Ретинобластома (РБ) человека очень чувствительна к некоторым парамагнитным изотопам металлов, индуцирующих магнитные изотопные эффекты, которые ингибируют репарацию ДНК в злокачественных клетках и способствуют образованию укороченных фрагментов ДНК, непригодных для репарации дефектов нуклеосомной ДНК [1–4]. Это свидетельствует в пользу перспективности нового подхода в химиотерапии РБ, основанного на применении наночастиц (НЧ), высвобождающих ²⁵Mg²⁺, ⁴³Ca²⁺, ⁶⁰Co²⁺, ⁶⁷Zn²⁺, на фоне гиперэкспрессии репарационных ДНК-полимераз β [1, 5, 6].
Комплексы парамагнитных изотопов с PMC16 (рис. 1) — специфический тип амфифильных низкотоксичных НЧ — были разработаны в качестве транспортеров ионов, применяемых как в таргетной противоопухолевой терапии, так и для последующего контролируемого высвобождения препарата в клетках [1, 5]. Влияние этих парамагнетиков проявляется в значительном снижении скорости пролиферации, что показано в экспериментах на клеточных линиях РБ Y79 и WERI-RB-1 [2–4].
Согласно статистике PubMed, количество публикаций, посвященных использованию НЧ для пассивной адресной доставки лекарств, увеличилось за последние 15 лет с 40 (2000 г.) до почти 1800 (2015 г.), причем НЧ рассматриваются только в контексте терапии солидных опухолей [7]. Предполагается, что в ходе доклинических испытаний будет показана возможность использования PMC16 в отношении РБ. Однако ряд эпигенетических факторов, характерных для данного типа опухоли, не позволяет a priori судить о селективном поглощении таких НЧ [8–10].
Таким образом, надежный метод прогнозирования объемов селективного накопления НЧ (РМС16) в РБ может быть полезен для исследований, в которых изучается возможность применения данного препарата в борьбе с этим видом онкологических заболеваний.

Целью данной работы было предпринять попытку разработать такой метод с использованием инструментов математического моделирования.
Следует отметить, что математический подход к разработке сценария доклинических и клинических испытаний новых лекарств уже практиковали в экспериментальной онкологии и близких к ней областях [11–17].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для моделирования использовали конвенциональные значения объемов распределения НЧ в клетках и параметры их митотических циклов для нормальной и РБ- измененной тканей сетчатки глаза (таблица) [8, 9, 15, 18]. Эти данные обрабатывали с помощью алгоритма Sigma QXL600 в анализаторах HP9107 (Hewlett-Packard, Inc; США) и Olivetti Riccetta SL110 (Ing. C. Olivetti & Co.; Италия). Использовали модифицированный метод вероятностной аппроксимации Пенмана–Дальбрё [14, 16], позволяющий синхронно процессировать решения составленных на основе данных эксперимента и литературных данных модифицированных систем уравнений немарковской популяционной динамики [12, 14] и рутинной системы уравнений Гомперца [11].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Цитотоксичное действие препаратов на здоровые ткани, резистентность к ним опухолевых клеток и опухоль-селективное накопление лекарств — критически важные проблемы, возникающие при химиотерапии [5, 6, 8]. Методы математического моделирования могут помочь в выборе и анализе возможных путей, применимых для решения этих проблем [7, 14, 17, 18]. В некоторых случаях такой подход помогает прогнозировать уровень чувствительности к фазоспецифичным средствам (НЧ) с учетом их невекторального, «пассивного», распределения в клеточном пуле, состоящем из клеток, делящихся с разными скоростями и характеризующихся разными величинами продолжительности интерфаз их митозов.

