Рыба Danio rerio используется в качестве модельного объекта во многих современных медико-биологических исследованиях in vivo. По сравнению с другими лабораторными животными D. rerio имеет ряд преимуществ: рыб легко содержать в лабораторных условиях, при этом они дают большое количество потомства, которое быстро развивается. Из-за прозрачности тканей на ранних стадиях развития данный объект хорошо подходит для микроскопии. Кроме того, геном этого организма хорошо изучен, что позволяет легко осуществлять различные генные модификации. Благодаря этим достоинствам D. rerio часто используют для изучения функций генов, а также в исследованиях в области биологии развития позвоночных. Поскольку биохимические процессы и функциональная активность белков в клетках рыбы имеют много общего с процессами и активностью белков в клетках млекопитающих, D. rerio успешно применяют для моделирования человеческих заболеваний, а также скрининга лекарственных препаратов и тестирования токсичности соединений на стадии доклинических испытаний.

За последние годы на основе рыбы D. rerio было смоделировано много заболеваний. В качестве примеров можно привести острый лимфобластный лейкоз [1–3], меланому [4, 5], мышечную дистрофию [6], сахарный диабет [7], заболевания различных органов, включая сердце [8–10], почки [11, 12], заболевания центральной нервной системы [13, 14], в том числе ишемию головного мозга [15, 16]. Используя такие модели, можно исследовать, как влияют разные химические соединения на изучаемый физиологический или патологический процессы. В самом простом варианте тестируемое соединение может быть добавлено непосредственно в воду, поскольку вещество попадет в кровь животного через жабры. Однако большинство исследований проводят на мальках D. rerio, поэтому эффективную доставку вещества в организм можно осуществить напрямую с помощью его инъекции в желточный мешок эмбриона. Например, в ряде работ таким образом исследовали кардиотоксичный эффект некоторых препаратов (аспирин, кломипрамин, нимодипин, верапамил и др.) [17, 18]. Кроме этого, в мальков можно инъецировать метаболиты, которые в норме участвуют в различных биохимических процессах, как, например, глюкоза, которую вводили в эмбрион в многократном избытке для изучения профиля экспрессии генов, вовлеченных в метаболизм углеводов [19]. Кроме молекул различных веществ в мальков D. rerio инъецировали клетки других организмов: бактериальные клетки для наблюдения за развитием инфекции [20–22] и даже клетки млекопитающих для исследования роста опухолей определенного вида [23, 24].

Исследования физиологических и патологических процессов in vivo вышли на новый уровень с появлением генетически кодируемых биосенсоров на основе флуоресцентных белков. Каждый такой биосенсор представляет собой химерную белковую молекулу, которая, как правило, состоит из сенсорной и флуоресцентной частей. Сенсорный домен чувствителен к изменению определенного биологического параметра, например внутриклеточной концентрации интересующего соединения. При этом флуоресцентная часть биосенсора позволяет визуализировать взаимодействие сенсорного домена и соединения и интерпретировать полученный сигнал. Такие биосенсоры кодируются геном, который можно внести в любой живой организм. Главное преимущество этого подхода заключается в том, что регистрацию интересующего параметра можно осуществлять в живом объекте в режиме реального времени [25]. Во многих случаях генетически кодируемые биосенсоры являются безальтернативным методом исследования сложных биологических процессов. Флуоресцентные биосенсоры неоднократно применяли в модельном объекте D. rerio, в том числе для изучения процессов эмбриогенеза [26], воспаления [27], регенерации органов [28].

В настоящей работе мы впервые протестировали генетически кодируемый биосенсор SoNar [29] для регистрации цитоплазматического окислительно-восстановительного статуса никотинамидадениндинуклеотида (НАД(Н)) в тканях D. rerio. Соотношение окисленной формы (НАД⁺) и восстановленной (НАДН) имеет важнейшее значение не только для энергетического метаболизма клетки, но и регуляции многих сигнальных каскадов [30–32]. Мы также установили, как соотношение НАД⁺/НАДН изменяется в желточном мешке и теле эмбриона D. rerio при инъекции таких важных метаболитов, как лактат и пируват.

Биосенсор SoNar [29] был создан на основе бактериального белка T-Rex из Thermus aquaticus, который является важным регулятором транскрипции некоторых ферментов в ответ на изменение внутриклеточного соотношения НАД⁺/НАДН. В подвижную область этого белка был интегрирован флуоресцентный белок cpYFP. Конформационные изменения, которые происходят при связывании белком T-Rex НАД⁺ или НАДН, передаются на флуоресцентный белок, изменяя его спектральные свойства (рис. 1). Для спектра возбуждения флуоресценции SoNar характерно наличие двух пиков в области 420 и 490 нм, при этом для сенсора характерен один пик эмиссии с максимумом 518 нм. Сигнал биосенсора рассчитывается как соотношение значений интенсивности флуоресценции, независимо возбуждаемой при 420 и 490 нм (F₄₂₀/F₄₉₀) [29]. Таким образом, сигнал имеет рациометрический характер, что особенно важно при работе in vivo, поскольку позволяет избежать артефактов, связанных с разным уровнем экспрессии сенсора в разных клетках, подвижностью объекта и изменением его формы, толщиной тканей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Рыбы Danio rerio линии AB/TL содержались в специально оборудованном помещении при 26,5 °С с заданным режимом день–ночь 12 : 12. Все эксперименты над животными осуществляли в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации. Для получения потомства родительских особей D. rerio за 4 ч до завершения светового дня попарно отсаживали в отдельные контейнеры, содержавшие по 500 мл среды Е3. С наступлением светового дня собирали икру животных.

