Окислительный стресс в тканях сопровождается чрезмерным образованием активных форм кислорода (АФК) и истощением эндогенных запасов антиоксидантов [1]. В ходе эндогенных метаболических реакций аэробные клетки продуцируют АФК, такие как супероксид-анион (•O₂^–), пероксид водорода (H₂O₂), гидроксильный радикал (•OH ) [2]. Одним из наиболее уязвимых мест в организме являются органы зрения [3]. Ткани глаза достаточно долго находятся под действием света, что приводит к постоянному фотоинициированию радикальных процессов, ведущих к повреждению клеток, к перекисному окислению липидов мембран, к окислительной модификации белков, окислительному повреждению ДНК [4]. С окислительным стрессом связано много глазных патологий: катаракта [5], увеит [6], ретинопатия [7], воспаление роговицы [8]. Все АФК являются окислителями клеточных компонентов и по большей части приводят к необратимым повреждениям клеток. Концентрация АФК в организме контролируется антиоксидантными ферментами (супероксиддисмутазой (СОД), каталазой) и низкомолекулярными антиоксидантами (витаминами А, С, Е, и т. д.) [9].

Получение информации об антиоксидантном профиле слезной и внутриглазной жидкостей, таким образом, представляется важной задачей. Основная проблема современных методов измерения уровня АФК в слезной жидкости в том, что они низкочувствительны, а измерение уровня АФК в большинстве случаев производится непрямыми методами [10]. Существуют также ограничения при необходимости получения объема слезной жидкости у лабораторных животных, поэтому большинство аналитических методов не подходит для решения данной проблемы [11, 12].

Таким образом, для изучения антиоксидантной составляющей слезной и внутриглазной жидкостей необходимы специальные высокоэффективные чувствительные методы, позволяющие определять уровень АФК в небольших объемах и в достаточно малых концентрациях, что важно для диагностики и профилактики глазных заболеваний [13].
Для определения антиоксидантной активности слезной жидкости чаще используют хемолюминесцентные и спектрофотометрические методы [14, 15], в которых с помощью модельных систем можно генерировать АФК и по ингибированию или торможению модельных реакций спектрофотометрически оценивать антиоксидантный уровень в образце. Недостатком таких систем, во-первых, является pH среды, отличающийся от физиологических условий, во-вторых, большинство методов измерения уровня АФК непрямые, что накладывает ряд ограничений и снижает достоверность полученных данных.

Активация свободнорадикальных процессов служит одной из причин новообразования сосудов при воспалительных процессах. Окислительный стресс, таким образом, является важным звеном в патогенезе воспалительных процессов. Основными причинами развития воспаления могут быть инфекции, системные аутоиммунные заболевания, травматические повреждения глаз, ожоги, гормональный дисбаланс и нарушение метаболизма [16, 17]. Так, воспаление сосудистой оболочки глаза, или увеит, часто затрагивает и другие структуры этого органа, приводя к различным проблемам со зрением [18]. Пусковым механизмом для развития нарушения является сенсибилизация тканей глаза инфекционным или иным антигеном с дальнейшим проникновением нейтрофилов к очагу патологического процесса. Нейтрофилы уничтожают микроорганизмы, вырабатывая АФК за счет НАДФ•Н-оксидазы. В условиях воспаления, независимо от этиологии заболевания, основными источниками АФК помимо нейтрофилов являются и макрофаги [19]. Поэтому для лечения воспалительных процессов наряду с противовоспалительными препаратами целесообразно применение антиоксидантов. Основная роль в развитии осложнений при воспалительных глазных процессах принадлежит активации реакций свободнорадикального окисления и накоплению АФК [3].

Перспективным подходом в данном случае представляется использование наночастиц в качестве систем доставки, так как они способны значительно увеличивать биодоступность лекарственного препарата [20]. Так, наночастицы СОД на основе блок-иономерных комплексов нетоксичны, неиммуногенны и биосовместимы. Антиоксидантные ферменты обладают наибольшей эффективностью по сравнению с низкомолекулярными антиоксидантами в связи с повторной многократной реакцией с субстратом. Основное преимущество наночастиц СОД в том, что они обладают большим временем циркуляции в тканях глаза по сравнению с нативным ферментом. В экспериментах in vivo было показано, что наночастицы СОД весьма эффективны при лечении иммуногенного увеита и химического ожога глаза [21].

