Статья размещена в открытом доступе и распространяется на условиях лицензии Creative Commons Attribution (CC BY).
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Cas13a: получение и использование для определения вирусной РНК
1 Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи, Москва
2 Лаборатория трансляционной биомедицины,
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи, Москва
3 Кафедра вирусологии, биологический факультет,Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва
Для корреспонденции: Владимир Алексеевич Гущин
ул. Гамалеи, д. 18, г. Москва, 123098; 89037515786; moc.liamg@adainawow; gro.ayelamag@nihchsug.a.rimidalv
Использование CRISPR-Cas систем для редактирования геномов организмов в последнее время стало одним из магистральных научных направлений. Между тем белки системы CAS можно применять для разработки методов молекулярной диагностики. Традиционные подходы к идентификации микроорганизмов имеют ряд недостатков: они времязатратны (культуральные методы диагностики), недостаточно чувствительны (иммунологические методы), имеют высокую себестоимость и методически сложны (ПЦР, секвенирование). Целью работы было получение функционально активного препарата белка Cas13а и изучение его поведения в различных условиях, в том числе при изменении концентрации мишени, для дальнейшего использования в диагностических целях. Была создана генетическая экспрессионная конструкция, имеющая на 5'-конце T7-промотер и ген сas13a бактерии Leptotrichia wadei. Получены препараты функционально активной программируемой РНКазы белка Cas13a, направляющей РНК, а также РНК вируса гриппа Б (РНК-мишень). Функциональную активность РНКазы белка Cas13a определяли по появлению флуоресцентного сигнала в реакционной смеси, содержащей направляющую РНК, РНК-мишень, молекулярный РНК-маячок. Показано, что полученный препарат белка Cas13a способен специфически выявлять мишень на примере фрагментов РНК вируса гриппа Б и не обладает неспецифическими видами РНКазной активности. Данное исследование может стать основой для создания нового быстрого специфичного и чувствительного метода идентификации микроорганизмов.
Ключевые слова: диагностика, ПЦР, системы CRISPR-Cas, инфекционные заболевания, Cas13a