Для получения мальков D. rerio, экспрессирующих в тканях нужные генетически кодируемые биосенсоры (в работе использовали биосенсоры SoNar [29] и SypHer-2 [33]), мы нарабатывали in vitro их мРНК, используя коммерческий набор mMessage mMachine SP6 Transcription kit (Ambion, США). Далее 1 нл мРНК интересующего биосенсора с концентрацией 0,1 мкг/мкл инъецировали в желточные мешки эмбрионов рыб на стадии одной клетки с помощью микроинъектора Eppendorf Microinjector 5242. Инъецированные эмбрионы далее содержали в чашках Петри при 26,5 °С в комнате с заданным режимом день–ночь 12 : 12. Через 24 ч после микроинъекции эмбрионы скринировали под флуоресцентным микроскопом и отбирали флуоресцирующих. Перед микроскопией отобранные эмбрионы вручную извлекали из хорионов, обездвиживали в 0,02 % растворе трикаина и заключали в капле 1,5 % легкоплавкой агарозы. Растворы метаболитов (лактата натрия и пирувата натрия) инъецировали в желточные мешки обездвиженных мальков в объеме 1 нл раствора концентрацией 200 мМ. Предварительно в экспериментах регистрировали исходные значения сигналов биосенсоров в выбранных областях каждой особи.

Микроскопию рыб проводили с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа Leica DM6000 (Leica, Германия), оснащенного объективом HC PL FLUOTAR 10.0*0.30 DRY. Для возбуждения флуоресценции использовали фильтры CFP BP436/20 и GFP BP470/40 (Leica). Режим съемки составлял 1 кадр в минуту.

Обработку изображений данных, полученных с помощью микроскопа, выполняли с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH). Построение графиков динамики изменения сигнала сенсоров и статистическую обработку данных в каждой временной точке проводили с помощью программы OriginPro 8.6 (OriginLab, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мы протестировали работу генетически кодируемого биосенсора SoNar [29] для регистрации соотношения НАД⁺/НАДН в тканях рыбы D. rerio. Для этого мы наработали мРНК биосенсора и инъецировали ее в желточные мешки эмбрионов рыб на стадии одной клетки. Через сутки с помощью флуоресцентного микроскопа мы отобрали флуоресцирующих особей для дальнейшей микроскопии. Регистрацию флуоресценции SoNar проводили в двух независимых каналах микроскопа, возбуждение флуоресценции в каждом из которых соответствует двум пикам биосенсора в его спектре возбуждения флуоресценции (рис. 1). Для этого мы получали изображение рыбы с возбуждением флуоресценции при 420 нм (F₄₂₀) и отдельно — изображение этой же рыбы при возбуждении флуоресценции в области 490 нм (F₄₉₀). Далее с помощью программного обеспечения ImageJ мы делили изображения двух каналов друг на друга и в результате получали изображение рыбы, которое раскрашивали в псевдоцвета, соответствующие значениям соотношения F₄₂₀/F₄₉₀ (рис. 2, A, Г). Далее с помощью программы ImageJ на теле малька выбирали области, для которых производили расчеты. Графики, которые отображают в отмеченных областях динамику изменения соотношения F₄₂₀/F₄₉₀, строили с помощью программы OriginPro 8.6.

