Оптический имиджинг in vivo все чаще используют в качестве метода визуализации в современных биомедицинских исследованиях [1, 2]. В ходе биоимиджинга происходит неинвазивное изучение животных объектов, в которых свет испускается в результате окисления молекулы люциферина (химическая реакция, катализируемая белком люциферазой), либо в ответ на возбуждение флуоресцентного белка светом из внешнего источника. Наиболее популярными на сегодняшний день оптическими репортерными белками являются флуоресцентные (GFP и подобные ему варианты разных цветов), а также биолюминесцентные из насекомых (FLuc) и морских организмов (RLuc, GLuc). Область применения биолюминесцентного и флуоресцентного имиджинга на их основе в медицине чрезвычайно обширна и включает (но не ограничивается) изучением функций генов, белок- белковых взаимодействий, развития патогенных процессов и онкогенеза, разработкой лекарственных препаратов и т. д. как на уровне отдельных клеток и тканей, так и у лабораторных животных в режиме реального времени [3].
Среди бесспорных достоинств существующих технологий флуоресцентного имиджинга — огромное разнообразие доступных белков всех спектральных оттенков, а также большой функциональный набор инструментов на их основе (в том числе фотоактивируемые, фотопереключаемые белки, сенсоры) [4]. Тем не менее при использовании флуоресцентных белков необходимо наличие внешнего излучения, в результате чего чувствительность методов снижается из-за помех автофлуоресценции, фототоксичности и наличия ненулевого фонового сигнала. Получение изображения высокого разрешения in vivo обычно сопровождается сложной инвазивной процедурой [5]. Биолюминесцентные системы лишены таких недостатков и поэтому успешно конкурируют с флуоресцентными белками. Для биолюминесцентного имиджинга быстро стал доступен уровень разрешения вплоть до единичной клетки внутри живого организма. Однако возможная токсичность, низкая стабильность и высокая стоимость синтетических люциферинов (субстратов биолюминесценции), которые необходимо инъекционно вводить в организм перед каждым анализом, усложняют проведение биолюминесцентного имиджинга.
Применение автономных люминесцентных систем, для которых биосинтез люциферина может быть воспроизведен методами генной инженерии в клетках исследуемого организма, может стать полноправной альтернативой существующим технологиям биоимиджинга in vivo. К сожалению, среди тысяч (~10³) светящихся видов и около 40 (~10²) различных механизмов свечения на данный момент известны структуры лишь 10 люциферинов (светящихся субстратов) и 7 семейств генов люцифераз (~10¹) [6, 7], а полный путь биосинтеза люциферина определен только для бактериальной [3] и, с недавнего времени, для грибной [8] биолюминесцентных систем. Есть сведения о том, что D-люциферин светляка в организме насекомых синтезируется из п-бензохинона и L-цистеина [9], однако соответствующие этим процессам белки пока не выделены. Белок LRE, регенерирующий D-люциферин из оксилюциферина [10, 11], не может стать полноценной заменой биосинтезу люминесцентного субстрата из распространенных метаболитов. Таким образом, на данный момент реальными кандидатами для создания новых автономных методов визуализации являются только две люминесцентные системы.

Бактериальная биолюминесценция: от прокариот к эукариотам

Биолюминесцентные бактерии — это самые распространенные светящиеся организмы; встречаются они в море и на суше. Биолюминесценция бактерий хорошо изучена: за их свечение отвечает кассета из пяти генов luxCDABE. LuxAB кодирует гетеродимерную бактериальную люциферазу, luxC, luxD и luxE — три белка (редуктазу, трансферазу и синтазу), осуществляющие синтез субстрата (додеканаля) для реакции биолюминесценции (рисунокА). Также дополнительно в кассету может быть включен ген frp, кодирующий флавинредуктазу, которая отвечает за синтез флавинмононуклеотида FMNH2, необходимого компонента реакции люминесценции [12]. Таким образом, бактериальная биолюминесцентная система может быть полностью перенесена в новый организм, который будет светиться без добавления люциферина извне. Из недостатков этой системы необходимо отметить зависимость от наличия FMNH2 и жирных альдегидов, невысокую яркость, и, самое главное, синий цвет люминесценции (490 нм), неудобный для имиджинга глубоких тканей in vivo.
Гетерологическая экспрессия генов автономной бактериальной люминесцентной системы была быстро и успешно реализована в прокариотических клетках [13], однако принципиальной сложностью для ее переноса в клетки эукариот стали большой размер оперона, его мультигенная организация и токсичность системы для организма-хозяина (вследствие цитотоксичности додеканаля). Для решения этой задачи появилась необходимость в проведении масштабной перестройки оперона.
Первым успехом на пути переноса автономной бактериальной люминесценции в эукариоты стало получение трансгенных светящихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae [14]. Повышение эффективности экспрессии было достигнуто путем оптимизации кодонов и добавления линкерных участков. Немаловажным стал переход от люциферазы морских бактерий Vibrio harveyi к термостабильной люциферазе наземного вида Photorhabdus luminescens, сохраняющей активность при 37 °C. Тем не менее свечение было неярким и нестабильным. Первые удачные адаптация и оптимизация генов только бактериальной люциферазы luxAB для клеток HEK293 были реализованы спустя 2 года [15]. Наконец, в 2010 г. было описано первое применение автономной бактериальной люминесценции в клетках млекопитающих для биоимиджинга in vivo с чувствительностью порядка 20 000 клеток [16]. Параллельно были получены первые растения, светящиеся автономно [17].

