Ранняя диагностика и эффективная терапия рака крайне важны для снижения заболеваемости и смертности от этой болезни. Чтобы добиться этих целей, нужно изучать и разрабатывать:
1) специфичные для каждой опухоли молекулы, которые могут служить как диагностическими маркерами, так и целями для таргетирования;
2) средства визуализации и доставки лекарств в пораженные участки тела, позволяющие эффективно проводить терапевтическое вмешательство, не затрагивая здоровые ткани. Несмотря на то что эти два подхода известны и широко обсуждаются, развитие персонализированной медицины идет довольно медленно, в частности из-за наличия малого числа подходящих молекулярных маркеров. Например, из ~1500 белков, предложенных в качестве биомаркеров рака в 2000–2010 гг, не более 20 были допущены к исследованиям Управлением по контролю качества пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA) [1]. В то же время применение нанотехнологий в медицине (наномедицина) оказывает огромное влияние на развитие терапии рака нового поколения, как показывает количество проводимых клинических и доклинических испытаний с использованием этих технологий [2, 3]. Нанопрепарат — это терапевтический, диагностический или комбинированный (тераностический = терапевтический + диагностический) агент, помещенный внутрь наночастицы (НЧ) или присоединенный к ней. НЧ способствует лучшему биораспределению агента, повышает его эффективность или понижает токсичность. В ходе работы были идентифицированы новые биомаркеры и изучено применение нанопрепаратов таргетированной доставки для визуализации рака (флуоресцентные НЧ) и его терапии (содержащие лекарства липосомы) на моделях для доклинических исследований. В настоящем обзоре мы кратко описываем основные результаты этой работы.

Прицельная молекулярная визуализация метастатического колоректального рака

Наша исследовательская группа описала ранее неизвестный комплекс интегрина альфа-6 и E-кадгерина, который присутствует на поверхности раковых клеток толстой кишки и отсутствует у нормальных клеток толстой кишки [4]. Мы идентифицировали также специфический лиганд к этому рецепторному комплексу, а именно ангиопоэтинподобный белок 6 — фактор, в больших количествах вырабатываемый здоровой печенью и физиологически вовлеченный в метаболизм липидов. Данный комплекс рецептора и лиганда участвует во вторичном распространении опухолей: раковые клетки толстой кишки выделяют рецептор, нормальные клетки печени секретируют лиганд, а их взаимное распознавание позволяет раковым клеткам заселить печень, в итоге образовывая там скопление метастазов [4].

Кроме того, описаны два пептида-аналога ангиопоэтинподобного белка 6, которые связывают комплекс интегрин альфа-6/E-кадгерин. Эти пептиды, имеющие последовательность CGIYRLRS и CGVYSLRS (однобуквенный код аминокислот), благодаря способности конкурировать с ангиопоэтинподобным белком 6 при связывании рецепторного комплекса (и таким образом ингибировать метастазирование в печень) представляют собой потенциальное средство для идентификации клеток опухолей, которые вырабатывают как интегрин альфа-6, так и E-кадгерин [4]. Мы использовали их способность к связыванию при создании нанопрепаратов для визуализации рака [5]. В данном исследовании были использованы кремниевые НЧ, которые имеют подходящий токсикологический профиль и хорошую биосовместимость in vivo в сочетании с легкостью выполнения манипуляций in vitro [6, 7]. Были созданы модульные наносистемы, чтобы получить визуализационную платформу, состоящую из флуоресцентных кремний-полиэтиденгликолевых (ПЭГ) НЧ, на поверхности которых присутствует пептид CGIYRLRS или CGVYSLRS. Такие НЧ имеют ядро из диоксида кремния, к которому добавлены один или несколько флуоресцентных красителей на основе алкоксисиланов; ядро заключено в мицеллу сополимера Pluronic®F127. Иными словами, они состоят из полиэтиленгликолевой оболочки, внутри которой находится ядро из диоксида кремния с добавлением красителя. Полиэтиленгликоль снаружи работает как стандартный полимер для обеспечения малозаметности, способствуя стабильной дисперсии в физиологических условиях и препятствуя поглощению клетками фагоцитарной системы. Кроме того, полиэтиленгликолевые хвосты могут быть дериватизированы для обеспечения возможности ковалентного присоединения пептидов направленного действия. Наши кремниевые НЧ имеют диаметр ядра SPN 11 ± 3 нм и гидродинамический диаметр 23 нм, они содержат краситель родамин A (Rhod), цианин 5 (Cy5) (одноцветные) или оба (двухцветные). Их специфичность была сначала изучена ex vivo на образцах метастазов печени пациента в сравнении с образцами нормальной печени и первичного рака толстой и прямой кишки (рис. 1). Срезы образцов замороженных человеческих тканей инкубировали с контролем (без метки) и с двухцветными (Rhod + Cy5) кремниевыми НЧ с пептидной меткой. Селективность НЧ оценивали методом конфокальной микроскопии (визуализация, рис. 1 A–Г; количественные показатели, рис. 1Д), выявляя специфическое связывание кремниевых НЧ CGIYRLRS- и CGVYSLRS-(Rhod + Cy5) с клетками метастазов печени (рис. 1Б) и проводя сравнение с образцами ткани нормальной печени (рис. 1A) и толстой кишки (рис. 1В), а также первичной опухоли (рис. 1Г).

