В течение многих столетий туберкулез входит в число самых сложных в терапии инфекционных заболеваний с высокой летальностью. Сейчас лекарственно устойчивые (ЛУ) изоляты M. tuberculosis представляют собой угрозу для здравоохранения: затрудняют консервативное лечение, приводят к инвалидизации пациентов, при этом наблюдается рост и распространение ЛУ-штаммов среди здорового населения. Это обусловливает необходимость разработки эффективных и, по возможности, простых методов выявления лекарственной резистентности микобактерий. Одним из широко используемых противотуберкулезных препаратов первого ряда при лечении туберкулеза является рифампицин. Резистентность к нему часто рассматривают как суррогатный маркер множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) микобактерий туберкулезного комплекса (МТБ) [1]. Рифампицин был введен в лечебную практику фтизиатров в 1972 г. Он высокоэффективен против МТБ, минимальная ингибиторная концентрация (MIC) рифампицина составляет 0,1–0,2 мкг/мл [2]. В сочетании с изониазидом и пиразинамидом рифампицин лежит в основе химиотерапии туберкулезной инфекции.

Клеточной мишенью рифампицина служит фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза, исключительно консервативный среди бактерий и архей. Подавляющее большинство мутаций, обусловливающих устойчивость к рифампицину, локализуется в трех регионах гена rpoB, кодирующего бета-субъединицу РНК-полимеразы: кластере I (кодирует 512–534 позиции аминокислот), кластере II (563–574) и кластере III (687). В 95% случаев мутации затрагивают кластер I или так называемый регион, детерминирующий резистентность к рифампицину (RRDR) размером 81 п.н. Этот регион соответствует кодонам 426–452 у МТБ и 507–533 у Escherichia coli. Традиционно обозначаемые по номенклатуре E. coli мутации в кодонах 521, 526, 531 и 533 (позиции 440, 445, 450 и 452 в гене rpoB МТБ) наиболее часто встречаются у устойчивых к рифампицину микобактерий туберкулеза [3].

Аминокислотные замены в положении 526 и 531 ведут к резистентности к высоким дозам рифампицина. Аминокислотная замена Ser450Leu (S450L, номенклатура гена МТБ, которая в дальнейшем будет использована в настоящей статье) доминирует среди всех других замен, определяя резистентность у 30–70% устойчивых к рифампицину (RIFR) изолятов (с медианой около 60%) [3]. Это делает мутацию S450L (TCG/TTG) наиболее значимым кандидатом для валидации самых разнообразных методов генетического скрининга с целью выявления резистентности МТБ к рифампицину [4, 5].
Сегодня наиболее часто используемым методом выявления генетических мутаций является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод прост в исполнении и достаточно надежен. Модификации ПЦР с использованием мониторирования специфичных ампликонов путем детекции накопления флуоресцентного сигнала (ПЦР в реальном времени) делают анализ гомогенным и позволяют избежать дополнительных манипуляций с ампликоном вне пробирки. Однако ПЦР выполняют с помощью достаточно сложных и дорогостоящих приборов. Это послужило причиной для разработки альтернативных методов амплификации нуклеиновых кислот, в первую очередь осуществимых в изотермических условиях [6].

В 2000 г. была разработана технология изотермической петлевой амплификации (loop-mediated isothermal amplification, LAMP). Первоначально метод предполагал использование двух пар праймеров (внешней и внутренней) и ДНК-полимеразы с цепь-вытесняющей активностью [7]. Позднее разработчиками была введена дополнительная пара праймеров для улучшения кинетики амплификации.
LAMP по специфичности и чувствительности (предел чувствительности до нескольких молекул ДНК) сравнима с ПЦР, а в некоторых случаях превосходит ее. Отмечена также повышенная устойчивость LAMP к действию ингибиторов ПЦР [8]. Для детекции результатов LAMP можно использовать подходы, основанные на разных принципах. В первую очередь это измерение оптической плотности за счет образующегося при синтезе ДНК пирофосфата магния [9], или флуоресценции при введении интеркалирующих красителей [9], модификации праймеров [10] или введения флуоресцентно-меченных зондов [11], а также колориметрическая детекция металл- чувствительными красителями за счет связывания ионов магния пирофосфатом [12].

