Врожденные миопатии — это клинически и генетически гетерогенная группа нервно-мышечных заболеваний со сложным патогенезом, неоднородной клинической картиной и разными типами наследования [1]. Функциональная недостаточность мышечной ткани при заболеваниях данной группы проявляется на фоне развития специфических патологических структур в мышечных волокнах при отсутствии миодистрофических процессов в них [2].
На основании морфологической картины биопсийного материала различают несколько форм врожденных структурных миопатий, самые распространенные из которых — болезнь центрального стержня, немалиновая миопатия, многостержневая миопатия, центронуклеарная миопатия, описаны как классические формы [2].

Каждая морфологическая форма включает несколько генетических вариантов, различающихся и по тяжести клинической картины, и по типу наследования, что имеет значение для тактики ведения пациентов и медико- генетического консультирования семьи.
Оценка распространенности отдельных морфологических форм и генетических вариантов врожденных структурных миопатий, их истинного вклада в структуру симптомокомплекса «вялый ребенок», клиническая дифференциальная диагностика, а также классификация по-прежнему затруднены. Это обусловлено высокой генетической гетерогенностью и редкостью отдельных вариантов, перекрыванием клинических симптомов при нервно-мышечных заболеваниях, формирующих симптомокомплекс «вялый ребенок», ограничениями использования молекулярно-генетических методов диагностики.
Несмотря на то что изучать врожденные структурные миопатии начали с описания болезни центрального стержня еще в 1956 г., до сих пор до конца не изучены этиопатогенез и клинико-генетические корреляции при врожденных миопатиях, сопровождающихся формированием морфологической картины в виде «стержней».

Общей морфологической особенностью стержневых миопатий является наличие области сниженной окислительной активности ферментов в мышечных волокнах первого типа, определяемой при гистохимическом анализе, в сочетании с дезорганизацией саркомеров и почти полным истощением митохондрий [3, 4].
Выделяют две основные формы стержневых миопатий: болезнь центрального стержня и многостержневую миопатию.
Согласно литературным данным, основными причинами развития наследственных форм стержневых миопатий являются мутации в генах, кодирующих два белка саркоплазматического ретикулума: рианодиновый рецептор (RYR1), обеспечивающий работу канала высвобождения кальция, и селенопротеин N (SEPN1) [5, 6].

Ген рианодинового рецептора (RYR1) локализован на хромосоме 19q13.1 и включает 106 экзонов. Рианодиновый рецептор представляет собой рецепторуправляемый Ca²⁺-канал, расположенный в мембране эндоплазматического ретикулума и регулирующий выход из него кальция. В скелетной мышечной ткани рианодиновый рецептор локализован в мембране поперечных цистерн саркоплазматического ретикулума и связан с дигидропиридиновым рецептором на инвагинациях плазмалеммы в Т-трубочках. Сигнал, приходящий по сарколемме за счет этой связи, воздействует на саркоплазматический ретикулум, вызывая выброс кальция, необходимого для мышечного сокращения [7–9]. Мутации в гене рианодинового рецептора (RYR1) встречаются чаще, чем мутации в гене селенопротеина N (SEPN1), и связаны с развитием нескольких патологических состояний, в первую очередь болезни центрального стержня (Central core disease, OMIM 117000) с аутосомно-доминантным и аутосомно-рецессивным типами наследования и реже — многостержневой миопатии (Multiminicore disease, OMIM 255320) с аутосомно-рецессивным типом наследования [10, 11]. Мутации в гене RYR1 ассоциированы также с повышенным риском злокачественной гипертермии (Malignant hyperthermia susceptibility 1, OMIM 145600) с аутосомно-доминантным типом наследования — фармакогенетической предрасположенности к тяжелой и потенциально смертельной побочной реакции в ответ на применение летучих анестетиков и/или миорелаксантов [12].

В основе патогенеза болезни центрального стержня лежат ультраструктурные изменения в центральных зонах скелетных мышечных волокон, а также отсутствие в них функциональной активности, в первую очередь митохондриальных ферментов. Гистологические характеристики этих зон («стержней»), не схожие с таковыми в периферических участках волокна, служат одним из основных диагностических критериев заболевания [13] (рис. 1 и рис. 2). Болезнь центрального стержня обычно развивается в раннем детском возрасте. К характерным признакам относят задержку моторного развития, снижение мышечного тонуса, слабость проксимальных отделов мышц (при этом лицевая мускулатура не страдает). Для данного заболевания характерны также такие скелетные нарушения, как врожденный вывих бедра и сколиоз. Мышечная слабость с возрастом не прогрессирует.

