Быстрое развитие CRISPR-технологий в последние годы значительно расширило сферу их применения и способствовало продвижению в клиническую практику. Редактирование генома CD4⁺-Т-клеток путем нокаута или модификации гена хемокинового рецептора 5 (CCR5) дало обнадеживающие результаты в лечении ВИЧ-1-инфекции [1–5].
Однако кроме изменения гена CCR5 в Т-клетках (с целью блокирования развития СПИДа у ВИЧ-инфицированных пациентов), создание CCR5delta32-аллеля может быть использовано как элемент технологии оплодотворения in vitro (IVF) для защиты плода ВИЧ-инфицированных женщин со слабым ответом на антиретровирусную терапию [6, 7].
Введение системы CRISPR-Cas9 на стадии зиготы позволяет модифицировать геном практически во всех клетках организма и это уже продемонстрировано для нескольких наследственных заболеваний [8–12]. Важно отметить, что измененный геном будет передаваться и последующим поколениям.
Модификация, идентичная природному аллелю CCR5delta32, потенциально защитит плод от ВИЧ-инфекции во время внутриутробного развития, а также во время родов. Дополнительным положительным эффектом может стать пожизненная устойчивость человека к ВИЧ-инфекции.
В этом исследовании мы оптимизировали систему CRISPR-Cas9 с целью создания гомозиготной 32-нуклеотидной делеции (аналогичной природному аллелю CCR5delta32) в S-фазе зиготы человека. Для редактирования генома были использованы зиготы с аномальным числом пронуклеусов, непригодные для программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Одобрение этическим комитетом и согласие пациентов

Проведение исследования было одобрено этическим комитетом НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова (Москва) (протокол №2017/45). Все этапы исследования (методы) проводились в полном соответствии с существующими международными принципами и правилами работы с эмбрионами. Письменное информированное согласие было получено от каждой семейной пары до момента передачи аномальных зигот для исследования. В исследование были включены семейные пары, в которых для обоих партнёров было показано отсутствие варианта CCR5delta32.

Сбор зигот

Зиготы с аномальным числом пронуклеусов были получены от пациентов, проходящих процедуру ЭКО с сентября 2017 по апрель 2018 годов в НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова. От 11 пар была получена 21 аномальная зигота (16 были инъецированы CRISPR-Cas9 и 5 послужили контролем).

Дизайн, синтез и проверка активности гидовых РНК in vitro

Для дизайна гидовых РНК (гРНК) использовали последовательности гена CCR5 дикого типа (WT) и CCR5delta32 из базы данных Национального центра биотехнологической информации (США). Для последующего целевого редактирования и введения желаемой делеции брали участок размером 200 пн, на котором выбирали сайты отжига гРНК с PAM-сайтом (рис. 1). Было подобрано девять гРНК с посадкой в местах, удобных для последующего гомологичного восстановления двухцепочечных разрывов (табл. 1).
Матрицу для транскрипционного синтеза гРНК создавали путем попарного отжига праймеров (Евроген; Россия) с последующей достройкой Taq-полимеразой (Евроген; Россия) в ходе ПЦР. Затем проводили синтез гРНК с использованием Т7 РНК-полимеразы (Сибэнзим; Россия).
Активность полученных гРНК проверяли с помощью тестовой плазмиды, кодирующей последовательность CCR5 дикого типа. Расщепление ДНК in vitro комплексом гРНК и EnGen® Cas9 NLS (New England Biolabs; США) проводили в соответствии со стандартной процедурой, рекомендованной производителем фермента. В качестве наиболее эффективных были выбраны гРНК №1 и №5. Для последующих экспериментов in vivo смесь этих гРНК использовали в соотношении 1:1.

