Анкилозирующий спондилит (АС, или Болезнь Бехтерева) — это хроническое, прогрессирующее аутоиммунное заболевание, сцепленное с HLA B2705, проявляющееся в преимущественном воспалении суставов позвоночника и крестцово-подвздошного сочленения, что влечет за собой ограничение их подвижности вплоть до образования костных сращений, т. е. анкилоза. Основные очаги воспаления локализуются в межпозвоночных суставах, а также в реберно-позвоночных и крестцово-подвздошных сочленениях. Для лечения применяют препараты, способствующие остановке воспалительных процессов. Например, назначают физиотерапию и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВС), такие как ибупрофен, диклофенак, индометацин. Крайне мало известно о применении стероидных препаратов для лечения АС. Показано, что прием преднизолона в высокой дозе (50 мг/день) в течение двух недель значительно снижает симптомы заболевания в краткосрочной перспективе [1]. Описан долгосрочный эффект глюкокортикоидов, которые вводили внутривенно в высокой дозе [2]. Наблюдалось снижение симптомов заболевания, сохранявшееся в течение года после введения лекарства, а также побочное действие препарата: повышение артериального давления, уровня сахара в крови и снижение минерализации костей. Пациентам с тяжелыми формами АС назначают фенилбутазон и опиоиды для снижения болевых ощущений. Применяемые схемы лечения позволяют частично снять симптоматический комплекс, но не останавливают развитие заболевания, в том числе вероятность формирования анкилоза, и вызывают значительные побочные эффекты, например со стороны желудочно-кишечного тракта [3].

В последние 15 лет существенным прогрессом в терапии АС стало применение биологических блокаторов фактора некроза опухоли альфа (ФНО), таких как infliximab, adalimumab, golimumab и certolizumab pegol (моноклональные антитела к ФНО). ФНО является основным индуктором воспаления, который вовлечен в развитие и многих других аутоиммунных заболеваний [4]. С 2010 г. блокаторы ФНО вошли в перечень видов терапии пациентов с АС, рекомендованных международным обществом экспертов в области спондилоартритов (ASAS) [5]. Так, использование infliximab (моноклонального антитела к ФНО) приводит к супрессии спинального воспаления и как результат к снижению боли и скованности [6]. Опыт применения препаратов показал, что только у 50–60% пациентов, страдающих АС, наблюдается положительный эффект связанный с анти-ФНО терапией [7]. Однако стоит отметить, что ингибирование ФНО или его рецептора хотя и приводит к снижению воспаления, не тормозит развитие заболевания в целом [8, 9].

Известно, что при аутоиммунных заболеваниях растет количество, продуцируемого IL17. Ранее было показано, что в суперпродукцию IL17 вовлечено несколько типов клеток: CD4⁺Тн, гамма/дельта и KIR3DL2- экспрессирующих T-клеток. В 2013 г. была опубликована работа по использованию моноклонального антитела против IL17 (secukinumab) для снижения выраженности симптоматики, сопровождающей АС. Применение этого препарата значительно снизило клинические проявления АС в острой фазе [10, 11].

На стадии клинических исследований препаратов для лечения аутоиммунных заболеваний, в том числе и АС, находятся моноклональные антитела к рецепторным комплексам CD3 и CD4, обладающие иммуномодулирующими свойствами [12–14]. На сегодняшний день подтверждено как на животных моделях, так и на группах пациентов, страдающих ревматоидным артритом, что применение данных препаратов вызывает снижение уровня провоспалительных факторов, а также увеличение уровня супрессорных факторов (IL10, TGFβ) [14, 15]. В то же время применение анти-CD3-антител стимулирует не только Т-регуляторные клетки, но и другие Т-клеточные субпопуляции, а также может вызывать массированный апоптоз среди Т-лимфоцитов [16]. Кажется очевидным, что выведение из организма значительной субпопуляции Т-лимфоцитов, крайне травматично для иммунной системы в целом и приведет к снижению иммунитета, увеличению риска возникновения как инфекционных, так и онкологических заболеваний. Показано также, что применение такого подхода влечет за собой риск появления вторичных аутоиммунных заболеваний.

