Болезни печени включают широкий спектр патологий: от жирового гепатоза (стеатоза) и гепатита до цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Они широко распространены во всем мире и имеют высокую социальную значимость [1]. Печеночная недостаточность, особенно ее тяжелая форма, вызванная циррозом печени, занимает 12-е место среди причин смертельных случаев в мире [2]. Циррозы не только приводят к нарушениям функции печени, но и вызывают развитие печеночного энцефалопатического синдрома, представляющего собой нарушение когнитивных функций и психомоторики. Печеночный синдром может послужить причиной инвалидизации больного [3]. За последние 10 лет неалкогольная жировая дисфункция печени стала основным типом ее хронических поражений: она выявлена более чем у 30% населения [4]. Развитие жирового гепатоза статистически ассоциировано с сахарным диабетом, сердечно-сосудистыми заболеваниями, ожирением. Его возникновение провоцируют применение лекарственных препаратов и воздействие токсических соединений. Выявлена связь стеатоза с другими хроническими заболеваниями, такими как сонное апное, колоректальный рак, остеопороз, псориаз и эндокринные нарушения [5]. Неалкогольная жировая дистрофия печени представляет собой неспецифическую реакцию гепатоцитов на токсическое воздействие. Основной характеристикой этого состояния является избыточное накопление жира в печени. При сильной жировой дистрофии можно наблюдать жировые кисты и разрастание соединительной ткани, что приводит к функциональным нарушениям печени и связанным с ними системным патологиям.
Множество сигнальных и метаболических путей, участвующих в регуляции работы печени, дают возможность выбора терапевтических мишеней [6]. В качестве гепатопротекторных соединений в составе комплексной терапии применяют различные агенты: антибиотики (неомицин, паромицин, метронидазол, ванкомицин, рифаксимин) [7] и дисахариды (лактулоза, лактитол) с низкой способностью к всасыванию [8], природные аминокислоты и метаболиты азотного обмена (орнитина аспартат, аминокислоты с разветвленной цепью) [9], модуляторы бактериальной кишечной микрофлоры (пробиотики, синбиотики) [10], производные желчных кислот и β-агонисты рецепторов тиреоидных гормонов [11]. Однако существующие в настоящее время средства профилактики и лечения патологий печени различной степени выраженности и этиологии включают в основном симптоматические препараты довольно широкого диапазона действия, значительная часть которых либо не рекомендована для длительного применения, либо не разрешена к использованию в ряде стран. Среди лекарственных средств с высокой доказанной эффективностью и безопасностью длительного применения в качестве гепатопротекторов можно выделить эссенциальные фосфолипиды (ЭФЛ), урсодезоксихолевую кислоту (УДХЛ), препараты расторопши, адеметионин [12].

Природные полифенолы широко применяют в настоящее время в качестве антиоксидантных фармакологических субстанций, оказывающих общее противовоспалительное, нейро- и кардиопротекторное действия, моделирующих аутофагию и защищающих митохондрии от патологических событий, индуцируя сигнальные пути выживания клеток [13]. Успех применения полифенолов для лечения заболеваний, имеющих сложносоставную этиологию (нейродегенеративных расстройств различного происхождения, аутоиммунных, аллергических, онкологических и прионных), связан с их непосредственным влиянием на клетки защитных систем организма и индукцией апоптоза клеток основных тканей [14]. Полифенолы растительного происхождения оказывают влияние на окислительный стресс, липидный обмен, инсулинорезистентность и воспаление, которые являются наиболее важными патологическими процессами в этиологии заболеваний печени [1]. Показано положительное действие некоторых полифенолов на функциональное состояние печени в модели токсического гепатита, индуцированного различными гепатотоксикантами. Так, природный флавоноид кверцетин защищал печень от дисфункции, индуцированной тетрахлорметаном (CCl4). Механизм реализации его эффекта авторы связывали с антиоксидантным действием, а также с подавлением ряда реакций при участии NF-κB, что приводило к уменьшению уровня секреции воспалительных цитокинов печени [15]. Еще один флавоноид, пуэрарин, также заметно ослаблял последствия CCl4-индуцированной гепатотоксичности за счет снижения продукции активных форм кислорода (АФК), активации антиоксидантной ферментной системы и регулирования экспрессии генов, ответственных за биосинтез и метаболизм липидов в печени [16]. Флавоноид байкалин, выделенный из шлемника (Scutellaria radix), оказался эффективным в защите печени от ацетаминофен-индуцированного токсического повреждения за счет подавления сигнализации внеклеточного сигнал-регулируемого киназного пути [17].

