Терапия опухолей головного мозга, особенно мультиформной глиобластомы, по-прежнему остается нерешенной проблемой [1, 2]. Особое значение приобретают поиски новых альтернативных подходов к лечению. Основная их проблема связана с устойчивостью стволовых клеток опухоли к существующим терапевтическим воздействиям, приводящей к неизбежным рецидивам заболевания. Многие онколитические вирусы способны эффективно уничтожать стволовые клетки глиобластом и предотвращать рецидивирование [3–8]. В ходе развития опухоли ее клетки приобретают ряд характерных свойств, которые могут быть использованы в качестве специфических мишеней для терапии [9]. Кроме того, они утрачивают многие функции, необходимые им для существования в многоклеточном организме [10–12]. В числе этих функций — защита клеток от вирусов [13–15]. Опухолевые клетки при заражении их вирусами, как правило, не способны индуцировать интерфероны 1 типа, но приобретают невосприимчивость к реинфекции вирусами после обработки интерферонами [16–20]. Этим обусловлена повышенная чувствительность опухолевых клеток к заражению представителями многих семейств вирусов, что лежит в основе разработки терапевтических штаммов онколитических вирусов [21–24]. Механизм действия онколитических вирусов связан не только с избирательным заражением и уничтожением раковых клеток, но и со значительной активацией противоопухолевого иммунитета и модификацией опухолевого микроокружения. Под действием онколитических вирусов происходит стимулирование врожденного и адаптивного видов иммунитета, что сопровождается стойким противоопухолевым действием даже после окончания репликации вирусов в клетках опухоли [25–28]. Представители онколитических вирусов разных семейств используют каждый из перечисленных механизмов в различной степени. Вклад прямого вирусного онколиза, вызванного непосредственным размножением вирусов в опухолевых клетках, удобно изучать на модели опухолевых ксенотрансплантатов у иммунодефицитных бестимусных мышей, у которых многие компоненты противоопухолевого иммунитета нарушены [29], или у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) [30]. Эти модели также удобны для отработки способов доставки вирусов в опухоль. Введение вируса должно приводить к эффективному заражению части опухолевых клеток, которое инициирует последующие циклы репликации вируса с выходом из зараженной клетки и перезаражением новых опухолевых клеток, находящихся в данном или отдаленном опухолевом узле. Если введение вируса непосредственно в чувствительную к вирусу опухоль возможно прямой инъекцией, то этот процесс запускается без особых затруднений. Однако в большинстве случаев метастатических форм рака, а также опухолей с затрудненным доступом, такой подход неприменим. Системное введение вируса путем внутривенных или внутримышечных инъекций зачастую тоже малоэффективно, поскольку вирус очень быстро выходит из циркуляции в результате поглощения клетками эндотелия и действия неспецифических защитных факторов крови. Перспективной альтернативой системной доставке является использование клеток-носителей — зараженных in vitro чувствительных к вирусу клеток, вводимых в кровоток [31–33]. Репликация вируса в таких клетках происходит в процессе их системной циркуляции с последующим выходом инфекционных частиц в отдаленных участках организма, в том числе в опухоли. В данном исследовании мы использовали модель подкожных опухолевых ксенотрансплантатов глиобластом человека: иммунодефицитным мышам вводили клетки из нейросферных культур, полученных из опухолевого материала двух больных с глиобластомами. Нейросферы — плотные скопления клеток, образующихся при культивировании опухолевых эксплантатов в условиях, препятствующих прикреплению к поверхности чашки, и специальной среде, в составе которой имеются эпидерамальный фактор роста и фактор рост фибробластов (EGF, bFGF соответственно) [34, 35]. Как и другие сфероиды, полученные из опухолей человека, нейросферы обогащены опухолевыми стволовыми клетками [36], поэтому обладают повышенной туморогенностью [37, 38]. Целью работы было отработать процедуру доставки онколитических энтеровирусов с помощью лейкоцитов периферической крови, используя модель подкожных опухолевых ксенотрансплантатов у мышей, и установить продолжительность присутствия (персистирования) вируса в организме экспериментальных животных в процессе вирусной терапии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток для титрования вирусов

Культуру клеток Vero (иммортализованные клетки почки африканской зеленой обезьяны) выращивали в среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (FBS), 100 мг/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина. Клетки наращивали в 10-см пластиковых культуральных чашках во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂, при температуре 37 °С, затем рассевали каждые 3 суток в соотношении 1:4–1:6. 

