Исследования последних лет изменили парадигму в отношении стерильности некоторых биотопов, в частности мочи и мочевого пузыря. В моче здоровых мужчин было установлено присутствие условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) родов Lactobacillus, Sneathia, Veillonella, Corynebacterium, Prevotella, Streptococcus и Ureaplasma [1]. Если результаты ранних исследований микробиоты урогенитального тракта (УГТ) здоровых мужчин указывают на наличие микроорганизмов исключительно в уретре и венечной борозде [2, 3, 4], то в настоящее время бактерии обнаружены и в верхних отделах УГТ клинически здоровых мужчин, в частности в ткани простаты [5].
Микробиота эякулята состоит из комплекса микроорганизмов, происходящих из разных отделов УГТ. У здоровых мужчин она представлена главным образом микроорганизмами уретры, но при наличии патологического процесса дополнительно отмечаются микроорганизмы из верхних отделов УГТ [2].
Сведения о микробном составе эякулята при патологических состояниях (например, бесплодии и простатите) представляют огромный интерес для практической медицины. Недавно были выявлены различия в составе микробиоты эякулята у пациентов с простатитом и у здоровых мужчин: у последних отмечали большее количество Lactobacillus iners, тогда как у пациентов с простатитом — повышенное общее количество микроорганизмов, в том числе представителей филума Proteobacteria, а также большее видовое разнообразие микробиоты [6].
С инфекциями УГТ связано 6–10% случаев мужского бесплодия [7]. Однако этиология большинства простатитов остается неясной, а отсутствие роста микроорганизмов при культуральном исследовании не позволяет подобрать адекватную схему терапии [8]. Обсуждается вопрос вклада отдельных УПМ в развитие воспалительных процессов УГТ. Отмечается, что при отсутствии облигатных патогенов такие УПМ как Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis могут являться триггером развития воспаления в этой области [7].
В последние десятилетия среди урогенитальных инфекций преобладают субклинические формы протекания заболеваний. В таких случаях диагноз устанавливают на основании лабораторных данных, отражающих интенсивность локального воспалительного ответа и состав микробиоты УГТ. Это обусловливает необходимость применения наиболее современных и информативных методов исследования, позволяющих получать точную информацию о микробном составе отделяемого УГТ.
На сегодняшний день для оценки микробиоты эякулята в клинической практике применяют несколько подходов. Наряду с культуральным исследованием в практику внедрен метод количественной ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) — тест Андрофлор. Он позволяет проводить количественную оценку сложных микробных сообществ, в образовании которых принимают участие разнообразные микроорганизмы, в том числе трудно культивируемые и некультивируемые. Однако рекомендовать ПЦР-РВ в качестве полноценной замены культурального метода для исследования микробиоты эякулята затруднительно ввиду отсутствия качественно проведенных сравнительных исследований.
Целью работы было провести сравнительный анализ результатов исследования микробиоты эякулята с использованием культурального метода и ПЦР-РВ (тест Андрофлор).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В период с января по май 2018 г. были отобраны образцы эякулята 86 мужчин, обратившихся в Медицинский центр «Гармония» (г. Екатеринбург) для решения репродуктивных проблем. Возраст пациентов составил 18–57 лет (средний возраст 34 ± 6,7 лет). Критерии включения в исследование: соблюдение полового воздержания в течение 3–5 суток до исследования для исключения возможной контаминации материала транзиторной микрофлорой (Lactobacillus spp.) партнерши. Критерии исключения из исследования: обнаружение облигатных патогенов (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis). Непосредственно перед сбором материала пациенту требовалось помочиться, полностью опорожняя мочевой пузырь. Сбор эякулята пациенты осуществляли путем мастурбации в стерильный контейнер объемом до 60 мл, избегая касания стенок и крышки контейнера руками. Транспортировку проб эякулята в лабораторию осуществляли в термоконтейнере в течение не более 4 ч с момента сбора образца. Культуральное исследование и ПЦР-РВ выполняли одновременно из одной пробы.

