Среди живых существ встречаются тысячи видов, способных к излучению света. Такие виды называются биолюминесцентными. Большинство из них обитает на глубине морей и океанов, однако и на поверхности распространены светящиеся насекомые, черви, грибы. В процессе биолюминесценции происходит химическое окисление небольшой молекулы люциферина кислородом воздуха под действием белка люциферазы: квант света в видимой области спектра является одним из продуктов этой реакции. На ее основе были разработаны различные методы биолюминесцентного имиджинга (получения изображения в живом организме), нашедшие свое применение в области медицинских исследований, в особенности при изучении опухолевых заболеваний, и разработке лекарственных препаратов. В последние годы биоимиджинговые технологии становятся все более популярными ввиду беспрецедентной чувствительности при получении изображения в живом организме (вплоть до нескольких отдельных клеток).

Среди природного разнообразия уникальных пар «люциферин–люцифераза» (по разным оценкам, их около 40 [1]) реальное применение пока находят только хорошо изученные биолюминесцентные системы, а именно: система на основе D-люциферина светляка, бактериальная и целентеразиновая системы. При этом каждому люциферину соответствует набор «комплементарных» люцифераз из разных организмов. Например, для D‑люциферина известны около 30 природных люцифераз, для целентеразина — около 15 люцифераз и 8 фотопротеинов (стабильных субстрат-белковых комплексов) [2]. Как только становится известна аминокислотная последовательность природной люциферазы, появляется принципиальная возможность поместить кодирующий ее ген в другой организм и таким образом добиться экспрессии данного белка в изучаемых клетках. При добавлении люциферина извне нужные клетки будут люминесцировать, что и можно будет зафиксировать как аналитический сигнал. Помимо биоимиджинга тканей и клеток возможен имиджинг отдельных органелл и даже межклеточных/межбелковых взаимодействий. А при условии одновременного использования разных люциферинов, их функциональных аналогов и разных люцифераз (как природного типа, так и мутантных) возможности имиджинга возрастают многократно — становится реальным проведение мультицветовых исследований [3, 4, 5, 6].

Биолюминесцентные методы в медицине

Самое широкое распространение в медицинских исследованиях получила биолюминесцентная реакция D‑люциферина светляка. Ее особенность в том, что она проходит только в присутствии кофактора аденозинтрифосфата (АТФ). Поэтому получение биолюминесцентного сигнала возможно только в условиях наличия АТФ, что позволяет однозначно определять концентрацию АТФ с помощью биолюминесценции. Поскольку в клетках АТФ работает как универсальный энергоноситель, то измерение его концентрации помогает оценить их метаболический потенциал, а также цитотоксичность различных препаратов или их влияние на пролиферацию клеток [7]. В то же время для работы бактериальной биолюминесцентной системы необходимо наличие таких кофакторов, как флавиномононуклеотид (ФМН) и никотинамидадениндинуклеотид (НАДН). Эта особенность используется для разработки аналитических методов биолюминесцентного определения НАД(Ф)Н, дегидрогеназ и, соответственно, различных метаболитов, окисление которых сопровождается восстановлением НАД⁺ до НАДН: малата, сорбита, этанола и т. д. Совместное применение светляковой и бактериальной люминесцентных систем позволяет создавать метаболические карты опухолевых тканей и находить возможные подходы к лечению опухолей [8, 9, 10].

Безусловно, наиболее полную картину развития ракового заболевания позволяют получить опухолевые модели in vivo. Следить за метастазированием клеток и ангиогенезом, а также ответом на лечение в глубоких тканях можно с использованием имиджинговых технологий, таких как МРТ, ПЭТ, радиография и др. По сравнению с традиционными методами биолюминесцентный имиджинг гораздо более предпочителен ввиду высокой чувствительности. Возможно даже получение трехмерных изображений [11].