Кремниевые НЧ исследовали in vivo на модельных мышах с псевдо-метастатической опухолью (раковые клетки толстой кишки человека имплантировали в селезенку мышей с диабетом без ожирения/тяжелым комбинированным иммунодефицитом; рис. 2). Имеющим опухоли мышам ввели контроль и меченые кремниевые НЧ. Сигнал был зарегистрирован после того, как время циркуляции превысило 1 ч. Через 6 ч мы заметили значительное снижение фоновой флуоресценции, и величина соотношения сигнал–фон оставалась неизменной после 16 и после 24 ч. Это позволяет предположить, что освобождение лишенных метки НЧ сопровождается накоплением меченых кремниевых НЧ в метастатических очагах, обеспечивая большой временной интервал для переноса метода в клинику. Флуоресцентная визуализация методом стереомикроскопии и конфокальной микроскопии подтвердила специфичное накопление в метастазах кремниевых НЧ (Rhod)-CGIYRLRS (рис. 2A, Г, Ж, З), НЧ (Cy5)-CGIYRLR (рис. 2Б, Д, И, К) и НЧ (Rhod-Cy5)-CGIYRLRS (рис. 2В, Е, Л, М, Н, О). Трехмерная реконструкция нескольких конфокальных микрофотографий показала, что меченые кремниевые НЧ располагаются очень близко к кровеносным сосудам опухоли (рис. 2П, Р).

Интраоперационно флуоресцентные индикаторы начинают применять при раке простаты, желудка, мочевого пузыря и яичников [8–11]. Возможна флуоресцентная визуализация наружных злокачественных образований, а именно немеланомных опухолей кожи [12]; уже разработаны эндоскопические системы флуоресцентной визуализации, предназначенные для применения при раке толстой и прямой кишки [13]. Все эти системы основаны на использовании лишенных метки флуоресцентных индикаторов, в то время как наши кремниевые НЧ имеют дополнительную функцию молекулярного нацеливания, что является еще одним доказательством клинической релевантности.

Целевая доставка препарата при метастатической нейробластоме

В последние годы были идентифицированы пептиды с уникальными функциями нацеливания для применения в лечении опухолей. Из них CPRECES [14] и CNGRC [15] (однобуквенный аминокислотный код) с высокой селективностью связываются с маркерами эндотелиальных/ периваскулярных опухолей аминопептидазами А (APA) и N (APN) соответственно, поэтому они оптимальны для применения в доставке препаратов in vivo через кровяное русло.