Узнавание антигена Т-клетками, происходит за счет Т-клеточного рецептора (ТКР), состоящего из двух полипептидных цепей (α и β). При формировании цепей в ходе негомологичной рекомбинации происходит сближение V-, D- и J-сегментов, а на стыке сегментов терминальная трансфераза добавляет случайные нуклеотиды, которые обусловливают появление уникальных вариабельных участков (CDR). Именно за счет этих процессов формируется разнообразие ТКР.

Согласно номенклатуре IMGT среди β-цепей ТКР человека выделяют 26 различных вариабельных сегментов, а для α-цепи 41 сегмент [17]. В норме после прохождения позитивной и негативной селекции в тимусе обладающие аутоиммунной активностью Т-клетки элиминируются. Несмотря на это описано множество заболеваний, связанных с аутореактивностью Т-клеток.

Один из обсуждаемых в литературе подходов — использование антитела, которое узнает все α- и β-ТКР. Такой подход был описан в одной из работ [18], где показано, что одновременное введение антитела и индуктора (миелинового пептида MOG35-55) полностью блокировало развитие экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE). При этом наблюдалась ожидаемая деплеция CD4⁺- и CD8⁺-клеток. Однако эти популяции Т-клеток вели себя по-разному: первыми исчезали CD4⁺ и они же первыми восстанавливались, тогда как CD8⁺, наоборот, позже исчезали и позже восстанавливались. Авторы также отметили тот факт, что эффект такой терапии был постоянным, т. е. не наблюдалось проявления заболевания даже после полного восстановления Т-клеточной популяции, в отличии от терапии антителами против CD3. Несмотря на то, что оба вида терапии направлены на деплецию Т-клеток, механизмы, которые активируются внутри клеток за счет формирования двойственного комплекса ТКР и CD3 с антителами, разные и приводят к различным эффектам. Использование моноклональных антител против вариабельных доменов, характерных для аутореактивных ТКР, выглядит многообещающим. В результате такой терапии происходит направленное устранение узкой группы Т-лимфоцитов, включающей патогенный клон. Появление технологий NGS дало импульс к развитию новых подходов, позволяющих проводить глубокий анализ репертуаров ТКР. Сложность анализа заключается в чрезвычайном разнообразии ТКР [19], именно поэтому выявление патологического Т-клона при сравнении репертуаров ТКР больного и здорового доноров представляется трудоемкой задачей. Кроме того, важно учитывать, что структурные особенности белков главного комплекса гистосовместимости, участвующих в представлении антигенов, также оказывают влияние на формирование Т-клеточного репертуара.

Несмотря на все эти препятствия в 2017 г. удалось найти Т-клеточные клоны, потенциально вовлеченные в патогенез АС, и выделить консенсусный мотив CDR3 [20, 21]. Показано, что такие клоны представлены у больных АС в синовиальной жидкости и периферической крови. Примечательно, что при той же глубине анализа у здоровых доноров потенциально патогенные ТКР отсутствуют независимо от того, являются доноры носителями аллеля HLA*B27 или нет. Выявленные АС-ассоциированные ТКР содержали генный сегмент TRBV9 (согласно номенклатуре IMGT), кодирующий вариабельный домен β-цепи. Все эти данные указывают на возможность использования моноклонального антитела к TRBV9 для лечения АС.

