Обнаружение в воздухе патогенных, аллергенных, и иммуногенных микроорганизмов имеет решающее значение при разработке программ, обеспечивающих безопасное существование человека в окружающей среде. С развитием биотехнологий в настоящее время к ранее существующим добавились новые источники биоаэрозольного загрязнения, возникшие в результате применения генной инженерии штаммов микроорганизмов в производстве фармацевтических препаратов, ферментов и пищевых заменителей [1]. Загрязненный воздух может характеризоваться высокими концентрациями микроорганизмов (до 10⁶ КОЕ/м³), являющихся возбудителями инфекционных и аллергических респираторных заболеваний человека [2]. Особое внимание требуется уделять целенаправленному загрязнениею воздуха патогенами в результате актов биотерроризма.
Традиционно для обнаружения и количественной оценки биоаэрозолей часто используют методы отбора проб с помощью фильтров, импинжеров или импакторов, в которых микроорганизмы не могут выжить от стресса, вызванного процессом пробоотбора [3]. Между тем, жизнеспособность пробы чрезвычайно важна, например в случае для отбора проб микрофлоры, позволяющих избегать чрезмерного физического воздействия на микроорганизмы, и поддерживающих их физиологические свойства. Наиболее перспективны в этом отношении пробоотборники с жидкой фазой поглощения [4], которые отделяют микроорганизмы от аэрозольных носителей и обеспечивают их точное определение в виде одиночных клеток. Сформулированы основные требования к устройству пробоотборника для обнаружения биопатогенов в воздушной среде [5–8]. Во-первых, это большая объемная скорость прокачки воздуха, необходимая для обнаружения патогенов низкой концентрации при отборе пробы в разумном временном интервале. Во-вторых, высокая эффективность улавливания аэрозольных частиц и их концентрирование в малом объеме жидкости для дальнейшего анализа. В-третьих, использование мягких, щадящих для микроорганизмов условий осаждения и защитных компонент в составе абсорбционной жидкости. Наконец, необходимыми требованиями являются наличие низкого аэродинамического сопротивления у пробоотборника, а также низкий уровень шума и энергопотребление.
Устройства для отбора биогенных аэрозолей из воздушной среды, функционирующие на основе различных физических принципов, разрабатываются и выпускаются на протяжении длительного периода времени. Определенные недостатки присущи каждому типу этих устройств. Создание пробоотборника с высокой эффективностью улавливания патогенов, скоростью отбора пробы более 3000 л/мин, возможностью получения жизнеспособного концентрированного из воздушной пробы материала в малом объеме жидкости, с низким уровнем шума и низким энергопотреблением, до сих пор остается проблемой, требующей своего решения.
Целью работы было создание высокопроизводительного устройства для отбора и концентрирования биоаэрозолей из воздушной фазы для дальнейшего проведения анализа отобранных проб на наличие патогенных бактерий и вирусов.

I. Дизайн эксперимента

В основу устройства был заложен принцип двухступенчатого последовательного концентрирования, позволяющий работать с большими объемными скоростями прокачки. На первой ступени осуществляется концентрирование частиц за счет принудительного резкого изменения направления движения входного воздушного потока при прокачке через щелевой виртуальный импактор [9, 10]. Направление выходного воздушного потока, содержащего концентрированные частицы, совпадает с первоначальным направлением входного потока, а его величина в несколько раз меньше. Вторая ступень включает в себя осаждение концентрированных частиц в пленке жидкости, непрерывно циркулирующей в циклонном коллекторе с жидкой фазой [3, 11]. Увеличение времени циркуляции при продолжающемся поступлении частиц приводит к возрастанию их концентрации в жидкой фазе. Рассмотрим подробнее основные этапы разработки устройства.

