Современные композиционные материалы и бонды, применяемые в реставрационной стоматологии, несмотря на высокие показатели адгезии и прочности имеют низкое сродство с нативной твердой тканью зуба по химическому составу и морфологической организации [1, 2]. Несоответствие по физико-химическим характеристикам искусственных материалов эмали и дентину зубов инициирует поиск новых композиционных соединений для реставрационной стоматологии [2, 3]. Одновременно с решением этой задачи ведется активный поиск способов улучшения интерфейса между используемыми стоматологическими материалами и твердой тканью зуба за счет новых бондинговых систем и буферных слоев, имеющих гибридный состав и позволяющих повысить долговечность реставрации [3–5]. Актуальными вопросами здесь становятся способы формирования химической связи композит/бонд/нативные ткани зуба [6].
Наилучшим решением задач формирования качественного интерфейса синтетический материал- эмаль/дентин стало создание биомиметического композита, имитирующего состав, структуру (в том числе наноструктуру) твердых тканей зуба [7–9]. Хорошо известно, что введение в состав биокомпозита аналога апатита эмали — нанокристаллического гидроксиапатита кальция (ГАП) с различной дефектной структурой позволяет улучшить интеграцию синтетических материалов [5, 10].
В то же время включение в состав биокомпозитов ряда полярных аминокислот эмалевого матрикса [11–14] позволяет создать имитацию биомиметическим материалом конкретного типа участка эмали или дентина зуба человека и улучшить адгезивные и прочностные характеристики [12, 15].

В свою очередь, оценка интеграции бонда с тканями зубов, а также анализ формирования интерфейса адгезив/ эмаль, адгезив/дентин могут быть проведены комплексом методов, среди которых выделяют инфракрасную Фурье спектроскопию (FTIR). Данный неразрушающий метод позволяет изучить молекулярное строение и тонкие структурные свойства объектов биологического происхождения на основе анализа присутствующих в ИК-спектрах молекулярных колебательных полос, специфичных для конкретного химического вещества [16]. С его помощью можно исследовать механизмы молекулярных превращений в биомиметических материалах [17, 18], стоматологических адгезивах [19], получить обширные и разнообразные сведения о молекулярном составе тканей зубов человека [6] и регистрировать новообразованные минеральные фазы [20]. Одновременно с этим включение в измерительную схему микроскопа, а также использование источника синхротронного излучения при исследовании биологических объектов позволяют собрать большие массивы спектров с микрообласти образца [17]. На основе собранного набора спектров появляется возможность сформировать ИК-микроспектроскопическое изображение объекта, одновременно богатое различной информацией о молекулярных связях в составе образца и их пространственном распределении.
Целью работы стало исследование молекулярно- химических особенностей формирования интерфейса стоматологический материал — биомиметический буферный слой — твердая ткань зуба человека на основе многомерной визуализации данных синхротронной ИК- микроспектроскопии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Подготовка материалов

Для получения биомиметических модельных материалов использовали описанную [21] родственную систему, содержащую: гиалуроновую кислоту (0,01–0,05 wt. %), L-гистидин (0,01–0,2 wt. %), L-лизин гидрохлорид (0,05–0,4 wt. %), L-аргинин гидрохлорид (0,2–1,6 wt. %), а также метиловый эфир этиленгликоля (30–85 wt. %), диглицидилдиметакрилат (1–15 wt. %), уретандиметакрилат (1–15 wt. %), спирт этиловый (2–20 wt. %) и воду (остальное). Выполненное исследование оптических и эмиссионных свойств предложенного биокомпозита, содержащего перечисленные аминокислоты, показало сродство свойств этого материала со свойствами, проявляемыми нативной эмалью и дентином [22]. Для формирования высокотропной к нативным тканям зуба среды в данную систему был добавлен синтетический карбонат-замещенный гидроксиапатит кальция (КГАП) в соотношении 1 мл смеси — 0,01 г КГАП, соответствующий по совокупному ряду характеристик апатиту эмали и дентина зуба человека [20].
Для фиксации описанной буферной системы использовали универсальный адгезив для биоактивной бондинговой системы, эффективно связывающийся с разработанными коммерческими материалами [23]. В данный универсальный адгезив для улучшения тропности добавили полученный в данной работе КГАП в соотношении 1 мл адгезива — 0,01 г КГАП. Смешивание компонента ГАП с составляющими буферной системы и адгезива осуществляли с использованием ультразвукового гомогенизатора QSonica55 (QSonica;США) в течение 30 с.
Интеграцию буферных слоев на основе биокомпозиционных материалов изучали на образцах зубов, удаленных у пациентов в возрасте 18–45 лет по ортодонтическим показаниям. Препарирование зубов и нанесение биомиметической буферной системы выполняли по следующей схеме.