Нейросферные опухолеобразующие культуры клеток глиобластомы

Происхождение и получение культур клеток из материала пациентов с глиобластомой (GM-3564 и GM-3876) описаны ранее [39]. Для повышения опухолеобразования подкожное введение нейросфер производили иммунодефицитным мышам линии SCID/Beige, используя их в качестве экспериментальных животных (штамм мышей был получен из Новосибирского SPF вивария и поддержавается в лаборатории). Нейросферы глиобластом, прошедшие не более двух пассирований в культуре, хранили при температуре жидкого азота и размораживали непосредственно перед началом экспериментов. Их высевали на среду DMEM+F12 (ПанЭко, Россия), содержащую 20 нг/мл EGF и 10 нг/мл bFGF, и помещали в инкубатор с 5% СО₂ при 37 °С. После формирования нейросфер (через 7–10 суток) их дважды отмывали физиологическим солевым раствором (PBS), подсчитывали, аккуратно пипетировали до исчезновения крупных агрегатов клеток и вводили подкожно мышам линии SCID/Beige из расчета 500 сфероидов на точку введения. Опухоли появились через 3 недели. Новообразования размером около 10 мм в диаметре иссекали, диспергировали продавливанием через стерильную нейлоновую сетку с диаметром пор 50 мкм, обрабатывали коллагеназой (ПанЭко, Москва) для получения суспензии клеток, отмывали дважды физиологическим раствором и полученную суспензию использовали для подкожного введения мышам SCID/Beige в количестве 2 × 10⁵ клеток на точку введения с целью получения опухолей непосредственно для испытания онколитической активности вируса. Предварительная адаптация нейросфер к росту в виде опухолей на мышах приводила к увеличению туморогенности и повышению числа образовавшихся опухолей при повторном введении животным.

Штамм онколитического вируса

В исследовании использовали штамм ЖЭВ8 энтеровируса Коксаки А7 [40, 41], который обладает способностью эффективно реплицироваться в клетках GM-3564 и GM- 3876 [39]. Титрование инфекционной активности вирусных препаратов проводили методом конечных разведений на культуре клеток Vero с использованием 96-луночных планшетов.

Доставка вируса с помощью лейкоцитов перефирической крови человека

Фракцию лейкоцитов периферической крови получали из свежезабранной гепаринизированной крови человека с помощью центрифугирования в растворе Ficoll-Paque (ПанЭко, Россия) согласно стандартному протоколу [42]. Отмытые дважды средой DMEM лейкоциты подсчитывали и готовили суспензию с плотностью 10⁶ кл./мл. Суспензию инкубировали с вирусом Коксаки А7 (10 инфекционных единиц на клетку) при температуре 37 °С в течение 1 ч.  Затем лейкоциты отмывали 3 раза по 10 мл физиологическим солевым раствором (0,14 М NaCl), центрифугировали при 800 g 5 мин. Инфицированные лейкоциты в количестве 2 × 10⁴ клеток вводили в объеме 0,1 мл в хвостовую вену мышам SCID/Beige, несущим опухоли объемом около 400–600 мкл. Наблюдение за размером опухолей проводили каждые трое суток. Для определения вируса в крови мышей каплю крови забирали из хвостовой вены и титровали на клетках Vero методом конечных серийных разведений в 96-луночных планшетах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ранее нами было установлено, что культуры клеток GM-3564 и GM-3876, полученные из опухолевого материала двух пациентов с глиобластомой, обладают высокой чувствительностью к вирусу Коксаки А7 [39]. В настоящем исследовании этот штамм вируса использовали для определения возможности его доставки в опухоль посредством клеточного носителя, а также для изучения его способности к длительному персистированию в опухоли, приводящему к стойкому онколитическому эффекту.  Для этого была использована модель подкожных ксенотрансплантатов нейросферных культур клеток GM-3564 и GM-3876 на мышах линии SCID/Beige, имеющих комбинированную иммунную недостаточность. После подкожного введения нейросфер опухоли достигали объема 400–600 мкл за 10 суток. В эксперименте использовали две группы по 10 мышей для каждого типа опухолевых клеток (всего 4 группы): одной группе вводили в хвостовую вену инфицированные вирусом лейкоциты, другой — контрольные незараженные лейкоциты.  На рисунок представлена динамика изменения размеров опухоли (в мм³) при измерении каждые трое суток на протяжении 27 суток. В контрольной группе мышей при введении в хвостовую вену неинфицированных вирусом лейкоцитов рост опухолей продолжался и мышей, у которых он достигал размеров, приблизительно равных 1500 мм³, подвергали эвтаназии. Это происходило в интервале между 9 и 15 сутками после введения лейкоцитов.  При введении в хвостовую вену инфицированных вирусами Коксаки А7 лейкоцитов увеличение объемов новообразований продолжалось еще в течение трех суток, после чего размер опухолей стремительно сокращался у мышей обеих групп, несущих клетки GM-3564 и GM-3876. Через 18–21 день после инъекций размеры опухолей уже невозможно было установить и на их месте подкожно выявлялась лишь малозаметная рубцовая ткань. Одновременно в крови мышей каждые трое суток определяли титр вируса (таблица).