1. Создание виртуального импактора

При создании виртуального импактора проводили предварительный расчет значений ширины и длины его
щелей: входных, куда поступает весь прокачиваемый воздушный поток, и выходных, в которые проходит
воздушный поток с уменьшенной объемной скоростью, содержащий концентрированные частицы. Величина входного потока варьировалась от 3000 до 5000 л/мин, размеры селектируемых аэрозольных частиц от 0,5 до 5 мкм. Согласно [12], число Рейнольдса и отношение длины промежутка между входной и выходной щелями к ширине входной щели определяют форму кривой зависимости эффективности селектирования частиц, измеряемой в процентах, от их аэродинамического диаметра. Диаметр, соответствующий 50%-й эффективности селектирования, определяется как

форм. 1

где ρ_p — плотность частицы; С_С — поправка Каннингема, учитывающая увеличение подвижности частиц, размер которых сравним со средней длиной пробега молекул газа; U — линейная скорость частицы; η — вязкость воздуха или газа; W — ширина щели; S_k50 — число Стокса, соответствующее диаметру d₅₀. Расчет состоял в выборе таких размеров щелей, которые при объемных скоростях до 5000 л/мин обеспечивали бы число Рейнольдса

форм. 2

в диапазоне 500–3000 [12]. После этого на основании зависимостей числа S_k50 от числа Re, полученных в [13], определяли S_k50, а далее по формуле (1) вычисляли значение d₅₀, которое должно быть не больше минимального требуемого диаметра аэрозолей равного 0,5 мкм. Получили 20 вариантов размеров щелей с различными значениями числа Рейнольдса и d₅₀.
Следующая стадия разработки виртуального импактора включала в себя построение модели секции виртуального импактора на основании полученных при расчетах параметров щелей, моделирование движения частиц воздуха в секции виртуального импактора и получение распределения частиц воздуха по скоростям в каждой точке области расчета для одной секции. Использовали систему автоматического моделирования Solid Works 2014 с приложением Flow Simulation.
На третьем этапе проводили расчетную проверку эффективности концентрирования частиц при выбранных параметрах с учетом полученного распределения частиц воздуха по скоростям. Использовали специально написанную программу обработки в среде MathLab. Программа рассчитывала смещение массива, включающего в себя 100 аэрозольных частиц, при движении между щелями. Производили пошаговое вычисление координаты каждой частицы с учетом центростремительного ускорения, обусловленного силой Стокса, появляющейся при взаимодействии аэрозольной частицы с воздушным потоком при его повороте в ходе движения между щелями (рис. 1). Оценивали попадание частиц в щель выходного потока.
На последнем этапе проводили экспериментальную проверку эффективности созданного виртуального импактора при совместной работе с циклонным коллектором.

2. Создание циклонного коллектора

При создании циклонного коллектора с жидкой фазой использовали расчеты [3], позволяющие определить эффективность захвата частиц жидкой фазой в зависимости от высоты и радиуса цилиндрической трубки, по стенкам которой циркулирует жидкость (рис. 2). Предполагали, что величина входного потока для циклонного коллектора равна величине выходного потока виртуального импактора. Для возможности рециркуляции жидкости в циклонном коллекторе предусматривали отдельный канал.

II. Проведение испытаний пробоотборника

Изготовленные виртуальный импактор и циклонный коллектор соединяли гибким воздуховодом и испытывали как совместно, так и раздельно, проверяя эффективность сбора аэрозолей. Испытания проводили в ФГБУ 48 ЦНИИ Минобороны России (г. Сергиев Посад), Московском метрополитене и в ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздрава России (г. Москва).
Испытания в ФГБУ 48 ЦНИИ Минобороны России проводили с использованием модельного сухого тест- препарата без биопатогенов в течение 10 дней. При проведении испытаний импактор устройства размещали внутри статической аэрозольной камеры, а циклонный коллектор, соединенный воздуховодом с импактором, — вне ее. Контроль интегральной концентрации и дисперсного состава аэрозоля, определение его массы в сорбирующих жидкостях проводили флуоресцентным и хемилюминесцентным методами. Эффективность работы пробоотборных устройств оценивали относительно пробоотборника КПК-3. С помощью импульсно- пневматического аппарата в статической камере создавали аэрозоль модельного сухого тест-препарата. С помощью прибора КПК-3 и четырехкаскадного импактора Мея оценивали интегральную массовую концентрацию аэрозоля и его дисперсный состав.
Испытания в досмотровых зонах вестибюлей станций «Черкизовская» и «Новокосино» Московского метрополитена проводили для определения эффективности созданного устройства в сравнении с комплектом для забора аэрозольной пробы SASS 4000/2300 (Research International Inc.; США). Собранные образцы направляли для микробиологического анализа и биомолекулярных исследований с целью определения состава микробиоты и ее количественного содержания.