На первом этапе проводили препарирование эмали и дентина с помощью микромоторного воздушного наконечника при скорости вращения стального шаровидного бора из легированной вольфрам- ванадиевой стали 4000 об./мин и водяным охлаждением для предотвращения перегрева зубного матрикса. Формирование полости под пломбу осуществляли до дентина с доводкой при малой скорости вращения. Сформированную полость промывали и высушивали потоком воздуха от компрессора.
На втором этапе осуществляли травление эмали в течение 60 с, используя гель для травления эмали на основе 37%-й фосфорной кислоты, с последующим ополаскиванием водой и сушкой потоком воздуха. Далее производили обработку дентина с использованием дентин- кондиционера [21] на основе смеси гиалуроновой кислоты (0,01–0,05 wt. %), L-гистидина (0,01–0,2 wt. %), L-лизина гидрохлорида (0,05–0,4 wt. %), L-аргинина гидрохлорида (0,2–1,6 wt. %), в течение 20–30 с, после чего осуществляи сушку поверхности полости.
На третьем этапе полученную в данной работе биокомпозиционную буферную систему равномерно распределяли в стенки сформированной полости и после 20 с высушивали с помощью воздушного компрессора. На подготовленную таким образом полость на поверхность буферного слоя наносили универсальный светоотверждаемый адгезив, содержащий КГАП, который подвергали последующей предварительной фотополимеризации в течение 20 с.
На заключительном четвертом этапе по истечении 1 мин на сформированный биомиметический буферный слой наносили коммерческий компомерный реставрационный материал, содержащий компоненты адгезива.

Учитывая требования методики исследования (ИК-микроспектроскопии) к геометрии образцов, мы подготовили плоскопараллельные сегменты образцов отреставрированных зубов, аналогично тем, которые были исследованы ранее [24].
В работе было изучено 7 плоскопараллельных сегментов образцов, приготовленных непосредственно перед исследованием.

Методика исследования образцов

Молекулярный состав образцов, а также области интерфейса стоматологический материал — биомиметический буферный слой — нативная твердая ткань зуба человека изучали с использованием синхротронной ИК-микроспектроскопии, с применением методики нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО). Исследование проводили на оборудовании канала инфракрасной микроспектроскопии (IRM) Австралийского синхротрона (Мельбурн, Австралия), имеющего в своем составе ИК-микроскоп Hyperion 3000 (Bruker; США) и приставку НПВО с германиевой призмой (Мельбурн, Австралия) [17]. На рис. 1А, Б выделенной прямоугольной областью показано изображение исследуемого участка интерфейса, от которого были получены ИК-спектры поглощения в области от 3800–
700 см^-1 (рис. 1В).
С использованием возможностей ИК-микроскопа и программного комплекса OPUS 7.5 (Bruker; США) на участке образца размером 100×100 мкм (рис. 1Б) с шагом 2 мкм получили совокупность ИК-спектров (выполнили молекулярное картирование), в результате чего построили одномерные ИК-изображения (ИК-карты) на основе цветового кодирования интенсивностей полос поглощения ИК-спектров (рис. 1Г). Синим цветом закодирована самая низкая интенсивность поглощения молекулярной группой, выбранной для картирования, в то время как красным показана самая высокая. Данные карты показывают распределение интенсивности молекулярной группы, следовательно, ее концентрации в конкретной точке исследуемого образца.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования участка межфазной границы (рис. 1Б) между светоотверждаемым стоматологическим материалом, биомиметическим композитом, а также эмалью и дентином зуба был идентифицирован набор основных колебательных мод в ИК-спектре (рис. 1В), которые могут выступать в роли спектроскопических сигнатур, отвечающих веществам, присутствующим в области интеграции.
Наиболее интенсивная полоса в ИК-спектре, расположенная в области 1163–981 см^–1, принадлежит к группе PO4 минеральной составляющей апатита эмали и дентина [22]. Следующая группа полос в ИК-спектре от 1700 до 1100 см^–1 относится к колебаниям протеинов, входящих в состав органической составляющей эмали/дентина, а также соединениям биомиметического композита (см. методику подготовки материалов). Наиболее интенсивные моды колебания данного диапазона принадлежат группам CH2–CH3 (1457 см^–1) коллагена и амидным полосам (1650 см^–1 (Amid I — C=O), 1550 см^–1 (Amid II — N–H) и 1245 см^–1 (Аmid III — CN stretching) [18, 19, 22]. Кроме этих полос в ИК-спектре присутствует мода в области 1725 см^–1, принадлежащая группе эфира (–COOCH3), входящего в состав стоматологического материала на основе БИС- ГМА [19].