Ген SEPN1 локализован на хромосоме 1p36-p35, включает 13 экзонов и кодирует белок селенопротеин N, представляющий собой гликопротеин, расположенный в эндоплазматическом ретикулуме и выступающий в роли медиатора селена, который входит в состав различных защитных и метаболических систем. Кроме того, он принимает участие в поддержании кальциевого гомеостаза в мышечной ткани путем обеспечения деятельности окислительных ферментов и контроля окислительного состояния рианодиновых рецепторов. Показано, что дефицит селенопротеина N приводит к повышению оксидантной активности в миотубах и нарушению регуляции супероксиддисмутазы и каталазы. В результате происходит окислительный стресс, кальциевый гомеостаз мышечной ткани нарушается вследствие выхода из строя рианодиновых рецепторов и неконтролируемого высвобождения кальция через их каналы [9, 11, 14]. Мутации в гене SEPN1 связаны с развитием многостержневых миопатий (OMIM 602771), а также с врожденной мышечной дистрофией с ригидным позвоночником (Muscular dystrophy, rigid spine, 1, OMIM 602771), имеющей сходный фенотип [15]. Тип наследования заболеваний — аутосомно-рецессивный.

К гистологическим признакам многостержневых миопатий относят наличие в скелетно-мышечных волокнах множественного количества стержней, не обязательно расположенных центрально (рис. 3). Морфофункциональной особенностью строения мышечной ткани при RYR1-обусловленной многостержневой миопатии является наличие достаточно массивных стержней в мышечном волокне (multicores) [9, 11]. Характерная патоморфологическая особенность мышечной ткани при SEPN1-обусловленной многостержневой миопатии — наличие большого количества мелких стержней (minicores) [9, 11].
Многостержневая миопатия — врожденная миопатия с началом в раннем детском возрасте (симптомокомплекс «вялого ребенка»), характеризующаяся мышечной гипотонией, задержкой формирования двигательных навыков, выраженной мышечной слабостью в проксимальных отделах конечностей, деформациями позвоночника с ранним формированием сколиоза, деформацией грудной клетки. Для многостержневой миопатии характерна слабость лицевой мускулатуры.

Сходство клинических проявлений стержневых миопатий с другими видами врожденных миопатий, сложность структуры этих заболеваний, различные варианты сочетания нарушений мышечной ткани осложняют проведение их дифференциальной диагностики. Диагностика врожденных стержневых миопатий основана на сочетании клинических и морфологических признаков, а также данных молекулярно- генетического исследования. Фенотип больных со структурными миопатиями, включая клинические симптомы и морфологическую картину (процессы, происходящие в мышечной ткани), не всегда однотипен. Несмотря на выявленную этиопатогенетическую связь с генами RYR1 и SEPN1, существует предположение о влиянии других генов на развитие заболевания, а также полигенной природы заболевания [2]. В связи с этим представляется актуальным изучение клинических, морфологических и генетических параллелей врожденных стержневых миопатий.
Цель настоящего исследования — сопоставить клинико-морфологические характеристики с результатами экзомного секвенирования, полученными методами массового параллельного секвенирования (MPS), у пациентов с клиническими и морфологическими признаками врожденных стержневых миопатий.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 8 детей, среди которых 2 мальчика и 6 девочек (3–14 лет). Критерии включения пациентов в исследование: пациенты любого пола с неотягощенным семейным анамнезом; наличие диагноза врожденной миопатии; наличие морфологических признаков стержневой миопатии; наличие результатов молекулярно-генетического исследования. Критерии исключения: отсутствие морфологических признаков стержневых структур по данным биопсии.
Были проанализированы выписки из историй болезни пациентов. Морфологический анализ проводили с помощью световой микроскопии при помощи микроскопа Nikon Eclipse Ni (Nikon Corp.; Япония) (окраска парафиновых и замороженных срезов, гистоферментохимическая окраска) и электронной микроскопии согласно протоколам производителей.