III. Микробиологические исследования полученных образцов

В работе были использованы готовые агаризованные питательные среды в чашках Петри (ЦФГС; Россия): колумбийский агар с дефибринированной кровью, среда Байрда–Паркера, среда Сабуро с декстрозой и хлорамфениколом, среда Эндо, среда энтерококк-агар и приготовленная самостоятельно среда LB-агар (lysogeny broth, состав (г/л): 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 17 г агара). Перед посевом питательные среды прогревали до комнатной температуры. При необходимости подсушивали в термостате для удаления конденсата. Для посева образца использовали по 1 чашке каждой питательной среды (по 6 сред на образец).
Посев жидких образцов на питательные среды осуществляли автоматической пипеткой в объеме 0,1 мл на чашку Петри. Жидкость равномерно распределяли по поверхности среды стерильным L-образным шпателем.
Посевы инкубировали при температуре 37 °С в течение 48 ч. Посевы на среде Сабуро при отсутствии видимого роста продолжали инкубировать при комнатной температуре до 7 сут. включительно.
На каждой из питательных сред проводили учет выросших колоний, описывая их морфологические типы (МТ). Каждому МТ присваивали индивидуальный номер и проводили фотографирование колоний. Изолированные колонии отсевали на питательные среды для дальнейшей идентификации и определения чувствительности к антибиотикам. При наличии характерных морфологических признаков осуществляли предварительную идентификацию выросших колоний до уровня рода. 
Определение чувствительности выделенных культур к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом, с применением тестовых дисков (Himedia; Индия) с антибиотиками: ампициллин, амоксиклав, цефокситин, азитромицин, левофлоксацин, гентамицин, амикацин, тетрациклин, ванкомицин, новобиоцин, бацитрацин, оптохин и стандартизорованной для этих целей среде Мюллера–Хинтона (ООО «ЦФГС», Россия).
Измеряли диаметры зон задержки роста (ЗЗР) культур бактерий вокруг дисков с антибиотиками, затем сравнивали их с референсными значениями и относили культуру к одной из трех категорий: r — устойчива, s — чувствительна, i — умеренно чувствительна.
Испытания в ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи проводили с целью сравнения эффективности работы созданного устройства и комплекта для забора аэрозольной пробы SASS4000/2300 (Research International Inc.; США) при использовании жидкого модельного тест-препарата. Измерения проводили в боксе микробиологической безопасности специального исполнения «Ламинар-С» (ЗАО «Ламинарные системы»; Россия). Тест-препарат представлял собой 10% раствор сахарозы на карбонатном буфере (рН 9,6) (С3041; Sigma; Германия) с добавлением красителя флуоресцеина натрия в конечной концентрации 1 мкM. Сравнивали интенсивность люминесценции пробы, собираемой устройствами в течение 5 мин при непрерывном распылении аэрозоля в камере в процессе отбора пробы.