Для эффективной терапии аутоиммунных заболеваний необходимо, чтобы несущие патогенный ТКР Т-клетки были элиминированы. Известно, что антитела класса IgG1, содержащие в своем составе Fc-фрагмент, связываясь с клеткой-мишенью, приводят к ее смерти. Описано два возможных механизма этого процесса: антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимая цитотоксичность (CDC). Механизм ADCC заключается в следующем: антитело, несущее определенный Fc, связывает свой эпитоп на поверхности клетки. Fc-домен, в свою очередь, узнает эффекторная Т-клетка (спектр клеток, несущих рецептор широк), которая несет рецептор FcR или СD16. В ответ на формирование такого тройственного комплекса внутри эффекторной Т-клетки запускается каскад, приводящий к высвобождению цитотоксических гранул. В результате клетка-мишень погибает через перфорин-гранзимовый путь. Эффективность связывания Fc-фрагмента с рецептором на эффекторных Т-клетках зависит от аллотипа данного иммуноглобулина и паттерна гликозилирования его аминокислотной последовательности. В зависимости от этого цитотоксическая активность антитела может значительно меняться [22]. CDC работает похожим образом, только в данном случае на антителе собирается комплемент, который активирует каскадный путь, ведущий к апоптозу. Таким образом, для того чтобы добиться элиминации таргетных Т-клеток, при моделировании терапевтического антитела, мы использовали IgG1 Fcфрагмент такого же аллотипа, как и в лечебном антителе rituximab.

Целью данного исследования было определить специфичность и оценить цитотоксичность в системе in vitro разных вариантов моноклональных антител к вариабельному TRBV9-домену β-цепи ТКР

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Доноры крови

Для анализа специфичности полученных антител с помощью проточной цитометрии и цитотоксического теста in vitro использовали периферическую кровь двух доноров мужчин в возрасте 53 лет. Взятие образцов крови проводили 7 раз, не чаще одного раза в неделю. Исследование было одобрено этическим комитетом НМИЦ ДГОИ им. Д. Рогачева Минздрава России (протокол № 2013-5/4).

Выделение клеток мононуклеарной фракции крови

Образцы периферической крови собирали в пробирки Vacuette c K2-EDTA (по 4 мл), разбавляли в 4 раза с помощью PBS. Далее в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина с плотностью 1,077 г/см³ (ПанЭко; Россия) выделяли мононуклеарную фракцию (PBM). Наслаивали разбавленный образец крови на раствор фиколла-урографина в объемном соотношение 1/1. Центрифугировали в бакетном роторе при комнатной температуре на скорости 400 g 30 мин. Собирали клеточную суспензию на интерфазе и два раза промывали с помощью PBS. Центрифугировали на скорости 400 g 10 мин при комнатной температуре. Определяли выход мононуклеаров с помощью подсчета клеток в камере Горяева.

Получение химерных антител и кинетический скрининг антител с помощью биослойной интерферометрии Препараты антител для тестирования были наработаны биотехнологической компанией BioCad. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности МА-K1, МАК2, МА-К3, МА-К4 были опубликованы в патентной заявке. Моноклональные антитела МА-K1, МА-К2, МАК3, МА-К4 содержали химерные последовательности тяжелой цепи (H) и легкой цепи (L), которые включали в себя вариабельный домен иммуноглобулина крысы и константный домен иммуноглобулина человека. «Степень гуманизации» антител составляла 65%.

Определение константы диссоциации комплексов растворимого ТКР и химерного АТ проводили на приборе ForteBio Octet RED384 (Pall Corporation; США). Растворимый ТКР в концентрации 20 мкг/мл иммобилизировали на поверхность AR2G сенсоров (ForteBio) с последующей деактивацией 1 М этаноламином (pH 8.5) по стандартному протоколу согласно инструкции производителя. Анализ проводили при 30 °С c использованием PBS, содержащим 0,1% Твин-20 и 0,1% BSA в качестве рабочего буфера. После определения базовой линии сенсоры погружали в лунки с раствором антител в концентрации 67 нМ на 300 с, где образовывался комплекс. Затем детектировали диссоциацию комплекса в буферном растворе в течение 600 с. Кривые связывания с вычетом референсного сигнала анализировали с помощью программы Octet Data Analysis (версия 9.0) согласно стандартной процедуре с использованием модели взаимодействия 1:1 Global.

Цитометрический анализ Для визуализации работы полученных моноклональных антител МА-K1, МА-K2, МА-K3 и МА-K4 проводили мечение с помощью флуоресцеина. Использовали реагент флуоресцеин изотиоцианат (Sigma; США), мечение проводили по протоколу производителя. Контроль количества флуорохромов, вступивших в реакцию с молекулами антитела, осуществляли по соотношению спектра поглощения при длинах волн 495/280 нм.