К настоящему времени проведено значительное количество исследований, посвященных разработке тест- систем для выявления МТБ с иcпользованием LAMP [13]. Коммерческий набор Loopamp MTBC Detection Kit (Eiken Chemical Company Ltd; Япония), основанный на LAMP, был отмечен ВОЗ как возможная замена микроскопических исследований для диагностики туберкулеза [14]. Он был рекомендован также как дополнительный к микроскопии тест при диагностике взрослых с клиническими симптомами туберкулеза, в том числе для диагностики негативных по результатам микроскопии пациентов. Однако применение LAMP для выявления мутаций МТБ, вызывающих лекарственную резистентность, до настоящего времени описано не было.
Целью нашей работы было разработать метод выявления мутации TCG/TTG (S450L) в гене rpoB Mycobacterium tuberculosis для детекции устойчивости к рифампицину без применения дорогостоящего оборудования, а также провести оценку эффективности двух типов дизайна построения аллель-специфичной изотермической петлевой амплификации (AS-LAMP) и определить аналитические характеристики оптимальной системы на представительной выборке ДНК изолятов МТБ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клинические изоляты

Клинические изоляты M. tuberculosis (48 изолятов), а также 11 образцов мокроты были выбраны случайным образом и получены в микробиологической лаборатории НИИТуб, г. Новосибирск от пациентов, проживающих в г. Новосибирске и Новосибирской области и проходивших обследование в 2009–2011 гг. Взятие и обработку мокроты осуществляли в соответствии с приказом № 109 МЗ РФ от 21 марта 2003 г. (ред. от 29 октября 2009 г.). Критерии включения пациентов в исследование: мужчины и женщины любого возраста; впервые выявленное заболевание; наличие устойчивости к рифампицину. Критерии исключения: не впервые выявленное заболевание; отсутствие устойчивости к рифампицину. Устойчивость к рифампицину (40 мкг/мл) определяли в соответствии с методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна–Йенсена. Устойчивость изолятов к рифампицину определяли в флюорометрической системе «BACTEC MGIT 960» (Becton-Dickinson; США). Грубые лизаты бактериальных клеток, а также ДНК из бактериальных колоний изолятов получали нагреванием в 300 мкл буфера, содержащего 10 мМ тетрабората натрия (pH 9.5) и 1% 2-метоксиэтанола, в течение 10 мин при 98 °С с последующим центрифугированием для осаждения клеточного дебриса.

Секвенирование гена rpoB

Для амплификации фрагмента rpoB гена размером 322 п.н. использовали праймеры rpoB1 5'-AACCGCCGCCTGCGTACGGT-3' и rpoB2 5'-GGCCGTAGTGCGACGGGTGCA-3'. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 65 мМ Трис-HCl (pH 8,9), 16 мМ (NH4)2SO4, 3 мМ MgCl2, 0,05% Tween-20, 0,2 мМ дНТФ, 1 ед. Taq-полимеразы (Fermentаs; Литва), 0,3 мкM вышеуказанных олигонуклеотидных праймеров и 1–10 нг геномной ДНК M. tuberculosis. Амплификацию проводили в амплификаторе PTC-200 (BioRad; США) по следующей программе: 96 °C — 3 мин, далее 35 циклов 95 °C — 10 с, 64 °C — 10 с и 72 °C — 20 с, с финальной элонгацией 72 °C — 3 мин. Присутствие продукта амплификации требуемого размера проверяли электрофорезом в 6% ПААГ с визуализацией фрагментов ДНК бромистым этидием при облучении ультрафиолетом. Последовательность продуктов ПЦР определяли в ЦКП «Геномика» ИХБФМ СО РАН с использованием реагентов для секвенирования Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies; США) и прибора для капиллярного электрофореза ABI 3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies; США) согласно инструкциям производителей. Мутации выявляли путем сравнения полученных нуклеотидных последовательностей с геном rpoB M. tuberculosis (H37Rv) с помощью программного обеспечения Unipro UGENE software 1.11.3 (Унипро; Россия).