Несмотря на проделанную работу по дальнейшей оптимизации и сокращению оперона для применения в клетках млекопитающих (например, [18]), существует ограниченное количество примеров применения бактериальной биолюминесценции для биоимиджинга эукариот [19–21] вследствие ее невысокой яркости относительно неавтономных систем, например D-люциферинзависимых. Недавно благодаря дополнительным изменениям в опероне и использованию индивидуальных плазмид для настройки экспрессии генов в оптимальном соотношении удалось разработать новую бактериальную систему «co Lux», яркость которой для одноклеточного имиджинга клеток HEK293 сравнима с таковой для люциферазы FLuc [22, 23]. Невысокая концентрация длинноцепочечного альдегида не приводит к неблагоприятным токсическим эффектам. Единственным заметным эффектом стало уменьшение концентрации NADPH в светящихся клетках (вследствие повышенного расхода в ходе реакции биолюминесценции). Также появился первый пример автономного биоимиджинга на основе пары luxAB и желтого флуоресцентного белка YPET [24].

Автономная биолюминесценция грибов: альтернатива бактериям

Изучение светящихся грибов имеет многовековую историю, однако впервые структура люциферина грибов 3-гидроксигиспидина была установлена в 2015 г. [25], а в 2018 г. была описана люцифераза грибов и полный цикл биосинтеза люциферина из распространенного вторичного метаболита растений — кофейной кислоты и сразу же показан пример применения данной системы для создания автономно светящихся дрожжей [8] (рисунокБ).
В основе люминесценции грибов лежат гены hisps, h3h, luz (люцифераза) и cph. Hisps, h3h кодируют белки, которые последовательно собирают гиспидин из кофейной кислоты (гиспидинсинтаза) и люциферин (3-гидроксигиспидин) соответственно. Luz кодирует люциферазу, а cph — белок, перерабатывающий продукт окисления люциферина (оксилюциферин) обратно в кофейную кислоту. Недавно было показано, что экспрессии лишь трех генов hisps, h3h и luz в растениях Nicotiana tabacum достаточно для создания ярких автономно светящихся растений [26, 27]. В отличие от бактериальной люминесцентной системы, здесь не требуется серьезной оптимизации кодонного состава генов для получения трансгенных растений, поскольку генетический материал изначально берется из эукариот и новый биосинтетический цикл хорошо встраивается в метаболизм организма-хозяина.
Однако первый пример получения автономно светящихся клеток млекопитающих HEK293T на основе генов биолюминесценции грибов потребовал использования смеси уже восьми плазмид [26]. Полученные клетки светились нестабильно и не очень ярко, что указывает на очевидную необходимость оптимизации применяемых генетических конструкций для получения более ярких вариантов. Суммарная длина используемых на данный момент кодирующих последовательностей бактериальной системы биолюминесценции составляет 6,2 тыс. пар оснований (т.п.о.), тогда как для последовательностей грибной системы это значение составляет около 12,8 т.п.о., но оно может быть сокращено до 9,6 т.п.о. в случае использования альтернативных ферментов. В то же время существенным отличием автономной биолюминесценции грибов является максимум свечения в области 540 нм (желтый), что делает эту систему более перспективной для применения в биоимиджинге in vivo.

ВЫВОДЫ

Количество инструментов для оптического имиджинга в медицинских исследованиях постоянно увеличивается. По нашему мнению, более чувствительный in vivo биолюминесцентный имиджинг в будущем может составить конкуренцию устоявшимся флуоресцентным технологиям. Активно изучаемые в данный момент системы автономной биолюминесценции на основе кассет генов бактерий или грибов способны встать в один ряд с существующими.