10⁶ клеток PBMC, выделенные на градиенте фиколлаурографина (см. выше) инкубировали с каждым из тестируемых моноклональных антител МА-K1, МА-K2, МА-K3 и МА-K4, меченых FITC, в двух концентрациях: 3 мкг/мл (А) и 200 нг/мл (В), добавляли также CD3- eFluor450 (clone UCHT1, eBioscience; США) в количестве, рекомендуемом производителем. Тест проводили в 50 мкл 1Х PBS, содержащего 0,5% BSA. Инкубировали при комнатной температуре 20 мин, после чего отмывали тем же раствором.

Клеточная сортировка и секвенирование

К 3×10⁶ PBMC добавляли 100 мкл раствора PBS/BSA 0,5%, 6 мкл anti-CD3-eFluor 450 (clone UCHT1; eBioscience; США) и отдельно каждое МА-K1, МА-K2, МА-K3, МА-K4, меченное FITC до конечной концентрации 100 нг/ мл. Инкубировали при комнатной температуре 20 мин, отмывали 0,5% раствором PBS/BSA.
Анализ и сортировку клеточных популяций проводили на приборе FACSariaIII (BD; США). Для корректного исключения из зоны анализа всех частиц, которые не соответствовали по размерам и гранулярности живым лимфоцитам, вводили ограничения в гистограммы распределения по малоугловому и боковому светорассеивани, выделяя популяцию, соотвествующую мононуклеарной фракции клеток крови. Последовательным гейтированием выделяли на двупараметрической гистограмме популяцию клеток: CD3⁺TRBV9⁺ и CD3⁺TRBV9^-.

Для контроля качества сортинга проводили ресортировку популяции CD3⁺TRBV9⁺, которая показала, что обогащение клетками целевой популяции составило 95%. Далее клетки собирали в буфер RLT (Qiagen; Германия), выделяли суммарную РНК с помощью набора реагентов Qiagen RNAeasy mini kit #217004 согласно протоколу производителя. Полученную суммарную РНК использовали для синтеза кДНК и дальнейшей амплификации фрагмента β-цепи ТКР по протоколу, описанному в работе [23]. К полученным ампликонам лигировали адапторы (Illumina; США) и секвенировали на платформе MiSeq (Illumina; США). Данные секвенирования анализировали с помощью программ MiGEC, MiXCR и VDJtools [24], как описано в работе [25]. Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ GraphpadPrism 3.0.

Цитотоксический тест

Проверку цитотоксичности химерных антител проводили на PBMC, выделенных из двух доноров. Образцы периферической крови собирали в пробирки Vacuette c K2-EDTA. Мононуклеарную фракцию клеток крови выделяли так же, как описано выше.
После выделения клетки переносили в PBS, содержащий 0,5% BSA и 2 мМ EDTA. Аликвоту клеток использовали для подсчета общего количества клеток. Их жизнеспособность определяли по методу окрашивания с трипановым синим. Для определения эффективности цитотоксичности, 3–4 × 10⁶ клеток инкубировали в течение 1 ч с антителом МА-К2 в концентрации: 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл и 1 мкг/мл. Затем клетки два раза промывали PBS, переносили в среду RPMI, содержащую 10% человеческой сыворотки (BioIVT; Великобритания) и инкубировали 24 ч в СО₂ инкубаторе. После этого собирали клетки, проводили окрашивание с антителами CD4^-PE (clone RPA-T4; BD Bioscience; США), CD8-FITC (clone SK3; eBioscience; США), CD3^-eFluor450 (clone UCHT1; eBioscience; США) и TOPro3readyflow (ThermoFisher; США) согласно протоколу производителя с последующим цитометрическим анализом на клеточном сортере FacsAriaIII (BD; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Химерные моноклональные антитела МА-K1, МА-K2, МА-K3, МА-K4 специфически связывают растворимый ТКР, содержащий TRBV9

В данной работе использовали 4 варианта моноклонального антитела к TRBV9 (МА-K1, МА-К2, МА-К3, МА-К4), различающихся аминокислотными последовательностями гипервариабельного домена (CDR3).

