Борьба человечества с множеством патогенных микроорганизмов продолжается на протяжении многих веков. Открытие антимикробных агентов привело к успешному лечению и устранению некоторых бактериальных инфекций, однако выявило штаммы, устойчивые к противомикробным препаратам за счет многочисленных механизмов антибиотикорезистентности [1–3]. Проблема антибиотикорезистентности становится все более острой в XXI в., исследование механизмов приобретения устойчивости к антибимикробным агентам лежит в основе разработки новых способов борьбы с данным явлением [4, 5]. Резистентность к лекарственным средствам представляет собой растущую глобальную угрозу для общественного здравоохранения, которая затрагивает все основные патогенные микрорганизмы и противомикробные средства [6, 7].

При проведении микробиологического мониторинга в течение последних лет отмечена тенденция к увеличению количества полирезистентных штаммов. Например, метициллинрезистентные S. aureus по сравнению с метициллин-чувствительными штаммами отличаются существенно более высокой частотой устойчивости к гентамицину, клиндамицину, рифампицину, тетрациклину, хлорамфениколу, цефтаролину, ципрофлоксацину и эритромицину; P. аeruginosa проявляет нечувствительность к антисинегнойным цефалоспоринам — цефепиму и цефтазидиму, а также пиперациллин-тазобактаму, имипенему, меропенему; представители семейства Enterobacteriaceae устойчивы к трем и более традиционно применяемым антибиотикам, таким как цефотаксим, цефтазидим, цефепим, азтреонам и др. [8–10].

Поиск и разработка новых противомикробных средств — один из основополагающих принципов преодоления устойчивости микроорганизмов к антибиотикам. Необходимость поиска новых высокоэффективных и безопасных противомикробных соединений закреплена в Российской Федерации на законодательном уровне [11].
В результате реализации синтетических возможностей замещенных 4-, 5-, 6-, 7-аминоиндолов, используемых в качестве исходных веществ, нами была синтезирована серия индолиламидов и пирролохинолонов и доказано, что полученные новые соединения, представляющие собой различные замещенные циклические, нециклические N-(индолил)амиды и пирролохинолоны, обладают той или иной противомикробной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов [12–14].
Целью исследования было определить тип противо-микробного действия новых соединений, синтезированных на основе замещенных аминоиндолов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Определение типа противомикробного действия проводили с использованием тест-штамма микроорганизма Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р (получен из коллекции музея живых культур ФБУН «ГНЦ ПМБ»). Для этого использовали методику воздействия исследуемых соединений в физиологическом растворе при комнатной температуре и коротких экспозициях [15]. Различные концентрации изучаемых соединений в физиологическом растворе разливали по пробиркам (по 1 мл). Контрольные пробирки не содержали исследуемых соединений. Одновременно готовили взвесь бактерий в физиологическом растворе и добавляли по 1 мл в пробирки, содержащие исследуемые соединения. Концентрация исследуемого микроорганизма в суспензии составляла 1,5 • 10⁸ КОЕ/мл. Мутность бактериальной суспензии с концентрацией исследуемого микроорганизма 1,5 • 10⁸ КОЕ/мл при визуальном контроле соответствует 0,5 по стандарту мутности МакФарланда [16, 17]. В работе использовали коммерческий набор для определения стандарта мутности 0,5 по МакФарланду (Sensititrе; UK). Контроль оптической плотности суспензии также осуществляли спектрофотометрически (денситометрически). Бактериальную суспензию готовили из агаровой суточной культуры. Отмечали время, а затем через 5, 10, 15 и 30 мин, 1, 2 и 4 ч с помощью микропипетки вносили по 100 мкл физиологического раствора, содержащих микроорганизмы и исследуемое соединение, в пробирки, содержащие 1 мл бульона Мюллера– Хинтона (МХБ) (М391; HiMedia Laboratories Pvt. limited; Индия). Использование нескольких временных экспозиций при определенной дозе вещества является основной предпосылкой для оценки возможных и фактических воздействий. Такой мониторинг позволяет выявить имеющиеся на данный момент воздействия минимальной подавляющей концентрации (МПК) соединения и их изменения во времени. Свойства веществ могут меняться в зависимости от свойств среды и микроорганизмов [15].