Немарковская популяционная динамика

Динамику популяций с разными параметрами клеточных циклов, которые подвергаются воздействию лекарственных средств, можно моделировать следующим наиболее простым способом:

x ( t ) = λ x (t – τ)[1 – D( t )] ,

где x ( t ) — плотность популяции в заданный момент времени t, λ — скорость обновления клеток, τ — время генерации, D ( t ) — фактор влияния среды, т. е. D ( t ) > 0 — достижение эффективной концентрации препарата в системе. Согласно этой модели, время элиминации популяции злокачественных клеток (T_m) и сопредельной поддерживающей популяции (незлокачественных) клеток (T_h), при коэффициенте элиминации Z, отражающем эффективность лечения:

Z = 1 – T_m/T_h .

Эффективность лечения является немонотонной функцией отношения между временем генерации клеток и длительностью курса лекарственной терапии при достижении максимума в момент, когда продолжительность генеративного цикла ограничивающих клеток кратна продолжительности химиотерапии. Дальнейший анализ показывает, что в полностью периодических системах при условии, что τ > δ > τ/2, время элиминации T должно быть:

T = τω/|τ – (δ + ω)| .

Здесь δ — продолжительность периода, в течение которого лекарство производит ожидаемый эффект, а ω — период, в рамках которого дозировка препарата не позволяет ему оказывать воздействие. τ = δ + ω — точка, в которой значение T бесконечно.

Исходя из этого можно предположить, что классическая немарковская модель популяционной динамики [12, 14] позволяет моделировать распределение НЧ (PMC16) между злокачественной (быстрорастущей) и здоровой (медленнорастущей) частями клеточного пула. Упоминавшийся ранее амфифильный фармакофор (PMC16, транспортер изотопов бивалентных металлов на основе циклогексил-порфина-C₆₀; рис. 1) является подходящим объектом для немарковской модели: ранее была показана способность НЧ этого типа индуцировать цитостатический эффект в клетках острого миелобластного лейкоза и РБ [1, 5, 6].

Предложенная нами двухрезервуарная (бикомпартментная) модель вполне соответствует представленным ниже фармакокинетическим параметрам (применимы в немарковской модели); межвидовые и рандомизированные влияния на CL, V, Q и V2 скорректированы с учетом остаточной ошибки [12, 13, 16]. Эта модель позволяет прогнозировать как селективное поглощение PMC16 клетками опухоли, обусловленное их быстрой пролиферацией, так и обычные фармакокинетические параметры.

Межвидовые ковариантные модели

А. Фармакокинетическая модель

форм. 1

Б. Невекторная ковариантная модель

CL_j = [θ₃ • OCC1 + θ₄(WT – 75)] • exp (η_CLj)

V_cj = [θ₁ – (GFR – 80) • θ₂] • exp (η_Vj)

k_12j = (θ₅) • exp (ηk_12j)

В. Модель популяционной динамики

форм. 2

Г. Популяционные параметры

θ₁ = 19,5

θ₂ = 0,198

Гомперцианская модель

Модели, основанные на функции Гомперца, использовали для описания динамики роста раковых опухолей [7, 11, 14], а также в целях оптимизации стратегий лечения, включающих в себя антиангиогенную [11, 12] и лучевую терапию [11, 13].

Модель является детерминистической. Длительности фаз клеточного цикла τ_φ дискретизированы в нескольких элементарных возрастных интервалах α ∈ {1,…, N_ϕ }, где N_ϕ — целое число, такое как τ_ϕ = dt • N_ϕ. Здесь dt — временной шаг модели клеточного цикла. Плотность клеток n_α,ϕ возраста α в фазе ϕ определяется по формуле:

форм. 3

В этом уравнении ϕ ∈ {G₁, S, G₂ M, G₀, апоптоз}, а α ∈ {1,…, N_ϕ}. P_α,ϕ — время роста плотности клеток в фазе ϕ возраста α, следуют из общей модели клеточного цикла. Здесь внутриклеточные и внеклеточные условия были определены для клеток в конце фазы G₁.

