На протяжении многих лет человечество борется с инфекционными заболеваниями. Особо опасны инфекции, вызывающие вспышки и эпидемии [1]. Непрерывно ведется разработка новых методов диагностики, так как именно от точности диагностики зависит эффективность последующей терапии. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в отличие от классических микробиологических методов идентификации микроорганизмов, основанных на культивировании с использованием дифференциально- диагностических сред, позволяет определять микроорганизмы быстро и независимо от особенностей их жизненного цикла. Активному внедрению ПЦР способствует развитие методов секвенирования и легкий доступ к последовательностям геномов в открытых базах данных [2].

Тем не менее потребность в разработке новых методов молекулярной диагностики по-прежнему остается. Расширение спектра использования ПЦР ограничивают высокая стоимость оборудования, необходимость создания специализированных лабораторных помещений и отсутствие персонала, имеющего высокую квалификацию. В качестве альтернативы ПЦР предлагаются различные варианты мобильных биосенсоров, использующих комбинацию физических и биохимических подходов [3–5], а также подходы, совсем не требующие сложных приборов [6, 7]. Наиболее перспективной, по нашему мнению, разработкой, сочетающей высокую специфичность и чувствительность на уровне единичных молекул, является SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) [8, 9].

SHERLOCK основан на комбинировании изотермической амплификации нуклеиновых кислот исследуемого образца с работой Cas13a и позволяет детектировать как молекулы ДНК, так и РНК. Изотермическая амплификация используется для накопления мишени, а Cas13a выполняет функцию специфического сенсора, позволяющего точно распознавать заданные мишени и различать даже единичные нуклеотидные замены [9].

Активация нуклеазной активности Cas13a начинается со связывания направляющей РНК (crРНК) с Cas13a, после чего в структуре белка происходят значительные конформационные изменения, цель которых — формирование канала для дальнейшего связывания РНК-мишени [10]. Когда Cas13a встречается с РНК- мишенью, происходит образование дуплекса crРНК:РНК- мишень в положительно заряженном канале «NUC lobe». РНК-мишень служит своеобразным активатором, так как образование дуплекса катализирует сближение каталитических доменов с последующим формированием сайта расщепления РНК. Использование зонда РНК позволяет визуализировать процесс работы Cas13 по накоплению флуоресцентного сигнала.

Целью публикуемой работы было получение функционально активного препарата Cas13a, а также изучение его активности в различных условиях, в том числе при изменении концентраций мишени. В качестве мишени был использован фрагмент РНК вируса гриппа Б.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение рекомбинантного белка LwCas13a

Для получения препарата рекомбинантного белка Cas13a Leptotrichia wadei (LwCas13a) ген с оптимизированным кодоновым составом, синтезированный de novo (Евроген, Россия), был встроен в генетический экспрессионный вектор pET42b(+) под контролем lacТ7 промотора. Экспрессию гена проводили в штамме Escherichia coli BL21(DE3)pLysS, со стороны C-конца Cas13a имел октогистидиновую метку. Индукцию осуществляли с использованием изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Замороженную биомассу ресуспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Трис-HCl pH 8,8; 500 мМ NaCl; 5 мМ β-меркаптоэтанола) и разрушали под воздействием циклических ультразвуковых импульсов. Лизат осветляли центрифугированием при 15 000 g в течение 20 мин, супернатант использовали для проведения аффинной хроматографии на автоматизированной системе среднего давления NGC Discover^TM 10 (Bio- Rad, США), использовали колонку HisPrep FF 16/10 (GE, Германия) объёмом 20 мл, заряженную ионами Ni²⁺. Для освобождения от неспецифически связавшихся примесей в буферные растворы для хроматографии добавляли Triton X-100 до конечной концентрации 0,1%. Элюцию белка осуществляли в линейном градиенте имидазола до конечной концентрации 0,5 М. После хроматографии, фракции, содержащие Cas13a, объединяли и диализировали против буфера хранения (20 мМ Трис-HCl pH 8,0; 200 мМ NaCl; 0,1 мМ ЭДТА). Концентрацию белка измеряли спектрофотометрически с помощью прибора Implen NanoPhotometer (IMPLEN, Германия) при длине волны 280 нм. Расчет концентрации проводили с учетом коэффициента экстинкции [11, 12].