1. Срезы свежей ткани получали путем заморозки биоптата в жидком азоте и дальнейшей нарезки на микротоме-криостате Microm HM 505 N (Microm Tech.; США). Для получения парафиновых срезов проводили химическую фиксацию в 10%-м нейтральном (рН 7,4) забуференном формалине согласно протоколу производителя и дальнейшую нарезку на микротоме.
2. Окраску гематоксилином и эозином замороженных срезов, окраску гематоксилином и эозином парафиновых срезов, гистохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы в замороженных срезах с использованием нитросинего тетразолия по Нахласу и др., 1957 [16] проводили согласно стандартному протоколу.
3. Для электронно-микроскопического исследования проводили префиксацию материала размером не более 1 мм3 в 2,5%-м растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере (рH 7,4) при 0 °С. После отмывки ткани фосфатным буфером (рH 7,4) фиксировали 1%-м раствором четырехокиси осмия в течение часа при 2–4 °С.
Затем ткань обезвоживали в спиртах восходящей концентрации. Заливку ткани производили в эпоновую смолу после трехкратной обработки ацетоном по методике Лафта [17] согласно стандартному протоколу. Срезы получали на ультратоме REICHERT Nr. 321850/E (Reichert tech.; Австрия) и контрастировали цитратом свинца и уранил-ацетатом натрия по методике Рейнольдса [18]. Исследование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JEOL JEM-100B (Jeol LTD.; Япония).

Молекулярно-генетический анализ проводили с помощью MPS на платформе HiSeq2500 (Illumina; США) согласно протоколу производителя.
1. Процедуру мечения ампликонов производили при помощи наборов для мечения BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fisher Scientific; США) по протоколу производителя. Секвенирование по Сэнгеру — на генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems; США) согласно протоколу производителя.
2. Биоинформатическую обработку данных MPS проводили при помощи Cutadapt версии 1.14 (Cutadapt; США), BWA версии 1.14 (Illumina; США), FastQC версии 0.11.5 (Illumina; США), GATK HaplotypeCaller версии 3.7 (GATK HaplotypeCaller; США), snpEff версии 4.3p (SnpEff; США). Оценивали патогенность и консервативность, данные для которых извлекали из баз данных dbNSFP, Clinvar, OMIM и HGMD; использовали также утилит SIFT версии 1.03 (SIFT; США) и Polyphen2 версии 2.2.2 (Polyphen2; США) для предсказания возможной патогенности мутации. Информация о частотах мутаций взята из баз данных 1000Genomes project, ExAC и др. Аннотацию мутаций и их патогенность предсказывали согласно Стандартам и Руководству, разработанным ACMG, AMP и CAP для интерпретации мутаций, полученных с помощью секвенирования [19].
3. Клиническую интерпретацию результатов молекулярно- генетического анализа (экзомного секвенирования) проводили с помощью генетических баз данных OMIM (https://omim.org/), Varsome (https://varsome.com/), ClinVar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/), The Human Gene Mutation Database (http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. php) и др., согласно руководству по интерпретации данных, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) [20].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

У обследованных больных было отмечено наличие сходных клинических проявлений, характерных для врожденных структурных миопатий: симптомокомплекс «вялого ребенка» в раннем возрасте, задержка формирования моторных навыков. Выявлены различная степень нарушения походки (вплоть до отсутствия самостоятельной ходьбы) и деформации позвоночника; в неврологическом статусе обращали на себя внимание снижение мышечной силы и тонуса, снижение или отсутствие сухожильных рефлексов с верхних и нижних конечностей. При биохимическом обследовании уровень креатинфосфокиназы (КФК) у троих детей в возрасте до 5 лет был нормальным, а у пяти пациентов в возрасте 7–14 лет находился на верхних границах нормы или был незначительно повышен (табл. 1).
У всех детей при морфологическом обследовании выявлены стержневые структуры мышечного волокна — у пяти пациентов (пациенты 1, 2, 3, 7, 8) отмечена картина болезни центрального стержня, у трех пациентов (пациенты 4, 5, 6) — картина многостержневой миопатии.
Мутации были обнаружены в 87,5% случаев (у 7 из 8 обследованных пациентов): у 6 обследованных — в генах RYR1 и SEPN1, ответственных за врожденные стержневые миопатии, и у одного пациента — в гене LAMA2, ответственном за мерозин-негативную мышечную дистрофию (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты молекулярно-генетического анализа достаточно хорошо коррелируют с клиническими и морфологическими данными пациентов: у троих пациентов с морфологической картиной болезни центрального стержня (пациенты 1, 2 и 3) выявлены мутации в гене RYR1, у троих пациентов с морфологической картиной многостержневой миопатии (пациенты 4, 5 и 6) выявлены мутации в гене SEPN1 (табл. 2).
Доли пациентов с мутациями в генах RYR1 и SEPN1 одинаковы и составляют 42,86% для каждого гена среди пациентов с мутациями.