Получение стандартных плазмидных образцов, несущих частые мутации

Фрагмент ДНК размером 505 п.н. получили с помощью амплификации с олигонуклеотидными праймерами cl-rpobU и cl-rpobR (табл. 1) в следующих условиях: реакционная смесь ПЦР объемом 50 мкл содержала буфер для Taqполимеразы (65 мМ ТрисНСl; рН 8,9; 16 мМ (NH₄)₂SO₄; 0,05% Tween-20; 3,5 мМ MgCl₂), 0,2 мМ дНТФ, 10 нг геномной ДНК Mycobacterium tuberculosis H37 Rv или ДНК изолята, с мутацией TCG/TTG (S450L) в гене rpoB, 1 е.а. Taq-полимеразы (Биосан; Россия). Амплификацию проводили в амплификаторе Терцик (ДНКтехнология; Россия) согласно следующей программе: 3 мин при 95 °С для начальной денатурации, далее 34 цикла: 10 с при 95 °С для денатурации, 10 с при 60 °С для гибридизации праймеров, 20 с при 72 °С для элонгации. Продукты амплификации гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Hind III и BamHI (Сибэнзим; Россия) и лигировали с вектором pBluescript II SK (+), гидролизованным теми же эндонуклеазами, в течение 8 ч со 100 ед. акт. Т4 ДНК-лигазы (Биосан; Россия). Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli штамма XL1Blue (Stratagene; США). У плазмидных клонов, отобранных по результатам рестрикционного анализа, для подтверждения структуры определяли нуклеотидную последовательность вставки секвенированием по методу Сенгера. Секвенирование выполняли на автоматическом секвенаторе ABI 3130XL GeneticAnalyzer (Applied Biosystems; США) с использованием набора BigDye 3.1 (ЦКП «Геномика», ИХБФМ СО РАН; Россия). Рекомбинантные плазмидные ДНК pRPOB-M и pRPOB-W выделяли из 50 мл ночной культуры в среде LB с помощью набора QIAGEN Plasmid Midi Kit (QIAGEN; Германия) согласно инструкции производителя.

Концентрацию полученных стандартных плазмидных ДНК определяли спектрофотометрически и флюорометрически с помощью набора Qubit™ BR (Invitrogen; США). Далее 2 мкг ДНК подвергали гидролизу эндонуклеазой рестрикции HindIII для линеаризации. Полученные линейные стандарты разводили до концентрации 105 и далее до 5 × 102 копий плазмидной ДНК на мкл в стерильном буфере, содержащем 10 мМ Tris HCl (pH 7,6) и ДНК фага лямбда 5 нг/мкл.
Концентрацию ДНК в полученных стандартах уточняли с использованием цифровой ПЦР на платформе QX100™ Droplet Digital™ PCR System (Bio-Rad; США) согласно инструкциям производителя. Для этого готовили 20 мкл ПЦР-смеси, содержащей исследуемую ДНК (около 103 копий на 20 мкл), 1× ПЦР-смесь (Bio-Rad; США), 300 нМ олигонуклеотидные праймеры Bla-U, Bla-R и 100 нМ TaqMan Bla-P зонд для амплификации гена бета- лактамазы (табл. 1). Для получения микрокапель 20 мкл приготовленной ПЦР-смеси и 70 мкл масла для генерации капель помещали в соответствующие лунки картриджа DG8. Затем 40 мкл полученных микрокапель переносили на 96-луночную ПЦР-плашку, запечатывали фольгой и помещали в амплификатор. Была использована следующая программа амплификации: 96 °С — 10 мин и далее 50 циклов 96 °С — 15 с, 60 °С — 40 с с финальным прогревом в течение 10 мин при 98 °С. После этого микрокапли подвергали считыванию с помощью прибора Droplet Reader, полученные данные обрабатывали в программе QuantaSoft (Bio-Rad; США).