IV. Моделирование параметров виртуального импактора и определение эффективности концентрирования частиц

В результате проведенных расчетов были получены зависимости эффективности концентрирования аэрозольных частиц с диаметром 0,5–5 мкм от параметров виртуального импактора (рис. 3–рис. 5). Эффективность определяли как отношение числа концентрированных, т. е. прошедших в выходной канал (рис. 1), частиц заданного размера к числу частиц во входном потоке.
Эффективность концентрирования возрастает с 18 до 36% для частиц 0,5 мкм при уменьшении размера входного сопла W от 0,07 до 0,05 см (рис. 3). Однако при переходе к значению W равному 0,04 см эффективность резко падает. Это явление отмечалось в литературе [14] и указывает на необходимость учета соотношения размеров входной и выходной щелей: входная щель должна быть на 30–40% меньше выходной для достижения максимальной эффективности концентрирования.
При расстояниях (S) между входной и выходной щелью равных 0,13 и 0,15 см эффективность концентрирования частиц размерами 0,5–1 мкм достигает 27% (рис. 4). При уменьшении этого расстояния до значения 0,09 см наблюдается увеличение эффективности концентрирования до 45%. Важно, что для частиц размером больше 4 мкм для всех значений S расчетное значение эффективности не превышает 82%.
Уменьшение радиуса (R) закругления входной щели до 0,06 см приводит к падению эффективности концентрирования аэрозольных частиц диаметром 1,5–5 мкм (рис. 5). Увеличение радиуса до 0,12 см поднимает эффективность концентрирования частиц с диаметром 0,5 мкм до 64%, а частиц с диаметрами от 2,5 мкм до 91%. Тем не менее к увеличению радиуса закругления входной щели следует относиться с осторожностью, так как расчеты поля скоростей воздушного потока указывают на возможную турбулентность воздушного потока между щелями в этом случае.
Результатами расчета параметров циклонного коллектора с жидкой фазой стали величины, определяющие эффективность импакции (перевода аэрозольных частиц в жидкую составляющую). Это радиус трубки R = 42 мм, ее высота H = 100 мм, диаметр входного сопла 15 мм для объемной скорости входного потока Q = 350 л/мин.

V. Результаты моделирования параметров виртуального импактора и испытания устройства

На рис. 6 представлена схема устройства отбора аэрозольных проб. Пробоотборник состоит из виртуального импактора, соединенного воздуховодом с циклонным коллектором.
Циклонный коллектор является управляющим модулем для всего устройства. Процесс управления осуществляется при помощи сенсорного экрана и полностью автоматизирован. Отбор пробы устройством протекает в ходе последовательных операций, которые в совокупности составляют законченный цикл. В общем виде цикл состоит из подачи жидкой фазы из резервуара в циклонный коллектор, отбора пробы путем прокачки воздуха через модули устройства, выдачи жидкой фазы для анализа, очистки циклонного коллектора путем промывки. Длительность циклов и значения объемных скоростей прокачки могут регулироваться оператором. Объем жидкой фазы, выдаваемой устройством для дальнейшего анализа, составляет от 2,5 до 10 мл. Устройство может работать в сети по интерфейсу RS-485.
В табл. 1 представлены результаты испытаний устройства в ФГБУ 48 ЦНИИ Минобороны России. Эффективность отбора пробы модельного сухого тест- препарата созданным устройством отбора аэрозольных проб достигала 20% от полной массы распыленных частиц. При этом объемная скорость прокачки созданного устройства в 100 раз больше, чем у пробоотборника КПК-3, обеспечивающего 100% сбора. Циклонный коллектор устройства, функционирующий без виртуального импактора, отбирает до 61% от полной массы распыленных частиц при скорости прокачки в 6 раз выше, чем у прибора КПК-3.
По результатам испытаний в Московском метрополитене был проведен микробиологический анализ 64 собранных образцов. Выделено и идентифицировано 48 морфологических типов (МТ) микроорганизмов, составляющих микробиоту воздуха и поверхностей метрополитена. Сравнение созданного устройства отбора аэрозольных проб с системой SASS и контрольным методом использования фильтров высокой плотности (нанофильтров) показало, что по количеству морфотипов высеиваемых из собранных образцов они не имеют больших различий (рис. 7).
У 4 из 5 изученных штаммов бактерий, выделенных в метрополитене с использованием клинического протокола, обнаружен тот или иной тип резистентности. У штамма St. haemolyticus МТ22 обнаружена множественная резистентность — к макролидам и фторхинолонам. У Streptococcus viridans МТ8 множественная резистентность обнаружена к макролидам, аминогликозидам и защищенным ß-лактамам (табл. 2). Это говорит о возможной применимости прибора для контроля бактериологического состава и распространения антибиотикорезистентности в окружающей среде и в клинике.
Результаты количественного определения тотальной ДНК из отобранных проб, проведенного с помощью коммерческого набора PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit (Invitrogen; США) также показали отсутствие явного преимущества одной из использованных систем пробоотбора. Обе системы на два порядка превосходят контрольный метод с использованием фильтров высокой плотности (нанофильтров).
Испытания в ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи с жидким тест-препаратом показали, что созданное устройство обеспечивает его сбор на уровне 96% от системы SASS по результатам 5 измерений с доверительной вероятностью 0,95.