Для регистрации динамики изменения соотношения НАД⁺/НАДН с помощью биосенсора SoNar в тканях малька D. rerio мы использовали пируват и лактат. Известно, что метаболическая пара лактат/пируват находится в равновесии со свободными формами НАД⁺/НАДН в цитоплазме клеток благодаря реакции, катализируемой ферментом лактатдегидрогеназой [34, 35]. Поэтому в желточные мешки 10 эмбрионов D. rerio мы инъецировали по 1 нл 200 мМ раствора лактата натрия и других 11 мальков — также по 1 нл 200 мМ раствора пирувата натрия. Во всех случаях мы предварительно регистрировали в динамике сигнал биосенсора в тканях до инъекции. Стартовое значение сигнала биосенсора мы приравнивали к 1. После инъекции мальков как можно быстрее вновь помещали под флуоресцентный микроскоп и возобновляли съемку при тех же настройках. В случае с инъекцией лактата в желточном мешке и теле эмбриона наблюдалось значительное увеличение сигнала F₄₂₀/F₄₉₀, что свидетельствовало о восстановлении пула НАД(Н) (рис. 2, Б). Одинаковую динамику изменения сигнала биосенсора в различных областях тела животного можно объяснить быстрой доставкой веществ из желточного мешка в другие органы. Сигнал достигал своего максимального значения уже через 5 мин с момента инъекции, после чего снижался примерно до своего первоначального значения в течение 30 мин, поскольку лактат метаболизировался клеточными системами. При инъекции в желточные мешки эмбрионов рыб раствора пирувата мы ожидали увидеть обратный эффект. Однако сигнал биосенсора SoNar (F₄₂₀/F₄₉₀) уменьшился лишь в желточном мешке мальков, в то время как в теле животных он даже незначительно возрастал (рис. 2, Д). Это означает, что при инъекции пирувата в разных органах малька рыбы происходят противоположно направленные окислительно-восстановительные события с внутриклеточным пулом НАД(Н): окисление в желточном мешке и незначительное восстановление в теле эмбриона.

Транспорт лактата и пирувата в клетки может сопровождаться изменением значения рН, поскольку осуществляется в симпорте с Н⁺ [36, 37]. Из-за структурных особенностей хромофора флуоресцентные белки чувствительны к изменениям рН окружения [38]. Чтобы оценить возможное влияние рН на динамику изменения сигнала SoNar в нашем эксперименте, в качестве контроля мы использовали биосенсор SypHer2, ранее разработанный в нашей лаборатории для регистрации рН [33]. Мы получили мРНК биосенсора SypHer2 и провели аналогичную серию экспериментов. Инъекции растворов лактата и пирувата не вызывали изменений рН в теле мальков. В желточном мешке оба метаболита вызывали лишь незначительное повышение рН, процесс развивался медленно в течение примерно 20 мин с момента инъекции (рис. 2, В, Е).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты позволяют заключить, что генетически кодируемый биосенсор SoNar для регистрации динамики изменения соотношения НАД⁺/НАДН успешно может быть использован в исследованиях на моделях рыбы D. rerio. Этот важнейший биологический параметр может сильно изменяться при разнообразных патологических состояниях клеток. Используя модель определенного заболевания на рыбе D. rerio, конкретные ткани или клетки которой экспрессируют биосенсор SoNar, можно эффективно оценивать влияние различных веществ на соотношение НАД⁺/НАДН и, следовательно, на изучаемый патологический процесс.

Мы наблюдали, что инъекция лактата в желточный мешок эмбриона D. rerio приводит к значительному и одновременному восстановлению пула НАД(Н) во всех тканях организма рыбы. Однако инъекция пирувата вызвала окисление пула НАД(Н) лишь в желточном мешке, в то время как в теле эмбриона наблюдалось даже незначительное восстановление. В одной из недавних работ на модели D. rerio исследовали роль окислительно-восстановительных процессов при эмбриогенезе. Было показано, что мощное окисление происходит с момента начала стадии гаструлы, которое уменьшается лишь к достижению мальком возраста 3 дней. В этой работе было показано, что окислительный стресс играет ключевую роль в развитии некоторых органов в ходе эмбриогенеза [26]. Можно предположить, что мы не увидели значительного окисления в тканях тела эмбриона рыбы после инъекции пирувата, поскольку на этой стадии развития в тканях эмбриона многие окислительно-восстановительные процессы уже смещены в сторону окисления. Примечательно, что в приведенной нами статье, в которой исследовали окислительно-восстановительные процессы при эмбриогенезе, наименьший уровень активных форм кислорода, в частности пероксида водорода, наблюдался в желточном мешке, в котором мы как раз наблюдали динамику окисления НАД(Н) после инъекции пирувата. Незначительное восстановление пула НАД(Н) в теле малька при этом можно объяснить влиянием компенсаторных биохимических процессов.

Альтернативное объяснение состоит в том, что в желточном мешке пируват восстанавливается до лактата, что подтверждается падением концентрации НАДН, но в тело малька предпочтительнее транспортируется именно лактат, благодаря чему мы регистрировали изменение сигнала биосенсора в сторону незначительного роста концентрации НАДН. Однако подтверждение этих гипотез требует проведения отдельного исследования.

ВЫВОДЫ

В нашей работе мы впервые показали, что генетически кодируемый биосенсор SoNar для регистрации соотношения НАД⁺/НАДН может быть использован в тканях D. rerio. Инъекция лактата в желточный мешок однодневных эмбрионов рыб приводит к быстрому восстановлению пула НАД(Н) во всех тканях животного, таким образом, пул веществ в желточном мешке хорошо сообщается с другими тканями. Инъекция пирувата вызвала окисление лишь в желточном мешке, в то время как в теле малька наблюдалось незначительное восстановление. Используя биосенсор SypHer2, мы установили, что при инъекции пирувата и лактата незначительные изменения рН происходят только в желточном мешке.