Эти два пептида использовали в первом исследовании, целью которого была доклиническая оценка осуществимости доставки нанопрепаратов направленного действия для доксорубицина на моделях нейробластомы первой стадии [16]. Для этого были получены синтетические версии обоих пептидов путем слияния человеческого фактора некроза опухолей с коротким линкером KY (однобуквенный аминокислотный код) и последующего присоединения к полиэтиленгликолевым стелс-липосомам, в состав которых входят дистеароилфосфатидилэтанол-аминполиэтиленгликоль, гидрогенизированный соевый фосфатидилхолин и холестерин. В такие стелс-липосомы (SL) был инкапсулирован доксорубицин (DXR) для получения наносистем направленного действия CPRECES-SL[DXR] и CNGRC-SL[DXR] соответственно, имеющих размеры 90–115 нм, инкапсуляцию препарата с выходом 95% и показатель связывания пептидов 4 мкг/мкмоль для каждой липосомы. Для проведения фармакокинетических исследований такие стелс-липосомы были снабжены двойной меткой путем встраивания 3H и 14C в холестерин и доксорубицин соответственно, что позволило продемонстрировать достаточную стабильность и продолжительное время циркуляции (до 24 ч) [16]. Оценку эффективности этих композиций, как в виде одиночных агентов, так и в составе комбинированных препаратов (COMBO), провели на ортотопических моделях, полученных в результате имплантации человеческих клеток нейробластомы в левый надпочечник бестимусных мышей. Начиная с 21-го дня после имплантации опухолевых клеток, мышам раз в неделю в течение 5 недель вводили доксорубицин (свободный или инкапсулированный в липосомы) в дозировке 5 мг/кг; было показано, что введение CPRECES-SL[DXR], CNGRC-SL[DXR] или COMBO обеспечивало достоверное увеличение продолжительности жизни по сравнению с введением свободного препарата (до 17, 37 и 66 дней соответственно; рис. 3) [16].

Данная работа демонстрирует, что нацеливание препарата на микросреду опухоли повышает его эффективность и потому может быть использовано для разработки инновационных лекарственных препаратов.

На основании этих вдохновляющих результатов были проведены комбинированные in vitro/ex vivo скрининги пептидных библиотек, полученных методом фагового дисплея с целью идентификации новых пептидных мотивов, высокоспецифичных для человеческой нейробластомы [16]. Эти эксперименты были поставлены, чтобы изолировать пептиды, способные связывать первичную опухоль целиком (обнаружено 26 мотивов) или скопление метастазов (15 мотивов), микросреду первичной опухоли (57 мотивов) или микросреду метастазов (23 мотива). Специфичность пяти петидов, нацеленных на скопление метастазов (фаговый клон #14, пептидная последовательность KSFFLSH), микросреду первичной опухоли (#1, YEGLISR) и микросреду метастазов (#5, HSYWLRS; #8, WSWPREL; #10, ALAAHKL), была подтверждена ex vivo путем анализа связывания на срезах человеческой нейробластомы IV стадии и in vivo на модельных мышах. По этой причине пептиды синтезировали с присоединением N-концевого (YSHS, однобуквенный аминокислотный код) и C-концевого (GGG, однобуквенный аминокислотный код) доменов, связав их со стелс- липосомами, как было описано выше [16]. Потенциальную эффективность таких наносистем исследовали на ортотопической модели, полученной в результате имплантации трансдуцированных люциферазой клеток человеческой нейробластомы. Кроме того, в результате введения опухолевых клеток в хвостовую вену бестимусных мышей была получена псевдо-метастатическая модель. Мыши после ортотопической имплантации получали лечение раз в неделю в течение трех недель, начиная с 21-го дня после имплантации опухолевых клеток, а мыши после внутривенной имплантации получали лечение по той же схеме, но начиная с 4-го часа после имплантации опухолевых клеток. В первой серии экспериментов наблюдение за ростом ортотопических опухолей, экспрессирующих люциферазу, осуществляли методом биолюминесцентной визуализации на 26-й, 33-й и 40-й дни после имплантации (через 5 дней после каждого эпизода получения лечения). 5-SL[DXR] и 10-SL[DXR] наиболее эффективно задерживали рост опухоли, что подтвердили результаты рентгенологического исследования всего тела, проведенного через месяц после окончания лечения (рис. 4 A). Оценка способности препаратов направленного действия увеличивать продолжительность жизни мышей с опухолями была проведена последовательно на псевдо-метастатической (рис. 4Б) и ортотопической (рис. 4В) моделях. И снова лечение 5-SL[DXR] или 10-SL[DXR] продемонстрировало более высокую выживаемость мышей с нейробластомой по сравнению с контрольными животными и даже с животными, которых лечили доксорубицином, как свободным, так и инкапсулированным в липосомные препараты ненаправленного действия [16].