Для неинвазивного имиджинга опухолей используют, как правило, люциферазы Photinus pyralis, Pyrophorus plagiophtalamus (совместно с D-люциферином) и люциферазы Renilla reniformis и Gaussia princeps (совместно с целентеразином). В последнее время становится популярным применение небольшой люциферазы NanoLuc, которая работает с синтетическим люциферином фуримазином [12]. Помимо люцифераз также часто используют конъюгаты люцифераз с флуоресцентными белками и квантовыми точками с целью смещения сигнала в более красную область спектра по BRET-механизму, что актуально для получения изображений в глубоких тканях [13, 14].

Еще одним направлением применения биолюминесценции в исследованиях рака является фотодинамическая терапия опухолей с помощью квантовых точек. Фотосенсибилизатор, обладающий значительным цитотоксическим эффектом на опухолевые клетки, находящиеся в глубоких тканях, может быть эффективно активирован светом от люциферазы по BRET-механизму [15, 16].

Люминесцентная система высших грибов — новая альтернатива

Существенным недостатком люминесцентных систем, применяемых для биоимиджинга в опухолевых исследованиях, является необходимость добавления люциферина извне перед каждым экспериментом. Единственная доступная на данный момент автономная люминесцентная система бактерий, состоящая из оперона luxCDABE, не может широко применяться из-за высокой токсичности. Изначально достаточно долго не удавалось провести экспрессию бактериальной системы в клетках эукариот, однако после полномасштабной перестройки бактериального оперона биолюминесценция в клетках дрожжей и человека стала возможной, но только при условии добавления люциферина извне [17]. И лишь в 2010 г. после дополнительной реорганизации генов в опероне впервые были получены автономно люминесцентные клетки человека [18].

На данный момент бактериальная люминесцентная система все еще непопулярна для применения в эукариотических клетках. Тем более, что, скорее всего, для ее переноса в другой организм потребуются такие же обширные манипуляции с опероном, которые были проделаны в случае первичной оптимизации luxCDABE, а именно: изменение регуляторных последовательностей, последовательности генов в опероне и создание дополнительных линкерных участков. Поэтому задача по разработке автономно люминесцентной системы по-прежнему актуальна.

Для применяемых на данный момент люциферинов (D-люциферин, целентеразин) задача пока выглядит нерешаемой, поскольку нет четкого представления о путях биосинтеза этих молекул в живом организме. В то же время относительно недавно стала известная структура люциферина высших грибов — 3-гидроксигиспидина [19], и был подробно изучен механизм его билюминесценции [20]. Биосинтетическим прекурсом люциферина в грибах является кофейная кислота. Из нее люциферин получается в две стадии: сначала из производных кофейной кислоты каффеоила-СoA и малонила-СoA под действием поликетидсинтазы образуется гиспидин [21], который затем в светящихся грибах под действием гидроксилазы превращается в люциферин (рисунок).

Кофейная кислота — это широко распространенный вторичный метаболит растений. Перенос генов белков, ответственных за синтез и свечение люциферина, из грибов в другой эукариотический организм (в частности, в клетки растений) представляется гораздо более реалистичной задачей, чем работа с прокариотическими генами бактерий. Однако, на наш взгляд, существует также и принципиальная возможность получения на основе генов из люминесцентной системы грибов автономно светящихся клеток не только растений, но и других организмов, например дрожжей и млекопитающих. Ферменты, отвечающие за биосинтез кофейной кислоты из L-тирозина в две стадии, известны (PAL фенилаланинаммиаклиаза и С4H циннамат-4-монооксигеназа), как и кодирующие их гены (sam8 и sam5 соответственно) [22]. Присоединение их к кластеру генов люминесцентной системы грибов позволит создать первую полноценную автономную биолюминесцентную систему, подходящую для биомиджинга в эукариотических организмах.

ВЫВОДЫ

Широко применяемые сегодня для изучения механизмов распространения и путей лечения различных заболеваний методы биолюминесцентного имиджинга обладают рядом неоспоримых достоинств по сравнению с остальными, главным из которых является сверхвысокая чувствительность. Однако недостатком всех используемых люминесцентных систем является необходимость добавления субстрата (люциферина) извне для проведения анализа. Разработка автономной люминесцентной системы эукариот на основе кассеты генов биолюминесцентной системы высших грибов является перспективным возможным решением этой проблемы.