Культуральное исследование эякулята проводили в микробиологической лаборатории «Кволити Мед» (г. Екатеринбург). Для этого 1 мл эякулята разводили стерильным физиологическим раствором (1 : 1) и центрифугировали при 1500 об./мин в течение 15 мин. После удаления супернатанта по 10 мкл осадка высевали на 5 питательных сред (Bio-Rad; Франция): 5%-й кровяной агар, обогащенный сывороткой и дрожжевым экстрактом; шоколадный агар, приготовленный на основе кровяного агара; хромогенный агар UriSelect4; агар Сабуро; маннит-солевой агар. Посевы инкубировали при 37 °C в течение 24–48 ч в аэробных условиях и в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Идентификацию полученных колоний микроорганизмов производили методом время-пролетной матричноассоциированной лазерной десорбционной ионизационной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) на анализаторе Vitek MS (BioMerieux; Франция).

ПЦР-исследование проводили в лаборатории МЦ «Гармония» (г. Екатеринбург). Для проведения ПЦР-РВ 1 мл эякулята помещали в пробирку Эппендорф с 1 мл транспортной среды с муколитиком (ИнтерЛабСервис; Россия), встряхивали с помощью центрифуги «Фуга/ вортекс Микро-Спин FV-2400» (BioSan; Латвия) до полного перемешивания. Пробирку центрифугировали при 13 000 об./мин в течение 10 мин. После удаления надосадочной жидкости 50 мкл осадка использовали для последующего выделения ДНК с помощью комплекта реагентов ПРОБА-ГС (ДНК-Технология; Россия) согласно инструкции производителя; амплификацию ДНК целевых групп УПМ проводили с помощью набора реагентов «Андрофлор» (ДНК-Технология; Россия) в детектирующем амплификаторе ДТ-96 согласно инструкции производителя (ДНК-Технология; Россия) [9]. После реакции амплификации по показателю индикаторного цикла с помощью специального программного обеспечения (ДНК-Технология; Россия) проводили автоматический расчет количества общей бактериальной массы (ОБМ) и каждого из УПМ в представленном образце. Количество выявленных микроорганизмов выражали в геном- эквивалентах на 1 мл (ГЭ/мл). Расчет доли отдельных видов и групп бактерий проводили относительно суммы всех выявленных в образце микроорганизмов. Спектр определяемых набором УПМ представлен следующими группами: грамположительные факультативно анаэробные микроорганизмы (Streptococcus spp. Staphylococcus spp., Corynebacterium spp.); грамотрицательные факультативно анаэробные микроорганизмы (Haemophilus spp., Pseudomonas aeruginosa / Ralstonia spp. / Burkholderia spp.); группа Enterobacteriaceae / Enterococcus spp.; облигатно анаэробные микроорганизмы (Gardnerella vaginalis, Eubacterium spp., Sneathia spp. / Leptotrichia spp. / Fusobacterium spp., Megasphaera spp. / Veillonella spp. / Dialister spp., Bacteroides spp. / Porphyromonas spp. / Prevotella spp.,Anaerococcus spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium cluster), микоплазмы (Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum), транзиторная микробиота (Lactobacillus spp.), грибы рода Candida.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ Microsoft Excel 2016 (Microsoft; США), пакета статистических программ WinPepi. Сравнительный анализ частоты выявления различных вариантов микробиоты культуральным методом и ПЦР-РВ проводили с помощью двустороннего критерия Фишера, различия считали достоверными при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты культурального исследования эякулята

При культуральном исследовании рост микроорганизмов обнаружили в 72 (83,7%) из 86 образцов эякулята, идентифицировали 28 видов микроорганизмов. В 14 (16,3%) образцах рост бактерий отсутствовал.
В 33 (38,4%) образцах эякулята при культивировании выявили только один микроорганизм, идентифицировали 10 видов. В большинстве случаев это были представители нормальной микробиоты УГТ мужчин или кожи. В 21 (63,6%) из 33 образцов микробиота была представлена одним из грамположительных факультативно анаэробных микроорганизмов: Staphylococcus spp. (S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis); Streptococcus spp. (S. anginosus), Corynebacterium coyleae, Dermabacter hominis. В 8 (24,2%) случаях обнаружили Enterococcus faecalis, в 4 (12,2%) из 33 образцов выявили грамотрицательные факультативно анаэробные бактерии Klebsiella oxytoca, E. coli, Moraxella osloensis.
При выявлении монокультуры в образце эякулята количество бактерий в большинстве случаев (28 (84,8%) из 33) было клинически малозначимым и составляло 10²–10³ КОЕ/мл. В 6 (18,2%) образцах количество выявленных бактерий составило 10⁴ КОЕ/мл, и только в одном образце — 10⁶ КОЕ/мл.