Далее, принимая во внимания, что Σ_α,ϕ n_α,ϕ постоянны, мы получаем описание поля давления:

форм. 4

Компьютерная обработка начинается с учета изначального распределения соседствующих клеток РБ и ТР (ткань ретины/нормальной ткани) в каждом состоянии {α, ϕ}. Расчеты выполнены с применением метода разделения функций. Модель клеточного цикла для одного временного шага dt, дает новые значения n_α,ϕ. Уровень P_α,ϕ определяется в результирующей системе:

форм. 5

Показателен вариант ее преобразования после применения к ключевым параметрам митотических циклов (см. таблица), представленных в рамках немарковской модели популяционной динамики, отражающей череду возобновляемых состояний, биологически определенных как фазы (G₁, S, G₂ и M):

форм. 6

Здесь начальные условия — (n_i (t = 0))_1≤i≤I .

Скорости гибели клеток в фазах обозначены как d_ϕ; скорость же перехода между фазами принимается как периодически воспроизводимая. K_i→i+1. Фаза i (1 ≤ i ≤ I) может быть одной из классических четырех (G₁, S, G₂ или M); также она может представлять собой аггрегированную фазу, например S-G₂, или фазу пролиферации G₁-S-G₂-M. С другой стороны, n_i (t, x) может быть «субфазой», например до или после ограничения в фазе G₁. Уравнение описывает «эволюцию» значений плотности клеток n_ϕ (t, x), имеющих возраст x во время t в фазе i.

Системы, представленные выше, описывают две соседние клеточные популяции — быстрорастущую и медленнорастущую; физически они изолированы друг от друга, но являются «соседствующими». Поэтому в данной системе уравнений предполагается введение показателя эффективности противоопухолевого препарата (g) и функции цитотоксичности (ʄ ):

форм. 7

где λ, ν, ɛ_D, α, B_max, H, φ_B, ϒ_B, D₅₀ — положительные константы, определенные на кривых динамики увеличения массы опухоли, взятые из литературных данных [8, 15, 18] или вычисленные иными способами.

Разница в реакциях этих двух популяций клеток (пара РБ–ТР) на препарат выражается как φ_A – φ_B = 13 ч.

Возвращаясь к исходным положениям Гомперца, видим, что затухающая гармоническая аппроксимация отражает динамику популяции здоровых клеток (ТР):

форм. 8

где

форм. 9

а λ, μ, ɛC, α, β, ϒ, Z_eq, F, φ_A, ϒ_A, C₅₀ — положительные константы, определенные из кривых динамики увеличения массы опухоли [7, 10, 15].

Эти уравнения отражают диффузию и выведение лекарства согласно кинетике первого порядка (P и C) для однократного внутривенного введения препарата. Здесь мгновенная доставка лекарства i (t) и Ф (функция «открыто/ закрыто») соответствуют условиям гомеостаза здоровых тканей в линейной системе, устойчиво сфокусированной на Z_eq, A_eq = β^-1 (ϒ – αZ_eq). Вмешательство цитотоксичного препарата увеличивает значение коэффициента саморегуляции α.

Таким образом, наша модель, выведенная из ряда уравнений Гомперца, вполне подходит для прогнозирования динамики популяций опухолевых клеток:

форм. 10

Этот подход — не что иное как способ представить изменения в составе клеточной популяции, прибегая к простому линейному аппроксимированию, обычно исключающему ответные реакции на введение эффектора (лекарства), если оно не приводит к увеличению объема «резервуара» клеток, т. е. массы опухоли:

форм. 11

Акцентируя внимание на перспективах практического применения этой модели, следует указать на связь между цитостатическим эффектом и удельным объемом накопления препарата, выражающуюся в прерывании процесса пролиферации (плотность p(t, x)) в момент, соответствующий уровню клеточной популяции Q(t) при наличии мишени для действия препарата ʄ; для скорости прекращения митоза Q, где ʄ обладает высокой аффинностью к цитостатику.