Вирус впервые обнаруживали в крови мышей через 3 суток после введения и его количество достигало пиковых значений на 6 сутки, после чего снижалось вместе с уменьшением размеров опухолей. Вирус переставал определяться через 18–21 день после введения инфицированных лейкоцитов, когда мыши уже были практически свободны от опухолей.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На модели ксенотрансплантатов глиобластомы человека, растущих на мышах с комбинированным иммунным дефицитом линии SCID/Beige нами была установлена возможность доставки онколитического вируса Коксаки А7 в опухоль с помощью лейкоцитов периферической крови человека, инфицированных вирусом in vitro и введенных в хвостовую вену. Такой способ введения обеспечивал появление вируса в крови в среднем через трое суток и его присутствие там вплоть до исчезновения опухолей. Таким образом, персистенция вируса в организмах мышей была обусловлена присутствием в них чувствительных к вирусу опухолевых клеток, полное уничтожение которых приводило и к исчезновению вируса. Ранее мы уже наблюдали длительную персистенцию полиовируса 1 типа у мышей с ксенотрансплантатами глиобластомы линии А172, приводящую к одновременному исчезновению опухолей и вируса в крови мышей [43]. Однако в отличии от настоящего исследования в той работе мышам внутривенно вводили высокие дозы свободного вируса. Вирус Коксаки А7 проникает в клетки с помощью белка LIMP-II, кодируемого геном SCARB2 [44].  LIMP-II экспрессируется на поверхности многих типов клеток человека, в том числе лейкоцитов, и по-видимому, участвует в распространении вируса в организме и при энтеровирусных инфекциях, вызываемых некоторыми патогенными штаммами вирусов Коксаки А. Использованный нами способ доставки вируса в опухоль имеет ряд преимуществ перед системным введением свободных вирионов, поскольку, находясь внутри клетки вирус защищен от действия антител и других факторов, ведущих к его инактивации. Мы допускаем, что внутри лейкоцитов крови вирус способен к ограниченной репликации, что обусловливает его появление в отдаленных участках организма, в том числе опухоли. Доставка с помощью лейкоцитов позволяет к тому же существенно снизить исходное количество вируса, необходимого для терапии. Дальнейшие испытания должны быть направлены на выяснение того, насколько этот способ введения пригоден для терапии онкологических больных.

ВЫВОДЫ

Установлено, что внутривенное введение онколитического штамма вируса Коксаки А7 иммунодефицитным мышам линии SCID/Beige с помощью инфицированных лейкоцитов приводит к быстрому уменьшению размеров и исчезновению подкожных ксенотрансплантатов опухолей, полученных их клеток глиобластом двух больных. При этом вирус активно размножался в организмах мышей в течение всего периода присутствия у них чувствительных опухолевых клеток. Результаты показывают, что даже в отсутствие Т-клеточного иммунитета у бестимусных мышей возможна полная деструкция глиобластомных опухолей благодаря прямому цитолитическому действию онколитического энтеровируса, а также указывает на эффективность введения вируса с помощью лейкоцитов в качестве клеточных векторов доставки.