В 27 (31,4%) из 86 образцов выявили по 2 вида микроорганизмов, идентифицировали 20 видов. Исключительно грамположительные факультативно анаэробные бактерии выявили в 16 (59,3%) из 27 образцов, характерными были сочетания S. mitis / S. oralis — 8 случаев; C. glucuronolyticum / S. epidermidis и E. faecalis/ S. epidermidis — по 2 случая; E. faecalis / S. haemolyticus, S. сapitis / S. haemolyticus, S. epidermidis / S. agalactiae, C. glucuronolyticum / E. faecalis — по одному случаю. В одном образце были выявлены только грамотрицательные микроорганизмы: Enterobacter hormaechei / Pseudomonas aeruginosa. В 5 (18,5%) образцах одновременно присутствовали грамположительные и грамотрицательные факультативно анаэробные микроорганизмы: E. faecalis/ E. coli — в 2 случаях; Klebsiella pneumoniae / S. haemolyticus — в 2 случаях и E. faecalis / K. oxytoca — в одном. В 2 (7,4%) образцах эякулята выявили G. vaginalis, в одном случае в сочетании с Actinomyces neuii, в другом — с S. epidermidis. Еще в 2 (7,4%) образцах выявили Lactobacillus spp. в сочетании с грамположительными кокками: L. iners / S. gallolyticus, L. crispatis / S. warneri.
При выявлении двух культур в образце количество выделенных бактерий в 17 (62,9%) из 27 образцов составило 10²–10³ КОЕ/мл, что расценивают как клинически малозначимое [10]. В 9 (33,3%) образцах количество одного из выявленных видов (E. faecalis, K. oxytoca, G. vaginalis, S. agalactiae) составило 10⁴ КОЕ/мл. Только в одном образце количество обоих выделенных видов (K. pneumoniae / S. haemolyticus) составило 10⁶ КОЕ/мл.

Одновременно 3 микроорганизма выделили в 9 (10,5%) из 86 образцов эякулята, идентифицировали 12 видов микроорганизмов в различных сочетаниях. В 4 (44,4%) из 9 случаев микробиота была представлена исключительно грамположительными факультативно анаэробными бактериями из числа представителей нормальной микробиоты УГТ: C. glucuronolyticum, S. mitis/ S. oralis, S. hominis. В 2 (22,2%) образцах были выявлены сочетания C. glucuronolyticum / G. vaginalis / S. anginosus. В 3 случаях выявили сочетание грамположительных и грамотрицательных бактерий: S. agalactiae / E. coli/ C. glucuronolyticum; Corynebacterium amycolatum / E. hormaechei / E. faecalis и E. faecalis / E. coli / S. anginosus.
Количество выявленных бактерий при одновременном обнаружении трех видов в 3 из 9 случаев было клинически малозначимым (не более 10³ КОЕ/мл), в остальных образцах как минимум один вид присутствовал в количестве 10⁴ КОЕ/мл и более. В количестве 10⁴ КОЕ/мл и более определяли C. glucuronolyticum, E. hormaechei, E. faecalis, S. anginosus, G. vaginalis, S. agalactiae.
В 2 образцах при культуральном исследовании выявили по 4 и более микроорганизма одновременно. В одном случае это было сочетание C. gluconormum / E. faecalis / S. mitis / S. oralis / E. coli, где E. faecalis присутствовал в количестве 10⁴ КОЕ/мл. В двух других случаях были выявлены сочетания грамположительных представителей нормальной микробиоты в количестве не более 10³ КОЕ/мл, что в совокупности со спектром выявленных микроорганизмов позволяет предположить, что образцы могли быть контаминированы в процессе сбора эякулята.