Целью данной работы было определение АФК в слезной и внутриглазной жидкостях кроликов амперометрическим методом с использованием платинового наноэлектрода, а также исследование влияния наночастиц СОД на динамику концентрации АФК в слезной и внутриглазной жидкостях интактных кроликов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Наночастицы СОД получали по методике, описанной в работе [22]. Суть методики заключается в самопроизвольной послойной самосборке противоположно заряженных полиионов, приводящей к стехиометрическим комплексам со 100%-й эффективностью загрузки. Для этого к раствору СОД в 0,01 М фосфатном буфере PBS (pH = 7,4) (Ферментные технологии; Россия), преимущественно отрицательно заряженной в физиологических условиях, добавляли протамин (Sigma; США), положительно заряженный при pH = 7,4, далее добавляли отрицательно заряженный блок-сополимер полиэтиленгликоля и поли- L-глутаминовой кислоты (Alamanda Polymers; США), с последующей сшивкой с помощью глутарового альдегида (Sigma; США).

Объектами исследования были образцы слезной и внутриглазной жидкостей кроликов, предоставленные сотрудниками Института глазных болезней им. Гельмгольца. В эксперименте было задействовано 25 кроликов породы шиншилла массой 2,0–2,5 кг. Содержание и уход соответствовали «Санитарным правилам по содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденным МЗ СССР 6 июля 1973 г. и приказа МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977. Все процедуры по рутинному уходу за животными выполняли в соответствии с СОП лаборатории. Животных содержали при 18–26 °С в комнатах с 12-часовым циклом освещения, относительной влажностью 30–70%, 100% вентилированием без рециркуляции со сменой воздуха 7–12 объемов комнаты в час, по одному в клетках, укомплектованных поильниками и кормушками. Кролики получали «Комбикорм гранулированный для кроликов универсальный» (Провими-Волосово; Ленинградская обл.).

Лабораторные животные до начала исследования содержались 14 дней для адаптации. Во время этого периода у животных контролировали признаки отклонения от нормального состояния здоровья. Перед формированием групп проводился подробный осмотр. Каждому животному был присвоен индивидуальный номер. В экспериментальные группы случайным образом были отобраны животные без внешних отклонений.

В данном исследовании в качестве тест-системы использовали кроликов линии серая шиншилла. Ее представителей наиболее часто используют для фармакологических исследований действия лекарственных веществ на ткани глаза.
Выбор данного вида лабораторных животных обусловлен крупным размером глаз, обеспечивающим удобство оценки клинических проявлений заболевания, и возможностью отбора достаточного количества влаги передней камеры глаза.

Работа с экспериментальными животными проведена в соответствии с приказом министерства Здравоохранения № 755 от 12 августа 1977. и положениями Хельсинской декларации. Все процедуры с животными одобрены локальным этическим комитетом ФГБУ МНИИ ГБ им. Гельмгольца Минздрава России.
Всем кроликам одновременно закапывали по 30 мкл раствора наночастиц (2 мг/мл) в один глаз, другой глаз — контроль. Далее с промежутками 10, 30, 60, 120 мин отбирали слезную и внутриглазную жидкости.
Образцы слезной жидкости были получены с помощью нескольких кружков фильтровальной бумаги диаметром 5 мм. Кружки помещали в нижний свод конъюнктивального мешка на 5 мин, затем вынимали и помещали в 300 мкл раствора PBS на 20 мин. Элюат центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об./мин на центрифуге (Labsystems; Финляндия) и надосадочную жидкость использовали непосредственно для измерений.

Забор внутриглазной жидкости осуществляли путем прокола роговицы в районе лимба (парацентез). После осуществления забора животному проводили эвтаназию с помощью воздушной эмболии.

Определение уровня АФК осуществляли амперометрическим методом. Для этого в образцах биологических жидкостей использовали углеродные наноэлектроды, покрытые платиной, и хлорсеребряный электрод сравнения.

Регистрацию разности потенциалов между платиновым микроэлектродом и электродом сравнения осуществляли patch-clamp усилителем Model 2400 (A-M Systems; США). Передачу и запись измерений на компьютер проводили с помощью АЦП–ЦАП преобразователя USB-6211 (National instruments; США) и программы WinWCP. Для подведения наносенсора использовали микроманипулятор PatchStar (Scientifica; Великобритания). Все манипуляции проводили на столике инвертированного микроскопа (Nikon; Япония).

Концентрацию АФК, а именно концентрацию Н₂О₂, оценивали при потенциале +800 мВ относительно хлорсеребряного электрода [23]. При данных условиях протекает реакция 2Н₂О₂ ↔ 2Н₂О + О₂, которая катализируется платиной; поскольку супероксид-радикал довольно быстро превращается в растворе в пероксид водорода, то суммарная концентрация Н₂О₂ определяет общий фон окислительных процессов [24]. Уровень кислорода оценивали при потенциале –800 мВ.