Введение тиоацетамида (ТАА) приводит к индукции фиброза и цирроза печени у крыс и мышей. Через две недели после начала введения ТАА в ряде исследований наблюдали значительное повышение активности печеночных аминотрансфераз (аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ)), указывающее на развитие патологического процесса. К концу четвёртой недели активность АСТ и АЛТ снижалась до нормальных значений на фоне увеличения содержания коллагена в ткани печени [18]. Окислительный стресс считают основным фактором в ТАА-индуцированном фиброзном перерождении печени, вызванном токсическим метаболитом тиоацетамид-S-оксидом, образующимся при биотрансформации ТАА ферментами семейства цитохром P450 (CYP1A2, CYP2C6, CYP2E1, CYP3A2) и микросомальными ФАД-содержащими монооксигеназами [19, 20]. Согласно опубликованным данным, ресвератрол значительно снижал повреждения печени, вызванные ТАА. Механизм его действия обусловлен снижением интенсивности окислительного стресса, подавление NF-κB-зависимого каскада реакций и апоптоза [21].
Целью представленной работы было исследовать потенциальное гепатопротекторное действие полифенолов стильбеновой природы — ресвератрола (РСВ) и пиносильвина (ПС) — и дигидрофлавонола дигидромирицетина (ДГМ) на функциональное состояние и гистологическую картину печени в модели токсического гепатита крыс, вызываемого ТАА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на самцах белых крыс линии Wistar (начальный вес животных составлял 190–230 г), полученных из питомника «Столбовая» (Московская обл.) с условиями содержания, соответствующими требованиям GLP. Животных на протяжении эксперимента содержали в условиях вивария с естественным световым режимом (12 ч день, 12 ч ночь) на полнорационной сбалансированной по содержанию питательных веществ диете для лабораторных животных, согласно ГОСТ Р502580092. Работу осуществляли в соответствии с требованиями Руководства по проведению доклинических исследований (в 2-х частях, под редакцией А. Н. Миронова (действующая редакция)) и необходимых нормативных документов.
Для индукции токсического повреждения печени и развития печеночной патологии животным ежедневно алиментарным путем вводили водный 0,05%-й раствор ТАА, который показал высокую эффективность при разработке модели печеночной патологии [18, 20]. Введение ТАА приводит к индукции фиброза и цирроза печени у крыс и мышей.

Животных разделили на группы по 10 животных:
1 — группа интактных животных, которых содержали на обычном пищевом рационе;
2 — группа контрольных животных, получавших с питьем 0,05%-й ТАА;
3 — экспериментальная группа, получавшая с питьем 0,05%-й ТАА на фоне введения РСВ (15 мг на 1 кг веса перорально);
4 — экспериментальная группа, получавшая с питьем 0,05%-й ТАА на фоне введения ДГМ (10 мг на 1 кг веса перорально);
5 — экспериментальная группа, получавшая с питьем 0,05%-й ТАА на фоне введения ПС (5 мг на 1 кг веса перорально).

Введение животным ТАА проводили в течение 30 дней. Осмотр животных проводили ежедневно, взвешивание осуществляли каждые три дня. Полифенолы были выделены и очищены из растительного сырья (биоматериалов хвойных пород, доступных на территории РФ). Полифенолы вводили в виде раствора в водном 2%-м крахмальном геле каждый день внутрижелудочно через зонд, после приема пищи, из расчета не более 0,4 мл на каждое животное. Отбор крови и образцов печени животных для биохимических и гистологических исследований проводили на 10-е, 20-е и 30-е сутки эксперимента. Образцы тканей печени и крови отбирали немедленно после вскрытия. Полученные образцы сыворотки крови исследовали с помощью биохимического анализатора AU 480 (BeckmanCoulter; США) на содержание прямого билирубина, активности ферментов (аминотрансфераз АСТ и АЛТ). Биохимический анализ крови экспериментальных животных выполняли на базе независимой ветеринарной лаборатории «ШансБио» (участник Федеральной системы внешнего контроля качества лабораторных исследований МЗ РФ ФСВОК, код участника 10705) с применением анализаторов AU 480 (BeckmanCoulter; США), биохимической системы BA 400 (BioSystems; Испания) и Abacus Vet 4 (Diatron; Австрия). Индекс печени определяли как соотношение массы органа к массе тела (в %). Для гистологических исследований брали кусочки печени из нижней части правой доли. Гистологические препараты (тонкие срезы) получали путем изготовления парафинированных микросрезов согласно методике, описанной в работе [22]. Приготовление препаратов включало следующие этапы.