Количественные характеристики (константы диссоциации и скорости диссоциации комплексов растворимого ТКР и химерных (МА-K1, МА-K2, МА-K3, МА-K4) антител были определены методом биослойной интерферометрии (ForteBio, Pall Corporation; США) и методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (см. таблица). Все варианты иммуноглобулинов показали высокую специфичность и эффективное связывание с целевым растворимым ТКР, который был закодирован генным сегментом TRBV9, и не взаимодействовали с ТКР, содержащим вариабельный домен, который кодировался другим генным сегментом (TRBV7). Специфичность взаимодействия исследуемых антител не зависела от того какая α-входила в состав комплекса ТКР. Было проверено два комплекса ТКР, содержащих в своем составе TRBV9 и TRAV26 или TRAV38, в обоих случаях связывание с антителами было одинаковым. В результате этого эксперимента нами были отобраны два клона МА-К2 и МА-K4, для которых константы диссоциации и скорости диссоциации были минимальными (kD < 1.0E-12 и kdis < 1.0E-07 1/s) (таблица).

Аффинность для цитотоксических антител часто напрямую определяет эффективные концентрации, специфичность и безопасность при использовании in vivo. Высокое сродство к антигену химерных МА-К2 и МА-K4 создает хорошую предпосылку к использованию данных антител в терапевтических целях.

Химерные иммуноглобулины специфично выделяют популяцию TRBV9⁺ лимфоцитов

Для последующего цитометрического анализа клеточных популяций полученные химерные антитела МА-K1, МАK2, МА-K3 и МА-K4 конъюгировали с флуоресцеином. Использование напрямую меченых флуорохромом моноклональных антител значительно увеличивает информативность цитометрических исследований.
Вся панель химерных МА в концентрации 3 мкг/мл окрашивала около 3% популяции CD3-положительных клеток (рис. 1А). При использовании более низкой концентрации 200 нг/мл (рис. 1Б), было показано, что 3 мкг/мл превышает предельную; при этой концентрации процент TRBV9⁺ клеток не менялся, но повышался процент неспецифического связывания антител с клетками CD3^- фракции (13 ± 2%) (рис. 1).

На основании максимального соотношения процента клеток TRBV9⁺CD3⁺/TRBV9⁺CD3^– и высокой интенсивности специфического сигнала флуоресцеина, антитело МА-К2 было выбрано, как наиболее перспективный кандидат для дальнейшей работы. Используя меченое антитело МАК2, для определения оптимальной концентрации провели раститровку с понижением концентрации антитела с 200 до 2 нг/мл (рис. 1В). Тест проводили с использованием PBMC крови здорового донора. В результате, для окрашивания 10⁶ клеток PBMC была определена минимальная концентрация МА-К2 (50 нг/мл), при которой процент TRBV9⁺-клеток сохранялся на уровне 3% от популяции CD3⁺-клеток, а неспецифического связывания не наблюдалось.

Специфичность работы антитела МА-К2 была подтверждена с помощью сортировки субпопуляции лимфоцитов и последующего анализа репертуара ТКР методом секвенирования (рис. 2А). Для сортинга использовали PBMC, выделенные из образца периферической крови здорового донора, окрашенные флуоресцентно-мечеными антителами CD45, CD3 и МАК2, которые использовали в концентрации 100 нг/мл (рис. 2A). Для анализа репертуара Т-клеточных рецепторов были собраны две популяции клеток, двойные позитивные по TRBV9 и CD3, а также TRBV9^– CD3⁺-клетки. Сортировки проводили в двух технических повторностях. Такая постановка эксперимента была призвана показать эффективность сортировки целевой популяции лимфоцитов. В случае специфического связывания антитела МА-К2 с Т-клеточным рецептором в популяции TRBV9⁺CD3⁺ должно наблюдаться обогащение библиотеки кДНК транскриптами, относящимся к TRBV9, а во второй, наоборот, целевые последовательности должны отсутствовать. Из этих образцов выделили суммарную РНК и провели синтез кДНК со специфических праймеров, комплементарных константному району β-цепи ТКР. Затем амплифицировали библиотеки и секвенировали с помощью NGS (MiSEQ, Illumina; США). Анализ полученных репертуаров β-цепей ТКР показал, что библиотеки, полученные в результате сортировки с помощью антитела МА-К2, были обогащены на 93% последовательностями, которые кодировались генным сегментом TRBV9. Тогда как в репертуарах β-цепей негативной фракции CD3⁺TRBV9^– последовательностей, содержащих TRBV9, обнаружено не было.