ОБСУЖДЕНИЕ

Селективное поглощение НЧ клетками опухоли. Вероятность и прогноз

Итак, вероятностный прогноз объемов селективного поглощения НЧ клетками РБ преимущественно зависит от соотношения скоростей пролиферации злокачественных и здоровых клеток, тогда как величиной массы злокачественной ткани per se (количеством клеток РБ) можно практически пренебречь (рис. 2). Это следует из предсказуемого ответа клеток на быструю диффузию PMC16 in situ в момент появления нанопереносчиков Me²⁺ на границе раздела РБ/ТР. Однако в этом стохастическом сценарии «содружество» клеток лишь частично отражает энергетический ландшафт клеток-мишеней [16, 19], что делает вероятность захвата клетками наночастиц зависимой от подвижности энергетического ландшафта и, следовательно, от скорости увеличения объема наиболее быстрорастущей компоненты в паре РБ/ТР (рис. 3).

Изменение цветности от синего к красному на рис. 2 и рис. 3 отражает тенденцию к преимущественному накоплению НЧ в наиболее быстрорастущем «резервуаре» в составе пары РБ/ТР.
Возвращаясь к вероятностному подходу [12, 14], можно сказать, что селективное накопление препарата с PMC16 в опухоли становится предсказуемым ввиду огромной разницы в скоростях увеличения тканевой массы РБ и ТР [8–10, 12]. Таким образом, прогнозируемое в нашей модели (рис. 2) поглощение PMC16, зависящее от скорости пролиферации, описывается уравнением:

A_C = Kd[tgα_RB/(tgα_RB – tgα_RT)] ,

где Kd — постоянная аппроксимации Арно–Пито [16, 19].

«Волшебная пуля» Пауля Эрлиха: мечта или кошмар?

В 1908–1913 гг. Пауль Эрлих предложил концепцию «волшебной пули» [8, 17], которая ознаменовала закат Вирховианской теории общей патологии. Сегодня эта концепция принята в контексте разработки средств адресной доставки лекарственных препаратов [5, 7, 19]. Такие средства подразумевают использование наноструктур (частиц, контейнеров), т. е. разнообразных «волшебных пуль», которые не только доставляют препараты в клетки-мишени, но и обеспечивают затем их программируемое высвобождение в них [1, 5, 17].

Однако «стрелок», вооруженный «волшебными пулями», не видит полной картины. Так, к границе опухоли может быть доставлено достаточное количество молекул или ионов лекарства, что означает хороший выстрел, но теперь его результат во многом зависит от селективности поглощения этих молекул/ионов опухолевыми клетками. Таким образом, решающее значение имеет не столько точность траектории «полета» пули, сколько последующее распределение НЧ между соседствующими «резервуарами» злокачественных и здоровых клеток. Поэтому предложенная нами прогностическая модель может стать полезным инструментом для оптимизации алгоритмов доклинических и клинических исследований НЧ типа PMC16.

При введении препарата через шлеммов канал и/или интраокулярно (пути, часто используемые в терапии РБ [8]) такой подход не только возможен, но и предпочтителен. Побочные эффекты, которые обычно возникают при парентеральном введении лекарств, можно не учитывать, когда приоритетом является химиотерапия РБ.

ВЫВОДЫ

Предложенная математическая модель позволяет прогнозировать объем селективного накопления лекарственных катионообменных НЧ в клетках ретинобластомы человека, если эти НЧ являются амфифильными и мембранотропными и обладают способностью проникать в клетку-мишень. Этим критериям полностью соответствуют представители семейства PMC16, созданные на основе порфириновых производных фуллерена C₆₀, способные переносить и высвобождать катионы двухвалентных металлов. Модель, учитывающая различия в скоростях пролиферации здоровых и злокачественных клеток, может эффективно применяться для разработки и оптимизации программ доклинических исследований PMC16 и подобных им фармакофоров.