На рис. 2А представлена ИК-карта распределения молекулярной группы РО4 на участке интерфейса (рис. 1Б). Характерный ИК-спектр, представленный на рис. 2Б, был получен из участка образца на границе эмаль/биомиметический слой. В данном спектре содержится колебание группы РО4 в области 1163–981 см^–1, присутствующей в составе апатита эмали/дентина зубов [19, 20] и биомиметическом материале. Исходя из полученных результатов можно заключить, что в области стоматологического материала не содержится фосфатных групп. Вся граничащая с эмалью область, где наблюдается ненулевая интенсивность активных колебаний спектра в диапазоне 1163–981 см^–1, имеет размеры ~30 мкм (рис. 3А, пунктирная линия).

Для получения дополнительной информации об участке с межфазной границей было сгенерировано ИК-изображение (рис. 3А). Эта ИК-карта представляет информацию о распределении интенсивности молекулярных групп CN, NH, C=O, CH2/CH3 в области 1718–1358 см^–1 (рис. 3Б), принадлежащих коллагену, а также компонентам Amid I и Amid II, относимых к органической составляющей эмали/дентина и входящих в состав биомиметического буферного слоя.
Анализ данных, представленных на ИК-карте (рис. 3А), позволяет предположить, что распределение органической составляющей в буферном биомиметическом слое по сравнению с распределением фосфатных групп более гомогенно. Эти данные согласуются с технологическими условиями подготовки образцов, а в частности с тем фактом, что в составе созданного биомиметического слоя доля гидроксиапатита меньше, чем доля органического компонента.

Как уже было отмечено, ИК-спектр, представленный на рис. 1В, содержит полосу поглощения, расположенную в области 1725 см^–1. Хорошо известно, что это колебание является характеристической особенностью ИК-спектров стоматологических цементов на основе БИС-ГМА и полиметилметакрилата и принадлежит молекулярной группе эфира (–COOCH3) [19]. Более того, данная полоса поглощения не перекрывается с другими колебаниями, что позволяет построить ИК-изображение (рис. 4А) на ее основе (рис. 4Б).
Созданная ИК-карта показывает пространственное распределение стоматологического материала в анализируемой области (рис. 4А). На рисунке видно, что максимальное распределение интенсивности колебательной моды группы эфира (–COOCH3) совпадает с наблюдаемым на оптическом снимке расположением материала (см. рис. 1Б).

Анализ полученного экспериментального спектра (см. рис. 1В) позволяет выделить интенсивную полосу поглощения группы Amid III в области 1269–1224 см^–1 и сформировать ИК-карту, относящуюся только к биомиметическому слою (рис. 5А). Следует отметить, что указанное колебание (рис. 5Б) не перекрывается с поглощением другими функциональными группами и может выступать реперной линией биомиметического композита.
Сопоставляя данные оптического изображения (см. рис. 1Б) и ИК-карты, представленной на рис. 5А, хорошо видно, что в основном молекулярная группа 1269–1224 см^–1 распределена лишь в узкой области образца, содержащей интерфейс светоотверждаемый материал — биомиметический буферный слой — эмаль/дентин человеческого зуба.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Использование ИК-спектроскопии для исследования стоматологических материалов [19], биомиметических композитов [20], а также нативной ткани зубов человека [6] позволяет зачастую охарактеризовать молекулярный состав образцов лишь интегрально. В отличие от результатов указанных работ одномерные изображения (ИК-карты), полученные нами на основе цветового кодирования интенсивностей четырех основных спектральных полос (1752–1704 см^–1, 1718–1358 см^–1, 1269–1224 см^–1, 1163–981 см^–1), позволяют наглядно визуализировать распределение молекулярных групп на анализированном участке образца, а также установить молекулярно-химическое взаимодействие, происходящее на границе интерфейса светоотверждаемый материал — биомиметический буферный слой — эмаль/дентин человеческого зуба.