Наработка ДНК-заплатки

Для производства ДНК-заплатки использовали метод стандартной ПЦР с перекрыванием. После сборки конструкции одноцепочечный фрагмент ДНК (хорошо промотирующий переход от негомологичного соединения концов двухцепочечного разрыва (NHEJ) к рекомбинационной репарации) был получен с помощью асимметричной ПЦР с избытком одного из праймеров (с индексом F). Фрагмент имел последовательность: GTGATCACTTGGGTGGTGGCT GTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCA AAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCAT ACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGC TTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAA

Формирование РНП-комплекса

Для получения готовых РНП-комплексов и инъекции их в зиготу использовали следующие исходные компоненты: Cas9 (20 мкМ), 1:1 гРНК №1 и №5 (30 нг/мкл), одноцепочечную ДНК (оцДНК) (100 нг/мкл), буфер для разведения (0,25 мМ ЭДТА /10 мМ TrisHCl; pH 7,4).
Для приготовления инъекционного раствора 0,5 мкл Cas9 (20 мкМ) смешивали с 4,5 мкл буфера для разведения. Затем к 5,34 мкл буфера для разведения добавляли 1,56 мкл полученного раствора Cas9 (2 мкМ), 0,6 мкл смеси гРНК (30 нг/мкл) и 2,5 мкл оцДНК (100 нг/ мкл). Смесь инкубировали при 37 °С в течение 10 мин, затем сразу использовали для инъекций.

Инъекция комплекса CRISPR-Cas9 в зиготу

Инъекцию CRISPR-Cas9 в аномальные зиготы проводили в S-фазе клеточного цикла в соответствии со стандартным протоколом Intra Cytoplasmic Sperm Injection (ICSI) [13]. Объем инъекции составлял 1 нл. После инъекции CRISPR-Cas9 зиготы дважды промывали средой Sydney IVF Cleavage Medium (COOK Medical LLC; США), затем перемещали в среду Sydney IVF Blastocyst Medium (COOK Medical LLC; США) и инкубировали в CO2-инкубаторе Эмбриоплан (Вэсттрейд; Россия) со стандартными параметрами в течение 5 дней до образования бластоцисты (около 250 клеток). После инкубации каждую бластоцисту перемещали в 12 мкл буфера для разведения и сразу анализировали с помощью ПЦР.

ПЦР-генотипирование и анализ данных

ПЦР-генотипирование проводили так же, как описано в [14], на приборе DTprime Real-Time (ДНК-Teхнология; Россия), однако для выхода из зоны взаимодействия гРНК использовали другой универсальный праймер CCR5_check2_R: TCATTTCGACACCGAAGCAGA. Результаты ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения DTprime v.7.7 (ДНК-Teхнология; Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из 16 зигот, инъецированных системой CRISPR-Cas9, лишь 8 достигли стадии бластоцисты. Из 5 контрольных зигот (инъецированных буфером для разбавления) 3 достигли бластоцисты. Это стандартная эффективность выхода бластоцист для аномальных зигот, и можно сделать вывод, что процедура инъекции не повысила вероятность остановки развития. ПЦР-генотипирование показало отсутствие исходного варианта WT CCR5 в 5 из 8 бластоцист (с образованием эмбрионов, полностью гомозиготных по CCR5delta32). Два эмбриона продемонстрировали около 3% и один – около 20% остаточного мозаицизма по исходному варианту WT CCR5 (рис. 2). Значения пороговых циклов Cp для каждого эмбриона указаны в табл. 2. Каждый ПЦР-протокол включал в себя отрицательный контрольный образец (буфер для разбавления) в двух повторностях. Все отрицательные контрольные образцы дали отрицательный результат.

ОБСУЖДЕНИЕ

CRISPR-Cas9-опосредованное редактирование генома зигот человека представляет собой эффективный метод модификации внутриклеточной ДНК, достигающий почти 100%-й элиминации исходной последовательности более чем у половины взятых в исследование эмбрионов [9, 10, 12, 15]. Наши результаты хорошо коррелируют с другими случаями применения систем редактирования генома демонстрируя сопоставимо высокую эффективность.
В течение последних двух лет мы видим чрезвычайно быстрое развитие и обновление GE-систем. Однако главным вопросом на сегодняшний день является степень нецелевой активности систем редактирования генома. Только после однозначного подтверждения безопасности такие методы могут быть применены в реальной клинической практике.

ВЫВОДЫ

В работе продемонстрирована эффективность CRISPR-Cas9-опосредованного создания делеции CCR5delta32 в эмбрионах человека. Разработанная система позволила получить более половины полностью модифицированных эмбрионов.