1. Подготовка органов для заливки в раствор 4%-го параформальдегида (ПФА) в фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Отобранные при вскрытии органы крыс помещали в планшеты с разлитым 4%-м ПФА на 30 мин. Каждые 30 мин производили трехкратную смену 4%-го ПФА на новый раствор, после чего оставляли на 24 ч при температуре +4 °С.
2. Подготовка органов к заливке в уплотняющие среды по следующей схеме: а) промывание 3 раза ФСБ по 30 мин при +4 °С; б) инкубация в 70%-м этаноле, 3 смены по 30 мин; в) инкубация в 80%-м этаноле 40 мин; г) инкубация в смеси: 82% этанол–бутанол (3 : 1) 40 мин; д) инкубация в смеси: 96% этанол–бутанол (1 : 1) 50 мин; е) инкубация в смеси: 100% этанол (абсол.) — бутанол (1 : 3) 50 мин; ж) инкубация в бутаноле I 1 ч; з) инкубация в бутаноле II — 1 ч.
3. Заливка органов в парафин. Использовали парафин температуры +60 °С, заливали его в подготовленную и нагретую форму из фольги и помещали туда образец. Сушили блоки в течение 10–12 ч.
4. Приготовление срезов для окрашивания. Охлажденные парафиновые блоки закрепляли на деревянном блоке при помощи растопленного парафина. Срезы делали на микротоме санном МС-2 (ХЗ «Точмедприбор»; Россия). Затем получившиеся срезы крепили на предметное стекло и помещали в сушилку на 30 мин при температуре +40 °С.
5. Покраска срезов. Срезы перед окрашиванием освобождали от парафина с помощью толуола или ксилола. Окрашивание срезов проводили в системе «гематокислин–эозин». После окрашивания на срезы наносили Immuno Mount-DABCOTM (Genetex; Канада) и сверху помещали покровное стекло.
Статистические расчеты производили на персональном компьютере с использованием программного пакета STATISTICA 6.0 (Dell; США). Данные представляли как среднюю арифметическую величину и стандартную ошибку средней (M ± m). Для оценки различий параметров между группами животных использовали параметрический t-критерий Стьюдента. Различия считали значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка динамики веса животных показала, что для интактных животных (группа 1) было характерно увеличение массы тела на протяжении всего периода эксперимента (рис. 1, 1). На фоне введения ТАА независимо от введения полифенолов вес животных заметно снижался в первую неделю эксперимента. Введение полифенолов обеспечило положительную тенденцию увеличения массы животных по сравнению с контрольной группой, начиная с третьей недели, что могло свидетельствовать о позитивном воздействии полифенолов на функции печени. К концу эксперимента индекс печени (соотношение массы органа и массы тела животного) возрастал с 3,65 ± 0,2 у интактных животных до 5,1 ± 0,3 у животных контрольной группы, получавших ТАА. В группах, получавших полифенолы наряду с ТАА, индекс печени составлял 4,5 ± 0,19, 4,6 ± 0,23 и 4,4 ± 0,16 для групп животных, которым вводили РСВ, ДГМ и ПС соответственно. Снижение индекса печени у животных, получавших полифенолы, свидетельствовало о снижении патологических изменений, вызываемых введением ТАА.
Анализ динамики биохимических показателей крови экспериментальных животных, получающих ТАА, показал, что уровень билирубина в крови увеличивался почти в 10 раз, в то время как введение полифенолов уменьшало этот показатель в 2–4 раза (таблица). Следует отметить, что эффект снижения уровня билирубина в сыворотке крови проявлялся на протяжении всего периода введения полифенолов. Содержание общего белка и глюкозы несколько снижалось во всех группах, получавших ТАА, независимо от введения полифенолов (достоверных различий нет, данные не представлены).
Активность АСТ достоверно повышалась (p < 0,05) в сыворотке крови животных всех групп, получавших ТАА, по сравнению с контролем (рис. 2А). Почти двукратное повышение АСТ у животных контрольной группы к 20-му дню и далее некоторое снижение к 30-му дню эксперимента характерно для этой модели гепатотоксичности и хорошо согласуется с данными других авторов [18, 21]. На фоне полифенолов показатели АСТ были ниже, а к концу эксперимента в группах, получавших РСВ и ПС, можно было наблюдать достоверное снижение этого показателя по сравнению с контрольной группой (рис. 2А).
Активность АЛТ при введении ТАА в контрольной группе достоверно повышалась (p < 0,05) на 40% только после 20-го дня эксперимента (рис. 2Б). Было отмечено также увеличение активности АЛТ в середине эксперимента у животных, получавших РСВ на фоне ТАА (около 30%), и небольшое повышение (20%) у животных с введением ПС к 30-му дню эксперимента. В группе, получавшей ДГМ, значения АЛТ на протяжении всего периода наблюдения не отличались от таковых у интактных животных. К концу эксперимента показатели АЛТ нормализовались у животных группы, получавшей РСВ (рис. 2Б).