Для изготовления платиновых электродов использовали кварцевые заготовки с внутренним и внешним диаметрами 0,9 мм и 1,2 мм соответственно (рис. 1). Заготовки вытягивали на лазерном пуллере (Sutter; США), в результате чего получали два нанокапилляра с диаметром отверстия 100–500 нм. На полученные нанокапилляры осаждали пиролитический углерод посредством термического разложения бутана в бескислородной среде.

Нанокапилляр заполняли бутаном через резиновую трубку, плотно прилегающую к широкому концу кварцевого нанокапилляра. Затем острый конец нанокапилляра вводили в аналогичную кварцевую заготовку соответствующего размера. Через эту заготовку осуществляли подачу ламинарного потока аргона. Далее поступательным движением от острого конца нанокапилляра производили термическую обработку с помощью бутан-пропановой горелки на расстояние 1 см в течение 15 с.

Мы использовали электрохимический метод создания полостей в углеродных наноэлектродах с последующим осаждением платины [25–27]. В растворе, содержащем 0,1 мМ NaOH и 10 мМ KCl, осуществляли травление электрода. Наноэлектрод и электрод сравнения погружали в раствор; на электрод сравнения подавали переменное напряжение симметричной V-образной формы с амплитудой 1,5–2 В. Возрастание амплитуды регистрируемого сигнала свидетельствовало об увеличении тока, протекающего через наноэлектрод, и, соответственно, увеличении площади поверхности углерода в кончике кварцевой трубки. В момент достижения достаточной амплитуды сигнала травление останавливали.

После протравливания в растворе 0.1 М KCl /10 мМ NaOH обработанные заготовки переносили в 2 мМ раствор гексахлорплатиновой кислоты (H₂PtCl₆) для дальнейшего электрохимического осаждения платины на кончике капилляра, подавали на электрод сравнения потенциал симметричной пилообразной формы с амплитудой 0,8 В. Различия циклических вольтамперограмм наноэлектрода в ферроценметаноле в области отрицательных потенциалов до и после осаждения платины свидетельствуют об успешном осаждении платины на электрод (рис. 2А).
Полученные вольт-амперные характеристики были обработаны с помощью программы OriginPro 8 (OriginLab; 2018). Были получены средние значения тока при +800 мВ (пропорционален концентрации Н₂О₂) относительно уровня тока при нулевом потенциале.
С использованием платинового электрода производили измерения уровня Н₂О₂ в полученных образцах слезной и внутриглазной жидкостей, погружая электрод и электрод сравнения в емкость с образцом. Фотография наноэлектродов представлена на рис. 2Б

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Перед измерениями каждый платиновый электрод калибровали с использованием ряда стандартных растворов Н₂О₂, строили калибровочную кривую, по которой определяли уровень Н₂О₂ в образцах (рис. 2В).
Согласно калибровке, чем выше значение тока, тем больше концентрация Н₂О₂ в образце. В левый глаз производили закапывание наночастиц СОД, в правый глаз в качестве контроля закапывали 0,01 М буфер PBS (pH = 7,4).

Данные представлены для каждого кролика для 5 интервалов времени: до закапывания (контроль) и спустя 10, 30, 60 и 120 мин после последнего закапывания. Наблюдается некоторая вариативность в пределах одной временной группы в виду индивидуальных особенностей каждого подопытного кролика. Для всех животных характерно уменьшение уровня Н₂О₂ с увеличением интервала времени, прошедшего после закапывания наночастиц.

Для визуализации динамики во времени ввиду значительной вариабельности параметров среди подопытных животных для каждого кролика были рассчитаны разностные значения уровня Н₂О₂ для образцов слезной жидкости из глаза, в который закапывали наночастицы, по отношению к глазу, в который закапывали буфер. Полученные данные были усреднены и представлены для 5 кроликов в виде средних значений со стандартными ошибками (рис. 3). Показатели свидетельствует о том, что в первые 30 мин после окончания введения лекарства наблюдается увеличение уровня Н₂О₂ в глазу, в который закапывали наночастицы, по отношению к глазу, в который закапывали PBS. Затем уровень АФК в обоих глазах становится примерно одинаковым.