Полученные результаты указывают на высокую специфичность и эффективность используемого химерного антитела.

Определение цитотоксичности химерных иммуноглобулинов

Для определения активности данного моноклонального антитела требовалось применение нестандартного подхода, что обусловливалось несколькими причинами. Во-первых, целевая популяция клеток составляла относительно небольшую в долевом отношении популяцию клеток в общем клеточном пуле (2,5% от CD3⁺-лимфоцитов). Во-вторых, эта популяция может быть выделена из общего пула только по одному уникальному поверхностному маркеру — Т-клеточному рецептору, в состав которого входит уникальный вариабельный домен β-цепи. Это затрудняет использование клеточного сортинга для обогащения целевой TRBV9⁺ клеточной популяцией и проведения цитотоксического теста по классической схеме: целевая популяция клеток и натуральные киллеры в разных соотношениях.

Таким образом, цитотоксическую активность МАК2 детектировали с помощью цитофлюометрического метода. В качестве клеточной смеси использовали мононуклеарную фракцию клеток крови, которая содержит как целевую популяцию клеток, так и необходимые клеточные популяции, опосредующие цитотоксическую реакцию (натуральные киллеры и т. д.). Полуэффективная цитотоксическая концентрация (EC₅₀) антитела МАК2 была определена в серии in vitro экспериментов. Цитотоксический эффект оценивали по прогрессивно снижающейся доли TRBV9^-позитивных клеток в популяции CD3⁺ лимфоцитов, что коррелировало с увеличением концентрации антитела МА-К2 (рис. 2Б). При концентрации 100 нг/мл наблюдали полную элиминацию популяции клеток TRBV9⁺CD3⁺. Таким образом, EC₅₀ для антитела МА-К2 составила 7 нг/мл (рис. 2В).

В эксперименте по определению процента мертвых клеток среди CD4⁺CD3⁺ и CD8⁺CD3⁺ лимфоцитов после инкубации с антителом МА-К2 добавляли краситель TOPro3readyflow (ThermoFisher) (рис. 2Г). Через 24 ч после инкубации с тестируемым антителом при концентрации 100 нг/мл наблюдалось значительное увеличение доли мертвых клеток по сравнению с контролем (рис. 2Г). Этот эксперимент был сделан в семи повторностях, в каждой из которых мы наблюдали увеличение процента мертвых клеток в зависимости от концентации вносимого антитела.

Таким образом, в системе in vitro была продемонстрирована цитотоксическая активность химерного антитела МА-К2. Полученные данные свидетельствуют о высокой цитотоксической активности исследуемого моноклонального химерного антитела в отношении клеток мишени и специфичности полученного антитела.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существующие лечебные антитела с успехом применяются для терапии тяжелых заболеваний, таких как рассеянный склероз, некоторые виды рака, дегенерация сетчатки. Разработка антител основывается на известных мишенях, вовлеченных в патогенез заболевания. Недавно была показана корреляция болезни Бехтерева и Т-клеточного клона, содержащего вариабельный участок β-цепи, закодированный генным сегментом TRBV9 [20, 21].. Участие определенного Т-клона в развитии патогенного процесса еще требует дальнейшего подтверждения, но Т-клеточный рецептор сам по себе является перспективной мишенью для разработки терапевтического антитела.