Конечная концентрация исследуемого микроорганизма в суспензии составила примерно 5 • 10⁵ КОЕ/мл в каждой пробирке. Концентрация исследуемых соединений для циклического амида 5D была равна 25 мкг/мл, для циклического амида 7D — 125 мкг/мл, для амида S3 — 62,5 мкг/мл, циклического амида HD — 59 мкг/мл, азитромицина — 1 мкг/мл [11–13]. В качестве препарата сравнения был выбран азитромицин — классический препарат с бактериостатическим действием, МПК₉₀ азитромицина для S. aureus составляет 0,01–2 мкг/мл [18]. Пробирки помещали в термостат при 37 °С и наблюдали наличие роста микроорганизмов в течение 5 суток. Для определения наличия роста микроорганизма пробирки с посевами культуры патогена просматривали в проходящем свете. Дополнительно рост микроорганизмов фиксировали по изменению оптической плотности культуральной среды с использованием фотоэлектроколориметра Apel «АР-101» (ООО «Энергопромавтоматика»; Россия). Исследование проводили в объеме 1 мл в стерильных кюветах при длине волны 600 нм. Полученную оптическую плотность микроорганизмов, культивируемых в присутствии противомикробного соединения, сравнивали с оптической плотностью микроорганизмов, культивируемых без противомикробного соединения. В ходе исследования провели четыре серии эксперимента.

В работе исследовали соединения, полученные на основе замещенных 4-, 6- и 7-аминоиндолов.

1. Производное замещенного 4-амино-2-фенилиндола 4-гидрокси-8-фенил-4-(трифторметил)-1,3,4,7-тетрагидро- 2Н-пирроло[2,3-h]хинолин-2-он — циклический амид (лабораторный шифр: 5D)

форм. 1

2. Производные замещенных 6-аминоиндолов:
N-(1,5-диметил-2-фенил-1Н-индол-6-ил)-4,4,4-трифтор-3- оксобутанамид — нециклический амид (лабораторный шифр: S3)

форм. 2

3. 9-гидрокси-5-метил-2-фенил-9-(трифторметил)-1,6,8,9- тетрагидро-7Н-пирроло[2,3-f]хинолин-7-он — циклический амид (лабораторный шифр: 7D)

форм. 3

4. Производное замещенного 7-аминоиндола 6-гидрокси- 2,3-диметил-6-(трифторметил)-1,6,7,9-тетрагидро-8H-пирроло[3,2-h]хинолин-8-он — циклический амид (лабораторный шифр: HD)

форм. 4

Обозначения для исследуемых соединений представлены в соответствии с правилами компьютерной программы ACDLABS IUPAC Name Generator версия MarvinSketch 4.7.7.0. (ChemAxon Ltd.; Венгрия), а структурные формулы соединений были нарисованы в компьютерной программе ISIS Draw 2.4. версия 2.4. (MDL Information Systems; США).
Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики, достоверность результатов оценивали с помощью метода определения t-критерия Стъюдента [16].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Видимый рост микроорганизмов в питательной среде наблюдали при показателях оптической плотности (D) культуральной среды более 0,21. Культуральная среда с «отрицательным» контролем микроорганизмов (5 • 10⁵ КОЕ/мл микроорганизма), хранившаяся в холодильнике, имеет значение D = 0,003.
В контрольных пробирках видимый рост микроорганизмов наблюдали через сутки после посева (рис. 1). Показатели оптической плотности культуральной среды после первых суток культивирования демонстрировали прирост микробной массы до 0,26 и более (таблица). Через 2 суток культивирования значение D микробной популяции S. aureus АТСС 6538-Р достигло 0,39, через 3 суток — 0,51, через 4 суток — 0,56, через 5 суток культивирования этот показатель составил 0,6. Таким образом, в течение эксперимента наблюдали прирост микробной популяции на 50%, на 30%, на 9%, на 7% после 2, 3, 4 и 5 суток культивирования соответственно (рис. 2). Снижение интенсивности роста можно объяснить истощением ресурсов питательной среды.

