нежелательных явлений, в том числе серьезных, не зафиксировано. Все выявленные отклонения лабораторных показателей и показателей ЭКГ были расценены исследователями сертифицированного клинического центра [9] как клинически незначимые. Отмечены случаи развития гиперемии в месте введения препарата, которая регистрировалась у 6 добровольцев через 24 ч после введения препарата «ГамТБвак» и купировалась самостоятельно на 3-й день. Данное изменение описано в инструкции к исследуемому препарату, имеет первую степень тяжести по классификации ВОЗ [16] и не было расценено как клинически значимое. Таким образом, можно заключить, что препарат «ГамТБвак» в 1⁄4 предполагаемой дозы применения [8]: белковый антиген DBD-Ag85A (микобактериальный белок Ag85A, слитый с декстран-связывающим доменом) — 0,006 мг; белковый антиген DBD-ESAT6-CFP10 (микобактериальный белок ESAT6, слитый с микобактериальным белком CFP10, слитый с декстран-связывающим доменом) — 0,006 мг; декстран с молекулярной массой 500 000 Да — 2,5 мг; ДЭАЭ-декстран с молекулярной массой 500 000 Да — 0,125 мг; СpG-олигонуклеотиды с последовательностью 5’-ggGGGACGA:TCGTCgggggg-3’ — 0,0375 мг, — обладает высоким уровнем безопасности.

Клеточный иммунитет

Клеточный иммунитет играет ключевую роль в защите от туберкулезной инфекции, поэтому изучение клеточного иммунитета в ответ на вакцинацию — основная задача для подтверждения иммуногенности вакцин против туберкулеза [6, 21, 22]. Наиболее часто используемым методом является оценка секреции лимфоцитами ИНФ-γ в ответ на стимуляцию антигенами, входящими в состав вакцины, в модификациях, использующих IGRA-тест, метод ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot), проточную цитометрию. В случае изучения иммуногенности вакцины «ГамТБвак» была использована модификация IGRA-теста.

В экспериментах по определению выработки ИНФ-γ Т-лимфоцитами в ответ на стимуляцию рекомбинантными антигенами M. tuberculosis было обнаружено, что оба антигена, входящих в состав вакцины: DBD-Ag85A и DBD-ESAT6-CFP10, индуцируют достоверное повышение продукции ИНФ-γ (рис. 2, А, Б). При этом достоверное повышение ответа на DBD-Ag85A проявляется уже после первой иммунизации с 42-го дня. Поскольку Ag85A экспрессируется M. bovis, а все добровольцы, принимавшие участие в клинических исследованиях, были вакцинированы БЦЖ согласно календарю профилактических прививок, ранний клеточный ответ на Ag85A можно объяснить проявлением бустерного эффекта к БЦЖ [9]. Клеточный ответ на DBD-ESAT6-CFP10 становится выраженным через месяц после второй иммунизации «ГамТБвак», начиная с 98-го дня. На 140-й день с момента первой вакцинации у 10 (83 %) из 12 иммунизированных «ГамТБвак» добровольцев сохранялся положительный клеточный ответ на все антигены, входящие в состав вакцины, по сравнению с уровнем до вакцинации.

Таким образом, можно заключить, что используемая в составе вакцины «ГамТБвак» антигенная композиция является иммуногенной и приводит к формированию Т-клеточного ответа. При этом оба антигенных фьюжена обладают выраженной иммуногенностью, но с разной динамикой развития иммунного ответа.

Гуморальный иммунитет

Изучение динамики накопления в сыворотке крови испытуемых антител класса G к антигенам, входящим в состав вакцины «ГамТБвак» (DBD-Ag85A и DBD-ESAT6-CFP10), показало, что оба антигенных фьюжена в той или иной мере индуцируют выработку антител (рис. 2, В–З). Антиген DBD-ESAT6-CFP10 оказался более сильным индуктором гуморального иммунитета (рис. 2, В). Достоверное повышение антительного ответа наблюдалось с 63-го дня после первой иммунизации. В последней точке наблюдений (140-й день) у 11 (92 %) из 12 добровольцев было показано наличие антител к данному фьюжену. Детальный анализ иммуногенности отдельных антигенов в составе фьюжена показал, что оба смысловых антигена CFP10 (рис. 2, Г) и ESAT6 (рис. 2, Д) индуцировали выработку IgG антител с 98-го и 140-го дней наблюдения соответственно (р** = 0,0022 и р* = 0,034). Любопытно, что DBD также проявил иммуногенность в составе фьюжена, причем даже раньше, чем смысловые антигены, начиная с 63-го дня (рис. 2, Е) после иммунизации.

Другой фьюжен DBD-Ag85A показал сравнительно низкую иммуногенность (рис. 2, Ж). Достоверные различия по этому антигену наблюдались с 98-го дня (р* = 0,041) после иммунизации. Однако статистический анализ данных показал отсутствие достоверной связи (р > 0,05) между вакцинацией и продукцией IgG антител к Ag85A (рис. 2, З).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В рамках проведенной части I фазы клинических испытаний вакцины «ГамТБвак» показано, что при двукратном введении вакцина обладает приемлемым профилем безопасности в изученных дозах для здоровых БЦЖ-вакцинированных добровольцев, не имеющих латентной инфекции. Серьезных нежелательных явлений не выявлено ни у одного из пациентов. Отмечены случаи развития гиперемии в месте введения препарата, которая была зарегистрирована у 6 добровольцев через 24 ч после введения препарата «ГамТБвак» и купировалась самостоятельно на 3-й день. Данное изменение описано в инструкции к исследуемому препарату, имеет первую степень тяжести по классификации ВОЗ [16] и не было расценено как клинически значимое.