В гене RYR1 обнаружено 4 мутации у троих пациентов. Три выявленные мутации c.11798A>G, c.14387A>G и c.14581C>T описаны ранее [21, 22, 23].
Согласно литературным данным, мутации c.11798A>G и c.14387A>G ассоциированы со спорадическими случаями болезни центрального стержня и у наших пациентов (1-го и 2-го соответственно) также выявлены в гетерозиготном состоянии.
У пациента 3 выявлены две мутации (c.14581C>T и c.7561G>A) в гене RYR1 предположительно в компаунд- гетерозиготном состоянии, что позволяет думать об аутосомно-рецессивном типе наследования заболевания. Мутация c.14581C>T описана и при спорадических случаях, и как рецессивный аллель [27]. Мутация c.7561G>A идентифицирована впервые. Наличие двух мутаций позволяет предполагать аутосомно-рецессивный тип наследования.

В гене SEPN1 обнаружено 4 мутации у троих пациентов. Мутации c.611dupA, c.713dupA, c.583G>A были описаны ранее [24, 25].
Мутация c.611dupA представляет собой мутацию сдвига рамки считывания (frameshift), приводящую к синтезу укороченного нефункционального белка. Данная мутация обнаружена в гомозиготном состоянии (пациент 5), что согласуется с аутосомно-рецессивным типом наследования заболевания.

Мутация c.713dupA, также являющаяся мутацией типа frameshift, выявлена у пациента 4 в компаунд-гетерозиготном состоянии. Она описана как причина Muscular dystrophy, rigid spine, 1 (OMIM: 602771) у французских пациентов и в гомозиготном, и в гетерозиготном состояниях [24]. Выявленный у пациента 4 генетический вариант c.583G>A, расцененный предсказательными программами как вероятно патогенный, описан в базах данных мутаций как доброкачественный, однако его значимость для развития заболевания пациента необходимо дополнительно исследовать.

Мутация c.485C>A идентифицирована впервые и обнаружена в гетерозиготном состоянии (пациент 6). Это не позволяет подтвердить диагноз многостержневой миопатии, хотя морфологические и клинические данные пациента согласуются с данным диагнозом. Исключить диагноз многостержневой миопатии, обусловленной мутациями в гене SEPN1, мы тоже не можем, так как мутация во втором аллеле гена могла быть не найдена в связи с техническими ограничениями метода высокопроизводительного параллельного секвенирования.
У двух пациентов с направляющим диагнозом врожденной миопатии/миодистрофии и морфологическими признаками болезни центрального стержня (пациенты 7 и 8) не были выявлены мутации в генах RYR1 и SEPN1.

У пациента 7 обнаружено две мутации предположительно в компаунд-гетерозиготном состоянии в гене LAMA2 (14,28% случаев с выявленными мутациями). Мутации в гене LAMA2 связаны с развитием поясно-конечностной мышечной дистрофии 23-го типа (OMIM 618138) и с врожденной мерозин-негативной мышечной дистрофией (OMIM 607855), наследующихся аутосомно-рецессивно.
Выявленная у пациента 7 мутация в гене LAMA2 c.7147C>T (p.Arg2383*), приводящая к синтезу укороченного нефункционального белка, описана ранее в гомозиготном состоянии у девочки 4-х лет [28], c характерными для мерозин-дефицитной врожденной мышечной дистрофии типа А признаками (врожденная гипотония, мышечная слабость, высокий уровень сывороточной креатинкиназы (1556 МЕ/л) и аномалии белого вещества при магнитно-резонансной томографии). Кроме того, у пациентов с этим заболеванием могут отмечаться судороги и структурные аномалии головного мозга. Причины вариабельной тяжести клинического фенотипа при врожденной мышечной дистрофии с частичным дефицитом ламинина альфа 2 до конца не известны и могут быть обусловлены нарушениями сайта сплайсинга [26].
Вторая мутация в гене LAMA2, выявленная у нашей пациентки, — несинонимичная замена c.3406T>C (p.Cys1136Arg) — не описана. Несинонимичные замены могут приводить как к формированию альтернативных сайтов сплайсинга и синтезу новых изоформ белка, так и к конформационным изменениям структуры белка, нарушающим его функцию. В связи с этим необходимы дальнейшие исследования для уточнения роли обнаруженной мутации в развитии заболевании.