Получение РНК-мишени и направляющей РНК

Для получения направляющей РНК и РНК-мишени использовали метод ПЦР с последующей транскрипцией ПЦР-продукта с помощью qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) по протоколам производителя. Для получения направляющей РНК использовали искусственно синтезированные олигонуклеотиды-праймеры, обладающие участком самокомплементарности. Для получения РНК- мишени амплифицировали фрагмент плазмиды, несущей последовательность генома вируса гриппа Б и фага MS2. Транскрипцию in vitro с полученных ПЦР-продуктов проводили с использованием MEGAscript® T7 Kit (Thermo Fisher Scientific, США).

Определение сторонних видов нуклеазных активностей LwCas13a

В качестве аналитического сигнала для проверки сторонних видов нуклеазных активностей LwCas13a использовали флуоресценцию, появляющуюся при расщеплении репортерной молекулы РНК RNAseAlert v2 Substrate (Thermo fisher scientific, США). Репортерная молекула РНК представляет собой олигонуклеотид- маячок c флуоресцентным красителем на 5′-конце и его гасителем на 3′-конце. При расщеплении молекулы краситель отделяется от гасителя и испускает квант света в зеленом спектре (длина волны 520 нм). Препарат LwCas13a в конечной концентрации 450 нМ инкубировали в реакционной смеси, состоящей из нуклеазного буфера и репортерной РНК (40 мМ Трис-HCl pH 7,3; 60 мМ NaCl; 6 мМ MgCl₂; 125 нМ RNAseAlert v2 Substrate) в течение 2 ч, при 37 °С, изменение флюоресценции регистрировали в реальном времени с использованием амплификатора QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США). В качестве положительного контроля использовали РНКазу А (Thermo fisher scientific, США), в качестве отрицательного — чистую репортерную РНК.

Проверка эндонуклеазной активности белка LwCas13a

Реакционная смесь для определения эндонуклеазной активности LwCas13a состояла из нуклеазного буфера (40 мМ Трис-HCl pH 7,3; 60 мМ NaCl; 6 мМ MgCl₂), 450 мМ LwCas13a, 22,5 нМ crРНК, 125 мМ RNAseAlert v2 Substrate, 2 мкл RiboLock RNase Inhibitor, 100 нг РНК вируса табачной мозаики (в качестве фона) и различных концентраций РНК-мишени. Детекцию флуоресцентного сигнала осуществляли в реальном времени в течение 2 ч при 37 °С с использованием амплификатора QuantStudio 5 Real- Time PCR System (Applied Biosystems, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение препарата рекомбинантного LwCas13a

Препарат рекомбинантного белка LwCas13a получали с применением аффинной хроматографии. Анализ фракций в системе денатурирующего электрофореза белков показал, что во время индукции клетки E. coli продуцируют растворимый белок с молекулярной массой, сопоставимой с расчетной для LwCas13a (139,8 кДа) (рис. 1).

Оптимизация концентрации репортерной РНК (RNAseAlert) в реакционной смеси

Для получения оптимальных значений флуоресценции провели серию модельных экспериментов с использованием РНКазы А (рис. 2). Для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация субстрата 125 нМ, так как именно при этом значении обеспечивался максимальный динамический диапазон в 100 000 условных единиц флуоресценции.

Проверка сторонних видов РНКазной активности препарата LwCas13a

Проверку препарата белка LwCas13a на наличие неспецифических видов РНКазной активности проводили с помощью инкубации белка LwCas13a с флуоресцентным субстратом RNAseAlert v2 Substrate в отсутствии crРНК и РНК-мишени в течение 2 ч, изменения флуоресцентного сигнала при этом не наблюдалось. В качестве положительного контроля инкубировали флуоресцентный субстрат с РНКазой А, в качестве отрицательного контроля — с препаратом репортерной РНК (рис. 3). Можно заключить, что по разработанной методике был получен препарат белка LwCas13a, не проявляющий неспецифических видов РНКазной активности, что позволило перейти к изучению свойств программируемой РНКазы.