Полученные результаты показали, что клеточное звено иммунитета активировалось у 10 (83 %) из 12 добровольцев, получивших вакцину «ГамТБвак». При этом антиген DBD-Ag85A стимулировал бустерный эффект, проявившийся уже после первой иммунизации (рис. 2, А). Наиболее вероятно, что эффект активировал именно Ag85A, так как в случае второго антигена DBD-ESAT6-CFP10 развитие иммунологической памяти наблюдали только после второй иммунизации (рис. 2, Б). В рамках проведенного исследования не был изучен вклад каждого из антигенов фьюжена в отдельности в активацию клеточного звена иммунитета. Между тем ранее на мышиной модели вклад каждого из антигенов «ГамТБвак» был детально исследован [8]. Так, было показано, что наибольшую иммуногенность проявляют Ag85A и ESAT6, тогда как эффект CFP10 менее выражен, хотя и достоверен при использовании в бустерной вакцинации после БЦЖ. Тогда же было изучено, что вклад DBD в активацию клеточного звена иммунитета является незначительным [8]. Это соответствует результатам ранее проводимых других клинических исследований. Так, в серии клинических исследований рекомбинантных вакцин (H1, H4, H56), проводимых Государственным институтом сывороток (Копенгаген, Дания), было показано, что Ag85, как и ESAT6, проявляют высокую иммуногенность [21, 22, 23]. Формируемую данными антигенами клеточную память наблюдали в течении полугода после первой иммунизации. В рамках данного исследования иммунизация «ГамТБвак» ведет к формированию клеточной памяти, достоверно сохраняющейся на финальный 140-й день исследований.

Вопреки классическим представлениям о преимущественной роли клеточного иммунитета для борьбы с туберкулезом, в последние несколько лет все более значимая роль отводится гуморальному иммунитету [6, 24]. В этой связи изучение активации гуморального звена иммунитета противотуберкулезными вакцинами приобретает все большее значение. В случае «ГамТБвак» гуморальный ответ формировался на все антигены фьюжена DBD-ESAT6- CFP10 (рис. 2, В–Е). Наиболее ранний и сильный ответ был отмечен в отношении антигена CFP10 (рис. 2, Г). Таким образом, CFP10 является индуктором как клеточного, так и гуморального иммунитета. Достоверный ответ на ESAT6 появляется позднее и с меньшей интенсивностью, но, по всей видимости, все же вносит свой вклад в общую иммуногенность DBD-ESAT6-CFP10 (рис. 2, В, Д).

Устойчивый и сильный гуморальный ответ на «вспомогательный» антиген DBD (рис. 2, Е), разумеется, не имеет отношения к защите от туберкулеза, однако антитела к DBD могут служить в будущих исследованиях в качестве серологического маркера и стать индикатором проведенной иммунизации в случае недокументированного вакцинального статуса пациента, что важно в популяционных исследованиях и для нужд персонализированной медицины.

Неожиданной оказалась низкая иммуногенность антигена Ag85A в отношении гуморального иммунитета (рис. 2, З), который, по всей видимости, не вносит вклада в общую иммуногенность DBD-Ag85A (рис. 2, Ж). В экспериментах на животных Ag85A индуцировал высокий титр антител как в случае применения «ГамТБвак» в качестве единственной вакцины, так и в случае бустерной после иммунизации БЦЖ [8]. Отсутствие стимуляции гуморального иммунитета можно объяснить неправильным фолдингом Ag85A, используемого для конъюгации с микросферами xMAP. Против данного предположения говорит тот факт, что у части добровольцев титр антител, по всей видимости, является априорно высоким во всех исследуемых точках. Вторым объяснением может быть то, что именно повышенный титр антител, имеющихся после вакцинации БЦЖ, приводит к быстрой нейтрализации небольших количеств белка, приносимых вакцинацией, без запуска бустерного эффекта. Проверка данных предположений требует отдельных экспериментов.

Изучение вклада каждого из антигенов в развитие гуморального иммунитета при проведении доклинических и клинических исследований противотуберкулезных вакцин является важным в свете смещения парадигмы относительно роли гуморального ответа в туберкулезной инфекции [24]. Между тем для большинства исследований противотуберкулезных вакцин вообще не приводятся данные по антительному ответу [22, 23] или приводятся для всех антигенов без дифференциации [21]. Приведенные данные по «ГамТБвак» показывают, что антигены в составе вакцины могут иметь диаметрально противоположный вклад в иммунологическую память клеточного и гуморального типа.

ВЫВОДЫ

Изучаемая рекомбинантная вакцина «ГамТБвак» обладает необходимым уровнем безопасности и активирует клеточное и гуморальное звенья адаптивного иммунитета, формирует клеточную память. В рамках проведенного исследования получены данные, указывающие на формирование устойчивого клеточного и гуморального иммунитета при введении 1⁄4 теоретически расчетной дозы. Это позволяет рассчитывать на успешное завершение текущей фазы клинических исследований (Этапа 3), в ходе которых иммуногенность вакцины будет доказана с использованием альтернативных высокотехнологичных методов, таких как проточная цитометрия и анализ транскриптома клеток иммунной системы. Положительные результаты послужат основанием для начала фазы IIb, целью которой будет подтверждение профилактической эффективности вакцины.

КОММЕНТАРИИ (0)