VI. Пути оптимизации работы аэрозольного пробоотборника

Моделирование параметров виртуального импактора и экспериментальная проверка показывают, что при создании реального устройства основные трудности возникают при обеспечении концентрирования аэрозольных частиц с размерами менее 1 мкм. Получение 50% эффективности концентрирования таких частиц (d₅₀) в первую очередь связано с уменьшением ширины входных щелей. Уменьшение ширины щели с 0,5 до 0,4 мм приводит к снижению скорости входного потока в 1,5 раза, что в несколько раз уменьшает эффективность концентрирования. Для поддержания скорости входного потока необходимо во столько же раз увеличить перепад давления, обеспечиваемый вентилятором, что сразу приводит к росту энергопотребления и массогабаритов устройства. Представляется достаточно обоснованным говорить о том, что при требовании концентрирования аэрозольных частиц с размерами менее 1 мкм реально достижимая линейная скорость воздушного потока через входные щели не может быть больше 100 см/с, а разумная ширина щели не может быть менее 0,5 мкм. В созданном устройстве при работе на максимальной мощности объемная скорость прокачки воздуха не превышает 4500 л/мин.
Эффективность осаждения аэрозольных частиц в жидкую фазу циклонным коллектором может быть увеличена за счет создания во входном патрубке искусственного распыления мелкодисперсных водяных капель. Отдельной оптимизации требует согласование значений аэродинамического сопротивления выходного тракта виртуального импактора и входного тракта циклонного коллектора, чего в данной работе сделано не было. При дальнейшем совершенствовании устройства целесообразным также представляется реализация функции удаленного управления устройством и параметрами отбора по wi-fi сети.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе проведены расчеты, на основании которых создано устройство для сбора аэрозольных частиц размерами 0,5–5 мкм с высокой объемной скоростью и концентрированием в жидкой фазе. По результатам проведенных испытаний, прибор обеспечивает отбор аэрозолей с объемной скоростью до 4500 л/мин, эффективностью концентрирования до 20% по массе при объемной скорости более 4000 л/мин и до 61% по массе при объемной скорости более 300 л/мин. Диапазон размеров селектируемых аэрозольных частиц — 0,5–5 мкм, масса виртуального импактора устройства 7,2 кг, масса циклонного коллектора — 5,6 кг. Электропитание — 220 В переменного тока, 24 и 12 В постоянного тока. Устройство выполнено в пылевлагозащищенном корпусе. По достигнутым показателям эффективности прибор соответствует лучшим мировым образцам. При этом более 90% комплектующих деталей прибора — российского производства. Устройство может быть использовано для обеспечения биологической безопасности на транспорте, объектах инфраструктуры, для мониторинга воздушной обстановки на таможенных и пограничных пунктах, экологического наблюдения, а также при оснащении лечебных и научно-исследовательских учреждений Министерства здравоохранения и Министерства обороны Российской Федерации.