Далее были измерены ионные токи для образцов внутриглазной жидкости. В левый глаз производили закапывание наночастиц СОД, в правый глаз в качестве контроля закапывали 0,01 М буфер PBS (pH = 7,4). После закапывания препарата наблюдали повышение уровня Н₂О₂ во внутриглазной жидкости подопытных животных. С течением времени после воздействия наночастиц значительно увеличивалась вариативность исследуемого параметра в пределах одной временной группы. Полученные разностные данные были усреднены и представлены для 5 кроликов в виде средних значений со стандартными ошибками (рис. 4). Спустя 10 мин после окончания введения лекарства каких-либо достоверных отличий с контролем не наблюдали, однако через 30 мин начиналось увеличение уровня Н₂О₂ в глазу, в который закапывали наночастицы, по отношению к глазу, в который закапывали PBS.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Увеличение Н₂О₂ в образцах слезной и внутриглазной жидкостей обусловлено действием СОД, катализирующей реакцию
2O₂^– + 2H₃O+ ↔ O₂ + Н₂О₂ + 2H₂O.
Увеличение уровня Н₂О₂ через 10 и 30 мин после начала закапывания и возвращение к исходному уровню спустя 1ч в образцах слезной жидкости (куполообразный график) отличаются от динамики уровня АФК во внутриглазной жидкости, для которой характерен рост концентрации Н₂О₂ только через 30 мин после добавления лекарства. Проникновение СОД во внутриглазную жидкость затруднено, поэтому наблюдается латентный период, длящийся около 30 мин.
При увеличении концентрации СОД в слезной жидкости концентрация супероксид-радикалов значительно снижается, при этом увеличивается концентрация Н₂О₂ (рис. 3).
Максимальное увеличение концентрации Н₂О₂ возникает через 30 мин, что свидетельствует о сдвиге равновесия реакции дисмутации супероксид-радикала в сторону образования Н₂О₂. Концентрация Н₂О₂ через 1 ч возвращается к исходному уровню вследствие двух совместных процессов, протекающих в слезной жидкости: во-первых, концентрация наночастиц СОД спустя 1 ч значительно сокращается из-за вымывания с поверхности глаза, и снижается скорость образования Н₂О₂; во-вторых, под воздействием антиоксидантной системы, присутствующей в слезной жидкости, протекают процессы разложения Н₂О₂ до воды и кислорода.
Стоит отметить еще раз, что время жизни супероксид-радикалов из-за их реакционной способности достаточно мало и составляет около 10^–6 с. Будучи нуклеофильным соединением, O₂^– способен окислять липопротеины и фосфолипиды мембран, что приводит к разрушению клеток [28]. Помимо дисмутации супероксид-радикала с образованием Н₂О₂, супероксид-радикал участвует в реакции Габера–Вайсса
(O₂^– + H₂O₂ ↔ OH– + OH• + ¹O₂). Поэтому сразу после отбора слезной жидкости генерация супероксид-радикалов в образце невозможна, поэтому все измерения основаны на изменении концентрации относительно устойчивой в физиологических условиях Н₂О₂.
В слезной жидкости достаточная концентрация препарата достигается сразу после закапывания, а во внутриглазную наночастицы поступают с задержкой, поэтому увеличение концентрации Н₂О₂ тоже происходит с небольшой задержкой.

Влияние местного применения обычных лекарств сильно затруднено защитными физиологическими барьерами глаза, которые эффективно уменьшают концентрацию препарата в месте введения [29]. Стабильность фермента, поглощенного клетками в форме наночастиц, значительно возрастает, по-видимому, из-за стабилизации молекулы фермента против метаболической деградации и / или лизосомного разрушения, благодаря чему увеличивается время циркуляции в области глазных тканей, по сравнению с нативным ферментом [30].
В дальнейшем существует возможность измерения уровня Н₂О₂ непосредственно в глазных тканях с помощью наноэлектродов. Поскольку наноэлектроды имеют очень малый размер (100–500 нм), с их помощью можно проникнуть как в изолированные клетки, так и в область глазных тканей для измерения в режиме реального времени.

ВЫВОДЫ

Исследования с помощью платинового наноэлектрода могут иметь диагностическое значение в оценке протекания глазных патологий, связанных с воспалительными процессами. Оценка уровня Н₂О₂ предложенным способом позволяет обоснованно применять антиоксидантные препараты в лечении воспалений глаза. Технология проста и достаточно чувствительна, а эффективность по стоимости делает ее очень перспективной для биомедицинского применения. В работе показано, как производить чувствительные платиновые наноэлектроды, которые могут быть использованы для определения АФК в биологических жидкостях. Мы пришли к выводу, что этот прямой метод более чувствителен и является перспективным в биологических прикладных исследованиях.