Препарат сравнения азитромицин задерживал рост и размножение тест-штамма S. aureus в течение 3 суток. После 4-суточного культивирования с азитромицином в МПК наблюдали появление видимого роста микробной популяции в проходящем свете (рис. 3). Увеличение плотности культуральной среды после экспозиций с азитромицином наблюдали после 2 суток культивирования (таблица). Показатели величины D культуральной среды статистически значимо отличались от таковых в контроле (р < 0,05). После 4 суток культивирования тест-штамма отмечали увеличение плотности культуральной среды относительно исходной до 0,23–0,25, но задержка роста микробной популяции оставалась статистически значимо отличной от контроля в течение всего эксперимента. Запоздалый (через 4 суток) рост свидетельствует об отсутствии бактерицидного действия. МПК азитромицина задерживает рост и размножение микроорганизмов и оказывает в исследуемой концентрации бактериостатическое действие.

После экспозиции тест-штамма с циклическим амидом HD видимого в проходящем свете роста в первые сутки не наблюдали. Через 2 суток культивирования роста микроорганизмов во всех пробирках невооруженным глазом не выявили. Через 3 суток наблюдения обнаружили видимое помутнение среды во всех пробирках с посевами. Значение D культуральной среды после первых суток наблюдения свидетельствует о задержке роста и размножения тест-штамма S. aureus АТСС 6538-Р после экспозиций с исследуемым соединением (таблица; рис. 4). После культивирования в течение 2 суток циклический амид HD статистически значимо задерживал рост микробной популяции (р < 0,05). В течение всего эксперимента плотность культуральной жидкости содержащей МПК изучаемого соединения была ниже, чем в контроле. МПК исследуемого соединения HD задерживает рост и размножение микроорганизмов и оказывает в исследуемой концентрации бактериостатическое действие.

После экспозиций тест-штамма с соединением S3 видимого в проходящем свете роста в первые сутки не обнаружили. Через 2 суток культивирования наблюдали видимый рост в пробирках после экспозиции исследуемых микроорганизмов с амидом S3 в течение 5 мин, 10 мин и 15 мин, в остальных пробирках рост не вооруженным глазом в проходящем свете не выявили. На 3 сутки наблюдения обнаружили видимое помутнение среды во всех пробирках с посевами микроорганизмов. Изучаемый амид S3 статистически значимо задерживал увеличение значения D культуральной среды с тест-штаммом S. aureus в первые и вторые сутки культивирования (р < 0,05) (таблица; рис. 5). В течение последующих суток культивирования отмечали тенденцию к задержке степени увеличения D культуральной среды по сравнению с контролем. Запоздалый (после 2 суток) рост микроорганизмов свидетельствует об отсутствии бактерицидного действия. МПК исследуемого соединения S3 задерживает рост и размножение микроорганизмов и оказывает в исследуемой концентрации бактериостатическое действие.

После экспозиций микроорганизмов с соединением 7D видимого в проходящем свете роста в первые сутки не наблюдали. Через 2 суток культивирования так же не выявили видимого не вооруженным глазом роста микроорганизмов. После 3 суток наблюдения обнаружили видимое помутнение среды с экспозицией вещества 7D в течение 30 мин. После 4 суток культивирования во всех пробирках наблюдали видимое в проходящем свете помутнение культуральной среды. Статистически значимое снижение плотности культуральной среды по сравнению с контролем наблюдали в течение 3 суток культивирования исследуемого тест-штамма S. aureus АТСС 6538-Р после экспозиций с циклическим амидом 7D (таблица; рис. 6). На протяжении всего эксперимента наблюдали тенденцию к задержке роста микробной популяции в присутствии соединения 7D. Таким образом, МПК вещества 7D задерживает рост и размножение микроорганизмов и оказывает в исследуемой концентрации бактериостатическое действие.

Видимый в проходящем свете рост S. aureus АТСС 6538-Р после экспозиций с циклическим амидом 5D в течение всего эксперимента не был обнаружен. Показатели оптической плотности культуральной среды в присутствии циклического амида 5D свидетельствовали о задержке роста и размножения исследуемого тест- штамма S. aureus в течение 5 суток культивирования (таблица; рис. 7). Величина D культуральной среды статистически значимо отличалась от таковой в контроле (р < 0,05) в ходе эксперимента, но все же имела тенденцию к увеличению. Вероятно концентрация соединения 5D, полученная в среде, была близка к бактерицидной. Изучаемый циклический амид 5D задерживает рост и размножение микроорганизмов и оказывает в исследуемой концентрации бактериостатическое действие.