Результаты исследования эякулята методом ПЦР-РВ

При использовании ПЦР-РВ микробиота была выявлена во всех 86 образцах эякулята. В каждом образце определяли 8–15 групп микроорганизмов, представленных в разных количествах — от 10² до 10⁶ ГЭ/мл. Использование математического алгоритма для расчета доли каждого из микроорганизмов по отношению к ОБМ позволило определить в большинстве образцов численно преобладающую группу бактерий.
В 15 (17,4%) из 86 образцов преобладали грамположительные факультативно анаэробные микроорганизмы, представители нормальной микробиоты УГТ мужчин — Streptococcus spp., Staphyloccus spp., Corynebacterium spp. В 27 (31,4%) образцах — облигатные анаэробы, в 4 (4,7%) — грамотрицательные факультативно анаэробные бактерии (P. aeruginosa / Ralstonia spp. / Burkholderia spp. и Haemophilus spp.). В 23 (26,7%) образцах преобладали бактерии группы Enterobacteriaceae / Enterococcus spp.; в 7 (8,1%) — транзиторная микробиота (Lactobacillus spp.); в 10 (11,6%) пробах выявлены смешанные микробные сообщества, в которых выделить преобладающую группу не представлялось возможным. Последнее демонстрирует разнородность микробиоты, которую можно определить с помощью ПЦР-РВ в отличие от культурального метода.
Интерпретируя результаты оценки микрофлоры эякулята методом ПЦР-РВ, мы понимали, что рассматривать совокупность выявленных МО как микробное сообщество или микробиоценоз нельзя, так как бактерии попадают в эякулят из разных отделов УГТ мужчины. Поэтому мы предлагаем дифференцировать варианты микробиоты эякулята по преобладающей группе микроорганизмов — превышающей в процентном соотношении другие группы. По этому критерию были выделены 6 вариантов микробиоты эякулята, частота выявления различных вариантов была проанализирована с учетом ОБМ (табл. 1).
Анализ полученных данных позволил выявить несколько закономерностей. По мере увеличения ОБМ эякулята было отмечено статистически значимое снижение частоты выявления варианта III (с преобладанием группы Enterobacteriaceae spp. / Enterococcus spp.), в то время как достоверно возросла доля варианта IV (с преобладанием облигатных анаэробов). Отмечена тенденция к увеличению частоты выявления варианта V (с преобладанием транзиторной микробиоты, Lactobacillus spp.), что может быть обусловлено несоблюдением правил подготовки к сбору эякулята (воздержание от половых контактов в течение предшествующих 3–5 дней). Примечательно, что в образцах с низкой ОБМ чаще всего выявляли вариант III и вариант VI (смешанный, без преобладания определенной группы), по мере увеличения ОБМ структура микробиоты изменялась.
Вариант I (c преобладанием грамположительных факультативно анаэробных МО) по результатам исследования методом ПЦР-РВ был выявлен только в 17,4% случаев, в то время как при культуральном исследовании данная группа бактерий была выявлена в 50% образцов.