Основным результатом этого исследования было получение цитотоксического химерного (человек– крыса) антитела МА-К2, которое высокоэффективно и специфично связывается с участком β-цепи ТКР, закодированным геном TRBV9. В работе для тестирования цитотоксичности антитела МА-К2 мы использовали метод проточной цитометрии и окрашиванием с помощью красителя TO-Pro3readyflow (ThermoFisher; США), который позволяет с высокой точностью разделить живые и мертвые клетки. Такой подход не является общепринятым для оценки антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Так, в литературе описано несколько методов для оценки количества клеток, погибших в результате взаимодействия с цитотоксическим антителом, однако многие из них обладают рядом недостатков. Например, широко применяемый метод при анализе ADCC, основанный на детекции ⁵¹Cr [26], который высвобождается при специфическом лизисе клеток, не обладает достаточной чувствительностью, а также не позволяет оценить долю мертвых клеток в популяции. Это затрудняет его использование в случае, когда целевая фракция клеток составляет 3% и менее в клеточной смеси. Подход, который использовался в данной работе, был недавно успешно применен при оценке цитотоксичности антитела Trastuzumab для детекции менее 10% мертвых клеток как в клеточной культуре, так и в PBMC [27].

Мы предполагаем, что полученное нами антитело можно будет использовать для устранения in vivo популяции Т-клеток, ассоциированной с анкилозирующим спондилитом. Это должно привести к снижению симптоматического комплекса при АС. Как уже отмечалось, элиминация патологического клона при аутоиммунных заболеваниях является перспективным подходом, а также одной из ступеней к персонализированной медицине. В литературе существуют примеры успешного использования моноклональных антител против Vβ и для лечения аутоиммунных заболеваний в модельных системах. Так, в модельной системе у мышей с аутоиммунным энцефаломиелитом все аутореактивные клоны Т-клеток имели в составе ТКР домен, который кодировался генным сегментом Vβ8 (TRBV13). После индукции заболевания пептидом МВР введение моноклонального антитела, специфичного к этому домену, оказывало защитный эффект, в результате которого заболевание не развивалось [28]. Другое моноклональное антитело к Vβ8 (KJ16) было использовано для протекции мышей, в модели с коллаген-индуцированным артритом. Введение этого антитела привело к существенному снижению частоты возникновения артрита после индукции заболевания [29].

Следует также отметить, что процент клеток, несущих на своей поверхности ТКР, участок которого кодируется TRBV9, невысок и не превышает 3%. Этот факт позволяет предположить, что при введении антитела против TRBV9 в организм не будет наблюдаться сильного токсического эффекта, вызванного гибелью большого числа клеток и цитокинового релиза («цитокиновый шторм»), как в случае с некоторыми анти-CD3 моноклональными антителами [30].

На сегодняшний день для таргетной терапии применяются моноклональные антитела с различной степенью гуманизации, которая необходима для снижения иммуногенности препарата. Можно выделить три основных типа: химерные (константный домен от человека и вариабельный домен мыши), гуманизированные (человеческое антитело и мышиный CDR) и полностью гуманизированное [31]. МА-К2, свойства которого изучались в данной работе, гуманизировано на 65%. На следующем этапе исследования мы планируем провести направленную гуманизацию МА-К2 и выйти с гуманизированными вариантами антител на эксперименты в in vivo системе на приматах.

ВЫВОДЫ

В ходе работы было охарактеризовано четыре химерных моноклональных антитела к TRBV9 (МА-K1, МА-K2, МА-K3, МА-K4), отличающиеся аминокислотными последовательностями гипервариабельного домена (CDR3). Семейство TRBV9 по литературным данным ассоциировано с патогенезом АС. На основе биохимических характеристик (Kd, Kdis, специфичности) для дальнейших исследований было выбрано МА-К2, которое обладало высокой специфичностью и цитотоксичностью в отношении клеток-мишеней. В дальнейшем планируется получить гуманизированный вариант антитела и провести исследования in vivo на приматах. В случае, если в этих экспериментах удастся количественно элиминировать популяцию Т-клеток, несущую TRBV9, это моноклональное антитело можно рассматривать как инструмент к изучению АС и потенциальный препарат для таргетной терапии АС.