Определение чувствительности метода детекции на основе препарата белка LwCas13a на примере вируса гриппа Б

Определение чувствительности системы детекции с использованием белка LwCas13a проводили в модельных экспериментах с вирусной РНК-мишенью фрагмента генома вируса гриппа Б. В ходе экспериментов с препаратами LwCas13a нижним детектируемым порогом чувствительности оказалось множество 107 молекул вирусных РНК-мишеней (рис. 4 и рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Использование LwCas13a для детекции патогенных микроорганизмов открывает большие перспективы. Методика, адаптированная в 2017 г. [7, 9] и названная SHERLOCK, основана на сочетании распознавания белком Cas13a молекул РНК, полученных в результате предварительной амплификации с использованием рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA) и Т7-транскрипции. Все реакции проходят в одной смеси. Используя такой подход, исследователи создали платформу для диагностики вируса Зика, обладающую аттомолярной чувствительностью и специфичностью, не уступающую количественной ПЦР (рвПЦР) и цифровой капельной ПЦР. В первую очередь ученые исследовали ортологи белка Cas13a, для получения надежного флуоресцентного сигнала при активации РНКазной активности белка Cas13a. Cas13a Leptotrichia wadei, способен детектировать до 50 пМ РНК-мишени [7]. Именно этот фермент был взят за основу при разработке платформы SHERLOCK. Несмотря на высокую чувствительность, авторы исследовали возможность совмещения Cas13a-детектирования с различными вариантами изотермической амплификации, и пришли к выводу, что RPA в сочетании с транскрипцией и РНКазной активностью белка Cas13a способна увеличить чувствительность метода. Было показано, что созданная платформа SHERLOCK способна различать РНК-мишени, отличающиеся друг от друга на один нуклеотид, при очень маленьких их концентрациях в растворе, а также может быть применима для портативного использования [7, 9].

В данной работе мы синтезировали вариант белка LwCas13a с оптимизированным кодоновым составом. В отличие от ранее описанного [7, 9], последовательность данного белка была изменена для его высокоэффективной продукции в клетках E. coli. Полученные штаммы- продуценты позволяют получать до 10 мг с 1 л культуры (рис. 1). Нами была разработана методика очистки Cas13a и проведены тесты, показывающие, что программируемая РНКаза не проявляет неспецифической РНКазной активности. Отсутствие последней свидетельствует о высокой чистоте полученного препарата. Далее мы отработали тесты по специфической in vitro детекции РНКазной активности белка Cas13a на основе фрагментов РНК вируса гриппа Б. Было показано, что без предварительной наработки мишени с использованием ранее описанных методик RPA и транскрипции с Т7-полимеразой [7, 9] чувствительность детекции составляет 107 молекул.

ВЫВОДЫ

В рамках данной работы был синтезирован вариант белка Cas13a Leptotrichia wadei с оптимизированным кодоновым составом, позволяющий получать функционально активный препарат программируемой РНКазы в клетках E. coli. Показано, что полученный препарат белка обладает специфической РНКазной активностью, не проявляет сторонних видов нуклеазной активности и способен специфически определять мишень на примере фрагментов РНК вируса гриппа Б. Дальнейшие исследования будут направлены на совершенствование метода: повышение его чувствительности, изучение специфичности программируемой РНКазы и повышение мультиплексности. Кроме того, будет предпринята попытка по созданию на основе Cas13a полевых диагностикумов. Применение полевых методов диагностики может существенно упростить контроль инфекционных агентов в переносчиках и окружающей среде, позволяя предотвратить попадание возбудителей инфекций в человеческую популяцию [13–15].