Сравнение результатов культурального метода и ПЦР-РВ

Результаты культурального исследования были подтверждены методом ПЦР-РВ в 100% случаев — при получении роста чистой культуры определенного микроорганизма были получены положительные сигналы в соответствующей группе в тесте Андрофлор. Однако при использовании ПЦР-РВ во всех образцах были обнаружены другие группы микроорганизмов, отсутствовавшие в посеве. Особо стоит отметить, что во всех образцах с помощью ПЦР-РВ были идентифицированы некультивируемые in vitro облигатные анаэробы.
При использовании ПЦР-РВ микрофлора была обнаружена во всех 14 «стерильных» пробах эякулята. В данных образцах чаще всего определяли вариант III (с преобладанием группы Enterobacteriaceae spp. / Enterococcus spp.) — 5 (35,7%) из 14 проб и вариант I (c преобладанием грамположительных факультативно анаэробных МО) — 4 (28,5%) из 14 проб. Варианту IV (с преобладанием облигатных анаэробов) выявленная микробиота соответствовала в 2 (14,3%) пробах; на варианты II, V и VI — приходилось по одной пробе (7,2%). ОБМ в этой группе проб была менее 10⁴ ГЭ/мл, что может отчасти объяснить отсутствие роста при культуральном исследовании.
Далее анализировали, насколько часто микроорганизм, выявленный в наибольшем количестве при культивировании, совпадал с преобладающей группой бактерий по данным ПЦР-РВ (табл. 2).
Результаты культурального исследования полностью соответствовали результатам ПЦР-РВ только в 21 (24,4%) из 86 случаев. В этих образцах единственный выделенный вид микроорганизмов или численно превышающий количество других выделенных видов при культуральном исследовании относился к преобладающей группе микроорганизмов по данным ПЦР-РВ. В остальных случаях микробиота при культуральном исследовании либо отсутствовала (14 (16,8%)), либо спектр выявленных или численно преобладающих микроорганизмов отличался.
Количество выявленных при ПЦР-РВ микроорганизмов совпадало с количеством, определенным при культуральном исследовании, в 41 (47,7%) из 86 проб; превышало в 10–1000 раз — в 38 (44%) образцах. В 7 (8,3%) образцах количество выявленных микроорганизмов в ПЦР-РВ отличалось от количества, определенного методом посева, в меньшую сторону. Дискордантные результаты были обусловлены выявлением в этих образцах при посеве следующих видов бактерий: S. аgalactiae (в 2 пробах), S. аnginosus (в 2 пробах), S. mitis / S. oralis, S. hominis, L. сrispatus — по одному случаю. Дискордантные результаты связаны с тем, что ростовые свойства бактерий in vitro могут существенно различаться, а некоторые виды не переносят даже кратковременной транспортировки.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При культуральном исследовании образцов эякулята в большинстве случаев были выявлены грамположительные факультативно анаэробные МО, традиционно относимые к нормальной микробиоте УГТ мужчины. При этом в 43% проб количество их было менее 10⁴ КОЕ/мл, что принято оценивать как клинически мало значимое [10]. Присутствие нескольких видов микроорганизмов из числа нормальной микробиоты в незначительном количестве может свидетельствовать о контаминации проб в процессе сбора.
Результаты культурального исследования были подтверждены методом ПЦР-РВ в 100% случаев — при получении роста чистой культуры определенного микроорганизма были получены положительные сигналы в соответствующей группе в тесте Андрофлор, в том числе во всех 14 «стерильных» пробах эякулята. Отсутствие роста in vitro большинства групп микроорганизмов, выявленных методом ПЦР-РВ, вполне объяснимо, так как многие из данных микроорганизмов являются трудно культивируемыми или некультивируемыми [11].
Основные различия между результатами культурального исследования и ПЦР-РВ касались преобладающей в микробиоте группы микроорганизмов. Полное соответствие по этому параметру было установлено только в 24,4% случаев. Дискордантные результаты могут быть обусловлены двумя причинами: во-первых, различием ростовых свойств бактерий in vitro, во-вторых, гибелью некоторых видов при транспортировке. Кроме того, облигатно анаэробные микроорганизмы, присутствующие в эякуляте, не могут быть выявлены при рутинном культуральном исследовании, что искажает представления о микробиоте в целом.
Количество выявленных микроорганизмов в 1 мл эякулята различалось в 52,3% образцов. В 44% образцов ОБМ, определяемая методом ПЦР-РВ, была выше в 10–1000 раз по сравнению с культуральным методом. В 7 (8,3%) образцах данный показатель был выше при культуральном исследовании. При этом мы понимаем, что прямое сравнение количеств микроорганизмов, выявленных в эякуляте методом ПЦР-РВ и культуральным методом, не вполне корректно. Эякулят значительно отличается по вязкости и гомогенности, что может приводить к неравномерному распределению микробных клеток в биоматериале. Стоит также отметить, что перед проведением ПЦР-РВ мы дополнительно обрабатывали эякулят средой с муколитиком, что снижало вязкость образца и, возможно, обеспечивало более равномерное распределение микроорганизмов в объеме исследуемого материала.
Полученные в ходе настоящего исследования данные позволяют рекомендовать метод ПЦР-РВ (тест Андрофлор) как альтернативу культуральному исследованию для комплексной оценки микробиоты эякулята.

ВЫВОДЫ

Параллельное исследование эякулята посредством ПЦР-РВ и культурального метода позволило оценить преимущества ПЦР-РВ (теста Андрофлор) для комплексной оценки микробиоты данного биологического материала. Использование только культурального метода для оценки микробиоты эякулята позволяло выявить лишь часть присутствующих в образце микроорганизмов, при этом каждый 6-й образец был «стерильным». Применение ПЦР-РВ позволило идентифицировать от 8 до 15 групп микроорганизмов в количестве 10²–10⁶ ГЭ/мл во всех исследованных пробах эякулята, при этом в большинстве проб преобладала одна из групп микроорганизмов. Во всех 86 образцах, кроме вида, выявленного культуральным методом, были обнаружены представители других групп бактерий. Преобладающая группа микроорганизмов в микробиоте эякулята по данным культурального исследования полностью соответствовала результатам ПЦР-РВ только в 24,4% проб, в большинстве случаев получение дискордантных результатов было обусловлено невозможностью выявить при культуральном исследовании некультивируемые и трудно культивируемые группы облигатно анаэробных бактерий, которые обнаружили с помощью теста Андрофлор. Этиологическая значимость выявления определенных преобладающих групп микроорганизмов и их количеств в эякуляте требуют проведения дальнейшего исследования с учетом клинических данных и диагноза пациента.