Анализируя полученные нами ИК-изображения участка гетерофазной границы, следует отметить, что весьма интересным на ИК-карте фосфатной группы (см. рис. 2А) представляется участок, имеющий интенсивность от 1,0 до 7,0. Эта зона относится к биомиметическому переходному слою, содержащему синтезированный карбонат-замещенный гидроксиапатит кальция, включение которого в состав биомиметического слоя позволяет повысить его молекулярно-химическое сродство с анатомической основой зуба [20]. Благодаря включению КГАП в биомиметический слой на ИК-карте (см. рис. 2А) хорошо заметна межфазная граница только между биомиметическим слоем и стоматологическим материалом, где резкая градация по цвету определяется интенсивностью моды колебаний группы РО4 КГАП. При этом явно выраженный интерфейс нативная ткань — биомиметический композит отсутствует, что подтверждает высокое сродство последнего с эмалью и дентином.

Следует, однако, отметить, что анализа только лишь ИК- карты, отображающей распределение фосфатной группы, недостаточно для исследования процессов интеграции стоматологического материала с эмалью/дентином зуба человека с применением переходного биомиметического слоя. В области 1163–981 cм^–1 могут перекрываться полосы поглощения фосфатных групп (см. рис. 2Б) с колебаниями силикатов алюминия или оксида кремния, входящих в состав стоматологического материала [19, 25].
Однако рассмотрение границы интерфейса (см. рис. 1А и рис. 2А) не выявляет значимого присутствия данных соединений в анализируемой области спектра (рис. 2Б), что может отвечать их низкой концентрации в выбранной для анализа области.

В дополнение к ИК-карте, отображающей распределение фосфатной группы, ИК-изображение распределения колебаний в области 1718–1358 cм^–1, соотносимых с органической составляющей образца (см. рис. 3А), позволяет пространственно более точно указать границу интерфейса между эмалью и дентином. Как видно из рис. 3А, в области дентина характерно более высокое (красная область), по сравнению с эмалью (зеленая область), содержание органической составляющей, что соответствует известным данным [20].
В то же время, рассматривая вопрос о взаимодействии компомерного материала/биомиметического буферного слоя и нативных твердых тканей необходимо обратить внимание на тот факт, что область колебаний 1718–1358 cм^–1 в ИК-спектре содержит целый ряд перекрывающихся полос [18]. Это создает трудности для интерпретации результатов и препятствует получению однозначных выводов о типе взаимодействия в области интерфейса.
В свою очередь анализ ИК-карт на основе распределения молекулярной группы эфира (–COOCH₃) (см. рис. 4А) и группы Amid III (рис. 5A), которые не имеют перекрывания с другими колебательными полосами в ИК-спектре, позволяет нам сделать следующие заключения о характере гетерофазной границы биомиметическая система/естественная твердая ткань. Во-первых, хорошо видно, что область интеграции стоматологического материала с участком эмали, где перепад интенсивности колебательной моды –COOCH₃ от максимального до минимального, наблюдается на участке шириной ~14 мкм и накладывается на зону, в которой в большей степени преобладает органическая составляющая (рис. 4А, рис. 5А). Во-вторых, из анализа распределения интенсивности поглощения для группы Amid III (рис. 5А), присутствующей в составе биомиметического переходного слоя, следует, что внедренный биомиметический слой отделяет нативные твердые ткани от стоматологического материала.