Эти предварительные выводы были дополнены результатами последовательного углубленного изучения пептида HSYWLRS (#5 из предыдущего исследования) как компонента направленного действия для доклинического применения [17]. Специфичность связывания и интернализации были подтверждены на дополнительных клеточных линиях, а также на образцах тканей модельных животных и человеческой нейробластомы IV стадии. Таким образом, снабженные пептидной меткой стелс-липосомы с инкапсулированным доксорубицином (HSWYLRS-SL[DXR]) были созданы и исследованы как наносистемы для доставки препаратов in vivo. Оценка проницаемости сосудов была проведена путем введения голубого Эванса мышам с нейробластомой, получившим лечение HSYWLRS-SL[DXR], и отслеживания специфического повышения экстравазации красителя и аккумулирования в ортотопических опухолях, но не в неопухолевых тканях (рис. 5A). Лечение с помощью HSYWLRS-SL[DXR] также способствовало увеличению перфузии кровеносных сосудов опухолей, что было обнаружено в результате внутривенного введения лектин-флуоресцеин-изотиоцианата (ФИТЦ) и анализа испускаемой флуоресценции методом конфокальной микроскопии (рис. 5Б). Эти явления сопровождались:
1) увеличением аккумулирования HSYWLRS-SL[DXR] опухолью, но не доксорубицина, инкапсулированного в липосомные препараты ненаправленного действия;
2) увеличением продолжительности жизни животных (рис. 5В) при отсутствии признаков токсического воздействия, например потери веса (рис. 5В, на вставке). Кроме того, терапевтическую эффективность HSYWLRS-SL[DXR] сравнили с терапевтической эффективностью свободного доксорубицина, пронаблюдав за ростом экспрессирующих люциферазу клеток человеческой нейробластомы после ортотопической имплантации in vivo методом биослойной интерферометрии, и обнаружили, что только липосомный препарат направленного действия вызывает эффективный противоопухолевый ответ (рис. 6A–Б) и продлевает жизнь мышам с опухолями (рис. 6В). Этот эффект был подтвержден с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) в сочетании с измерением поглощения глюкозы. Исследование показало, что лечение с помощью HSYWLRS-SL[DXR] существенно замедляет не только рост первичных опухолей, но и распространение вторичных опухолей (рис. 7A), что было подтверждено при аутопсии животных посредством определения количества метастатических очагов и общего объема метастазов (рис. 7В).
Все эти данные подтверждают, что нацеленный на нейробластому пептид HSYWLRS может стать мощным средством для терапевтического применения.

ВЫВОДЫ

Весьма актуальна проблема ранней диагностики опухолей и эффективного лечения, которое имело бы максимальный противоопухолевый эффект, но не затрагивало нормальные ткани. Появление нанопрепаратов может радикально изменить наш подход к визуализации и лечению рака при условии, что мы идентифицируем обладающие подходящими свойствами биомаркеры. В действительности, несмотря на то что разработка наноматериалов стремительно развивается, нам по-прежнему необходимы мишени с более высокой селективностью, чтобы сделать возможным применение ориентированных на пациента методов. В нашей недавней работе обнаружен ряд мишеней и компонентов направленного действия лекарств, которые были проверены доклинически и могут быть использованы для дальнейшей разработки клинических методов.