Изотермическая петлевая амплификация

Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 1× реакционный буфер (pH 8,0) для Bst-полимеразы (New England Biolabs; США), по 0,2 мкМ внешних праймеров (F3/B3), 0,4 мкМ петлевых праймеров (LF/BF), 1,2 мкМ внутренних праймеров (FIP/BIP), последовательности которых представлены в табл. 1, ДНК-матрицу (1000 копий плазмид или 0,5–2 нг ДНК изолята МТБ на одну реакционную смесь), 2 е.а. Gss-полимеразы из Geobacillus sp. 777 [15]. В случае проведения LAMP в режиме реального времени добавляли интеркалирующий краситель SYTO-9 до концентрации 2 мкМ [16]. Реакцию проводили в амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad; США). Программа включала в себя следующие стадии: отжиг праймеров и элонгацию при температуре 60 °С в течение 80 мин с регистрацией сигнала флюоресценции раз в минуту на канале FAM; определение температуры плавления продуктов амплификации в диапазоне 75–95 °С после амплификации для анализа специфичности. Результаты изотермической амплификации оценивали по параметру Tt (time-to-threshold — времени до пересечения кривой накопления продукта амплификации порогового значения). Все реакции LAMP проводили в трех повторах, в таблице указаны средние значения и стандартные отклонения от них.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мы использовали две ранее описанные [17, 18] схемы дизайна аллель-специфичной изотермической петлевой амплификации (AS-LAMP) (рис. 1). По первой схеме выявление мутации или аллеля дикого типа осуществляют с помощью двух аллель-специфичных праймеров FIP. По второй схеме аллель-специфичную LAMP инициируют со специфичного для мутации праймера F3. На начальном этапе в качестве матрицы для отработки условий мы использовали плазмиды с клонированным фрагментом rpoB дикого типа и фрагментом, содержащим мутацию. Для оптимизации реакции матрицей для AS-LAMP служил pS450L-M или pS450L-W в концентрации 1000 копий на реакцию. Все реакции оптимизации проводили, отслеживая накопление продуктов изотермической амплификации в режиме реального времени с использованием интеркалирующего красителя SYTO9. В качестве основного параметра для оптимизации использовали индекс дискриминации мутации, который определяли как разность Tt для ДНК «дикого типа» и Tt для мутантной ДНК при использовании для амплификации набора праймеров, в состав которого входит аллель-специфичный праймер (AS-FIP или AS-F3).

В модельных экспериментах на плазмидных ДНК нами было показано, что применение схемы анализа с использованием аллель-специфичного праймера FIP по сравнению с F3 имеет лучший индекс дискриминации мутации: разница между амплификацией мутации и аллеля дикого типа составила 22 ± 2,4 против 13 ± 4,1 мин (рис. 2). Применение непараметрического U-критерия (критерий Манна–Уитни) показало, что полученные индексы дискриминации отличаются статистически значимо (p = 0,0011). При использовании 100 геном-эквивалентов ДНК истинно положительный сигнал (амплификация rpoB гена с мутацией при использовании соответствующего аллель- специфичного праймера) детектировался после 29,4 ± 3,4 мин.
Нами были также предприняты попытки улучшения индекса дискриминации мутации с помощью изменения концентрации бетаина, а также путем добавления диметилсульфоксида (ДМСО), который обладает способностью увеличивать специфичность стандартной ПЦР [19]. Оптимальная концентрация бетаина составила 0,75 М, добавление ДМСО не приводило к улучшению дискриминации и даже несколько увеличивало общее время реакции.

Положительный сигнал надежно визуализировали после добавления в реакцию SYBR Green I (в концентрации 1 : 1000 от коммерческого стока красителя), как при освещении дневным светом, так и при использовании трансиллюминатора с УФ-излучением (рис. 3). Для дальнейшей диагностической валидации для каждого тестируемого образца выполняли две реакции: одну AS-LAMP с праймером 531-FIP-M для выявления наличия мутации, другую с праймером 531-FIP-rpoB для определения наличия ДНК МТБ. Реакции выполняли или в термостате при 65 °С в течение 40 мин с визуализацией результата реакции с помощью SYBR Green I, или в режиме реального времени (см. «Материалы и методы»).
Используя разработанный метод, мы проанализировали выборку ДНК 20 RIFR изолятов МТБ, несущих мутацию Ser450Leu в гене rpoB, 10 RIFR изолятов, несущих другие мутации в гене rpoB (в частности, в кодонах His445 и Asp440), а также 18 RIFS изолятов без мутаций, подтвердив наличие мутаций с помощью секвенирования по Сенгеру (табл. 2). Все исследованные образцы были определены верно, чувствительность и специфичность LAMP для выявления мутации Ser450Leu в гене rpoB составили 100%.
Применение AS-LAMP на небольшой выборке из 11 образцов ДНК из мокроты пациентов с активным бактериовыделением показало полную конкордантность с результатами секвенирования по Сенгеру (4 образца с мутацией и 7 образцов без мутации).
Использование в качестве матрицы ДНК человека не продуцировало значимого сигнала.
Было показано, что анализ может выполняться на грубых лизатах бактериальных клеток. При этом суммарное время проведения анализа начиная с биологического образца может не превышать 1,5 ч, с учетом того, что получение грубых лизатов микобактерий занимает не более 15–30 мин.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В последние несколько лет было предложено несколько подходов к выявлению однонуклеотидных замен ДНК с помощью LAMP. Все они используют аллель-специфичную гибридизацию с продуктами амплификации [20, 21], аллель-специфичные праймеры [22, 23] также селективно блокирующие амплификацию исследуемых структурных вариантов олигонуклеотиды [24].
Аллель-специфичная полимеразная цепная реакция (АС-ПЦР) — один из наиболее широко используемых методов выявления мутаций ДНК [25]. Классический вариант АС-ПЦР предполагает использование двух аллель- специфичных праймеров, в которых 3′-концевой нуклеотид комплементарен полиморфному нуклеотиду, и третьего общего праймера. В основе метода лежит различие эффективности элонгации спаренного и неспаренного 3'-нуклеотида ДНК-полимеразой. В идеальных условиях (при полном ингибировании элонгации) это должно привести к отсутствию продукта амплификации в реакции с праймером к мутации на матрице ДНК дикого типа.