На следующем этапе работ были проанализированы гистологические срезы печени животных всех исследованных экспериментальных групп. Гепатоциты интактных животных характеризовались нормальной цитоморфологией с хорошо выраженными ядрами и умеренным полиморфизмом ткани (рис. 3А). Интоксикация гепатотоксикантом ТАА приводила к появлению диапедезных кровоизлияний (рис. 3Б) и возникновению мелкокапельной жировой дистрофии. Полученная нами гистологическая картина соответствовала известным симптомам патологии печени после действия ксенобиотиков (ТАА и CCl4) [23]. Введение животным полифенолов (рис. 3Г–Е) предотвращало существенную деградацию ткани печени: нарушение структуры гепатоцитов, появление гематом и очагов воспаления, содержащих мелкоклеточные образования (рис. 3Г–Е).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Положительное влияние целого ряда природных полифенолов на индуцированные гепатотоксикантами патологии печени хорошо известно. Так, флавоноид кверцетин оказывал защитное действие при индуцированном ССl4 токсическом гепатите у мышей [15]. Полифенол диеккол из бурой водоросли Eisenia bicyclis (Kjellman) Setchell защищал печень мышей от ССl4-индуцированного разрушения через регуляцию генов, отвечающих за экспрессию апоптических белков Bax и Bcl-xl [24]. В другой работе полифенол изорамнетин-3-O-галактозид, изолированный из полыни волосовидной (Artemisia capillaris Thunberg), также оказывал положительное действие при CCl4-индуцированной патологии печени через уменьшение уровня фосфорилированной c-JNK, внеклеточной сигнал-регулирующей киназы (ERK) и p38 MAPK [25]. Флавоноид байкалин оказывал значительный защитный эффект при ацетаминофен-индуцированном гепатите у мышей [17]. В используемой в нашей работе модели токсического повреждения печени, индуцируемого ТАА, защитное влияние полифенолов исследовано только на примере полифенола стильбенового ряда РСВ. В недавней работе [21] было продемонстрировано индуцированное РСВ ингибирование воспалительного процесса и окислительного стресса в тканях печени крыс за счет снижения уровня экспрессии NF-κB и CYP2E1 и увеличения апоптоза некротизированных гепатоцитов. Кроме того, в работе была показана стабилизация биохимических показателей крови (АЛТ и АСТ) и нормализация тканевой архитектуры печени опытных животных, получающих РСВ (10 мг на кг веса животных). Учитывая эти данные, можно предположить, что в наших исследованиях имеет место похожий механизм действия РСВ, основанный на его мощном антиоксидантном действии. Относительно эффектов ДГМ и ПС в модели индукции токсического гепатита у лабораторных животных литературных данных нет. Существуют лишь указания на проапоптическое действие ДГМ на клетки HepG2 гепатоцеллюлярной карциномы [26]. Учитывая высокую биологическую активность этих полифенолов в различных моделях заболеваний, можно предположить, что исследованное нами защитное действие ДГМ и ПС при ТАА-индуцированной гепатопатологии также может быть основано на их мощном антиоксидантном потенциале.
В работе [27] показано, что диосцин (сапонин из диоскореи японской Dioscorea nipponica Makino), подобно исследованным нами полифенолам, ослабляет гепатотоксичность ТАА, увеличивая содержание в клетках печени глутатиона и активность ферментов антиоксидантной защиты глутатионпероксидазы и суперкосиддисмутазы, снижая содержание малонового диальдегида. Введение животным диосцина увеличивало экспрессию FXR и p-AMPKα, а также Nrf2, HO-1, NQO-1 и GCLM. Напротив, содержание в клетках печени мРНК провоспалительных факторов NF-κB (p65), ICAM 1, HMGB1, COX-2, TNFα, IL1β и IL6 под воздействием введения диосцина снижалось, что, по мнению авторов, является доказательством способности этого природного соединения подавлять гепатотоксичность ТАА за счет ослабления работы сигнального пути FXR/AMPK в гепатоцитах.

ВЫВОДЫ

Проведенные исследования показали, что природные полифенолы класса дигидрофлавонолов (ДГМ) и стильбенов (РСВ и ПС) оказывают положительное воздействие на функции печени в модели экспериментального токсического гепатоза и могут быть рассмотрены в качестве потенциальных гепатопротекторов.