У нашей пациентки клиническая картина была отличной от описанной выше и неоднозначной. Дифференциальную диагностику проводили между спинальной мышечной атрофией Верднига–Гоффманна и врожденными структурными миопатиями. Эпилепсия носила доброкачественный характер и не была учтена как один из признаков заболевания. Морфологическая картина мышечного биоптата соответствовала болезни центрального стержня. Тем не менее сочетание клинических, морфологических и молекулярно-генетических данных у описанной нами пациентки 7 нельзя считать однозначно противоречивым. До настоящего времени механизм и время появления стержневых структур, обнаруживаемых при морфологическом исследовании, до конца не изучены [2]. Предполагают, что это преимущественно обусловлено нарушением функциональной активности митохондрий. Изучение биоптатов мышечной ткани при различных формах врожденных миопатий/миодистрофий на разных стадиях патологического процесса возможно расширит представления о взаимодействиях и последовательности вовлечения различных белков и структур мышечной ткани в патологический процесс.
У пациента 8 не было выявлено клинически значимых генетических вариантов в генах, связанных с развитием нервно-мышечных заболеваний, однако это может быть обусловлено техническими ограничениями метода высокопроизводительного секвенирования.

Отсутствие мутаций в гене RYR1 у двух пациентов (пациенты 7 и 8) с направляющим диагнозом врожденной миопатии/миодистрофии и морфологическими признаками центрального стержня подтверждает необходимость проведения расширенного молекулярно-генетического исследования этой подгруппы пациентов. В то же время при наличии дополнительных клинических симптомов, редких для определенного заболевания (в нашем случае у пациента 7 — наличие судорог), вероятность выявления иных молекулярно-генетических нарушений повышается. Это так же подтверждает необходимость проведения исследований, направленных на изучение патогенетических механизмов и их морфологических проявлений при врожденных миопатиях и миодистрофических процессах.

Были также выявлены корреляции между значениями активности КФК и обнаруженными мутациями. Уровень КФК, как правило, позволяет предположить локализацию поражения при нервно-мышечных заболеваниях и свидетельствует об остроте и длительности патологического процесса при поражении мышц. Мутации в гене RYR1 обнаружены только у пациентов с нормальным уровнем КФК. Наибольшее повышение уровня данного фермента выявлено у пациента с frameshift-мутацией в гомозиготном состоянии в гене SEPN1 и у пациента с мутациями в гене LAMA2, ассоциированном с наиболее тяжелой формой врожденной миопатии. Возможно, что уровень КФК служит своеобразным маркером патогенности молекулярно-генетического нарушения (степени влияния на наличие и функцию белкового продукта гена), приводящего к развитию заболевания и возникновению вторичных миодистрофических процессов.

ВЫВОДЫ

Полученные результаты еще раз подтверждают генетическую гетерогенность миопатий, характеризующихся наличием морфологической картины стержневых структур мышечных волокон. Основными генетическими причинами развития стержневых миопатий у российских пациентов являются мутации в гене RYR1 и гене SEPN1, что согласуется с результатами зарубежных исследований. Большинство мутаций — 75% (6 пациентов из 8), выявленных у наших пациентов в этих двух генах, описаны ранее. Две мутации, обнаруженные нами впервые, требуют дальнейшего исследования для уточнения их клинического значения. Показано также, что морфологическая картина мышечного волокна не может служить единственным критерием дифференциальной диагностики врожденных миопатий. Морфологические признаки стержневых миопатий могут быть выявлены и при других формах врожденных миопатий/ миодистрофий. Это свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения клинических, морфологических и генетических корреляций для понимания патогенетических механизмов, что может быть важно при разработке эффективных методов терапии осложнений заболеваний. Отсутствие у пациентов с клинико-морфологической картиной стержневых миопатий мутаций в генах, ответственных за развитие врожденных миопатий, требует дальнейшего изучения.