Таким образом, исследованные соединения, а именно циклический амид 5D (из группы соединений, полученных на основе 4-амино-фенилиндола), амид S3 и циклический амид 7D (из группы соединений, полученных на основе замещенных 6-аминоиндолов), а также циклический амид НD (из группы соединений, полученных на основе замещенных 7-аминоиндолов) в течение суток и более вызывали задержку роста и размножения тест-штамма S. aureus АТСС 6538-Р. После культивирования в течение 2 суток все исследуемые соединения, кроме амида S3, продолжали подавлять рост исследуемого штамма микроорганизма. Видимый рост и соответствующее увеличение плотности культуральной среды через 2 суток наблюдали в пробирках с соединением S3 после экспозиций в течение 5 мин, 10 мин и 15 мин. После 3 суток видимый рост наблюдали во всех пробирках в присутствии циклического амида НD и амида S3. После 4 суток культивирования наблюдали видимый рост микроорганизмов в присутствии соединения 7D. Экспериментальное исследование в присутствии циклического амида 5D сопровождалось отсутствием видимого роста S. aureus АТСС 6538-Р в течение 5 суток культивирования, хотя был обнаружен прирост микробной популяции по показателям оптической плотности среды.
Изученный тип противомикробного действия новых соединений, синтезированных на основе замещенных 4-, 6-, 7-аминоиндолов, обладающих наиболее выраженным противомикробным действием, сходен с действием препарата сравнения (азитромицина), классическим противомикробным препаратом с бактериостатическим действием.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В течение последних десятилетий неизменно актуальными остаются работы в области химии индола и его производных. Это обусловлено тем, что индольная структура лежит в основе многих природных и синтетических физиологически активных веществ, например молекулы незаменимой аминокислоты триптофана, биогенного амина серотонина. Особый интерес представляют аминоиндолы с аминогруппой в бензольной части молекулы. Эти соединения, как любые ароматические амины, имеют различного рода производные с участием аминогруппы [12–13]. Нами проводились исследования по изучению взаимодействия β-диоксосоединений с замещенными аминоиндолами с различным положением аминогруппы в бензольном кольце и были разработаны методы получения и синтезированы 16 исходных аминоиндолов и 32 их производных — индолиламидов, енаминов и пирролохинолонов. Определены МПК и спектры антимикробного действия полученных соединений.

В современной фармакологической науке исследование новых противомикробных соединений включает изучение МПК вещества, спектра противомикробного действия, типа противомикробного действия, механизма биологического действия и т. п. Методы определения типа противомикробного действия основаны на исследовании и сравнении МПК и минимальных бактерицидных концентраций (МБК) и дают возможность лишь условно классифицировать новое соединение по типу действия на бактериальную клетку [16]. Методика определения типа противомикробного действия при воздействии исследуемых соединений в коротких экспозициях [15] позволила нам не только выявить тип противомикробного действия исследуемых соединений, но и доказать, что новые соединения при используемых временных экспозициях не изменяют свои противомикробные свойства, ни под действием окружающей среды, ни под действием микроорганизмов. В присутствии всех исследуемых соединений, не зависимо от наличия или отсутствия видимого роста микробной популяции, можно было наблюдать устойчивую тенденцию к задержке роста и размножения тест-штамма S. aureus АТСС 6538-Р в течение всего эксперимента. Исходя из доказанного бактериостатического типа действия в МПК исследуемых соединений, можно предположить, что воздействие на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану микроорганизмов, приводящее к гибели микробной клетки, не является механизмом противомикробного действия группы изучаемых производных 4-, 6-, 7-аминоиндолов. Вероятно, активность исследуемых соединений обусловлена воздействием либо на ДНК микробной клетки (ДНК- повреждающее действие или дополнительный механизм, не сопровождающийся образованием разрывов ДНК), либо на процессы, связанные с белковым синтезом. Изучение механизма противомикробного действия производных 4-, 6-, 7-аминоиндолов будет следующим этапом нашего исследования.

ВЫВОДЫ

В работе доказаны способность производных замещенных бензаминоиндолов в минимальных подавляющих концентрациях оказывать бактериостатическое действие и устойчивая тенденция к задержке роста и размножения тест- штаммов микроорганизмов в присутствии производных 4-, 6-, 7-аминоиндолов. Полученные результаты являются основанием для дальнейшего исследования синтетических производных 4-, 6-, 7-аминоиндолов с целью клинического применения изученных соединений в качестве противомикробных препаратов.