Для улучшения дискриминации продуктов с «мутантной» и «нормальной» ДНК широко используют введение дополнительных неспаренных нуклеотидов на 3'-конце праймера (в позиции -2, -3 или -4) для дальнейшей дестабилизации дуплекса с целью уменьшения эффективности элонгации ДНК-полимеразой. Мы предположили, что при элонгации аллель-специфичных праймеров цепь-вытесняющей ДНК-полимеразой можно использовать схожий принцип. Для дизайна аллель- специфичных праймеров мы выбрали подход, описанный в 2004 г. [26]. Его авторы предложили для увеличения дискриминации мутантного аллеля вводить второй неспаренный нуклеотид в позиции -2 аллель-специфичного праймера, а также простой набор правил выбора типа этого основания для достижения максимального эффекта. Используя данные рекомендации, мы синтезировали два принципиально разных набора AS-праймеров для изотермической петлевой амплификации: один из них соответствует FIP-праймеру, а другой — праймеру F3.
Оптимизация выявления мутации TCG/TTG (S450L) в гене rpoB Mycobacterium tuberculosis на плазмидных контрольных ДНК показала предпочтительность AS-FIP. При его использовании мы смогли правильно классифицировать все анализируемые образцы ДНК изолятов МТБ, в том числе как отрицательные по замене TCG/TTG (S450L) образцы ДНК с мутациями в кодонах 445 и 440, путем визуального анализа результатов изотермической амплификации в стандартном термостате, поддерживающем температуру 65 °С. AS-LAMP также оказался эффективным для выявления мутации Ser450Leu гена rpoB в ДНК из мокроты пациентов с известным статусом мутаций гена rpoB. Нам удалось правильно классифицировать 4 образца с мутацией Ser450Leu и 7 образцов без этой мутации. Предложенный нами подход показал высокую специфичность и чувствительность для выявления наиболее распространенной мутации МТБ, вызывающей резистентность к действию рифампицина. Тем не менее для значимого определения указанных выше параметров необходимо тестирование метода на выборке значительно большего объема.

Несмотря на то что подавляющее число работ, посвященных LAMP, отписывает качественное выявление присутствия инфекционного агента, указанный метод также имеет высокий потенциал для определения структурного полиморфизма анализируемой ДНК. Например, показана возможность определения изолятов семейства Beijing Mycobacterium tuberculosis с использованием в качестве мишеней региона RD207 и гена Rv0679c [27]. Наша работа вносит определенный вклад в развитие методов выявления точечных мутаций с помощью LAMP и также увеличивает исследовательский потенциал указанного метода.
К ограничениям и недостаткам предложенного в настоящей работе метода можно отнести необходимость дополнительной валидации способа экстракции ДНК и связанного с ним количества бактерий ввиду зависимости выбора оптимального времени проведения анализа, при котором позитивный сигнал мутация-специфической системы еще не определяется, от концентрации анализируемой микобактериальной ДНК.

ВЫВОДЫ

Мы продемонстрировали принципиальную возможность определения мутации TCG/TTG (S450L) в гене rpoB Mycobacterium tuberculosis методом аллель-специфичной изотермической петлевой амплификации с высокой надежностью без применения дорогостоящего оборудования. Суммарное время, необходимое для проведения тестирования клинического образца ДНК, может не превышать 1,5 ч.