Отметим, что все построенные ИК-изображения (см. рис. 2А, рис. 3А, рис. 4А, рис. 5А) наглядно отображают границу переходного слоя, в то время как иные методы визуализации показывают морфологическую картину на границе стоматологический материал/эмаль/дентин зубов [2, 4, 15], что не дает возможности анализировать переходные слои близкого состава в области интеграции.
Следует сказать, что одновременный анализ нескольких одномерных ИК-изображений молекулярных групп не всегда позволяет визуализировать взаимодействия, происходящие на гетерофазном интерфейсе между близкими по структуре материалами [6]. Это связано с ограничениями одномерного подхода к выявлению спектральных изменений при различении незначительных изменений в химической структуре. Однако неудобства могут быть преодолены за счет применения для анализа ИК-карт многомерных методов кластеризации, позволяющих эффективно систематизировать большое количество многокомпонентных ИК-спектров [26]. Используя этот подход, нам удалось проанализировать особенности сложного интерфейса стоматологический материал — биомиметический переходной слой — эмаль — дентин зуба человека. Кластерный анализ, выполненный с учетом всех особенностей в спектральных областях 1752–1704 cм^–1, 1718–1358 cм^–1, 1269–1224 cм^–1, 1163–981 cм^–1, обнаруживает, что взаимодействие между стоматологическим материалом и нативной твердой тканью зуба происходит посредством буферного слоя (рис. 6, показано пунктиром).

Распределение молекулярно-химических групп фосфатов, протеинов, амидов и компонентов эфира (рис. 6) показывает, что биомиметический слой между эмалью и коммерческим материалом связывается с частично деминерализованным эмалевым матриксом посредством образующегося буферного переходного подслоя, что может указывать на возникновение органоминерального взаимодействия в анализируемой области. В то же время из анализа данных (см. рис. 6) видно, что переходная область между биомиметическим слоем и дентином значительно шире. Это следствие более пористой структуры у дентина, по сравнению с эмалью [1, 2]. Что же касается формирования интерфейса между биомиметическим слоем и коммерческим стоматологическим материалом, то исходя из результатов кластеризации отчетливо видно, что существует тенденция проникновения органической и минеральной составляющих биомиметического буферного слоя в стоматологический светоотверждаемый адгезив с образованием переходного интерфейсного слоя.
Исходя из имеющихся данных можно предположить, что реальная величина переходного (интегрирующего) подслоя между биомиметическим композитом, стоматологическим материалом и твердой тканью зуба составляет 3–4 мкм, что согласуется с имеющимися научными представлениями [27].

Полученные на основе анализа всех ИК-изображений данные (см. рис. 2–рис. 6) доподлинно свидетельствуют о химической дифференциации функциональных групп всех материалов в области границы биомиметическая система/естественная твердая ткань и подтверждают эффективность выбранного подхода для анализа интеграции стоматологических цементов и биомиметических композитов нового поколения.
Следует отметить, что полученные нами данные справедливы лишь в рамках примененной нами при создании образцов методики тотального протравливания. Однако эти результаты могут быть справедливы и для тех методик кондиционирования твердых тканей (самопротравливания, самоадгезивных систем и т. д.), в которых используют компоненты, подобные по химическому воздействию или составу материалам, исследованным нами в работе.

ВЫВОДЫ

Продемонстрирована возможность применения молекулярной многомерной ИК-визуализации для анализа интеграции нового поколения биомиметических материалов, воспроизводящих минералорганический комплекс эмали с нативными твердыми тканями зуба человека. С применением ИК-картирования интенсивности конкретной функциональной молекулярной группы с использованием синхротронного излучения были найдены и визуализированы различия между здоровой тканью, стоматологическим материалом и биомиметическим переходным слоем в межфазных областях, а также определены расположение и концентрация функциональных групп, отвечающих процессам интеграции биомиметического композита и нативной твердой ткани зуба человека. Показано, что разработанная нами биомиметическая система, на основе нанокристаллического КГАП, полученного из биогенного источника кальция и комплекса основных полярных аминокислот, соответствующих органоминеральному комплексу зубов человека, способна образовывать функциональную связь с твердой тканью зуба человека. Полученные нами микроспектроскопические данные достоверно подтверждают химическую дифференциацию материалов и наличие органоминерального взаимодействия на границе биомиметическая система/естественная твердая ткань.