Нарушения липидного обмена, в том числе наследственного характера — ключевой фактор риска атеросклероза и его осложнений. Разработка современных методов исследования метаболома, таких как хромато-масс-спектрометрия, позволяет существенно расширить представления об особенностях липидного обмена в различных клинических ситуациях.
Обнаружено, что значимую роль здесь могут играть сфигмолипиды (такие как сфингомиелины, церамиды, сфингозин, сфинганин сфингозин-1-фосфат (С1Ф) и т. д.) [1]. Изменение соотношения различных сфинголипидов выявляют при некоторых метаболических, генетических и аутоиммунных заболеваниях (болезни Фабри, Ниманна–Пика, Гоше и др., некоторых видах эпилепсии, мигрени, болезни Альцгеймера).
Идет активное изучение особенностей липидома при сердечно-сосудистых заболеваниях. Показано прогностическое значение некоторых липидных фракций, преимущественно церамидов, при остром коронарном синдроме. В качестве возможных маркеров риска рассматривают соотношения церамидов C 16 : 0, C 20 : 0, C 24 : 1 и их отношения к С 24 : 0.
Прогностическую значимость церамидов оценивали в проспективных исследованиях. Уровень церамидов определяли у больных с острым коронарным синдромом [2]. Было обнаружено, что уровень сфингомиелинов, сфингозина, сфингозин-1-фосфата и церамида может существенно отличаться у больных с острыми и хроническими формами ИБС [3].
В то же время особенности липидома у больных с наследственными дислипидемиями не исследованы. Нет пока и убедительных данных о динамике уровня сфинголипидов и церамидов на фоне липидснижающей терапии, есть лишь единичные случаи сравнения уровня сфинголипидов у пациентов без терапии и на фоне липидснижающей терапии [4, 5].
Целью настоящего исследования было изучить особенности сфинголипидов у пациентов, имеющих различную клиническую вероятность семейной гиперлипидемии.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на базе Городской клинической больницы № 51 г. Москвы в марте–октябре 2019 г. В исследовании приняли участие 35 пациентов. В обследованной группе было 15 мужчин (42,9%) и 20 женщин (57,1%), средний возраст пациентов составил 49,8 ± 9,96 лет. Критерии включения: ранние проявления атеросклероза — ишемической болезни сердца, симптомного периферического атеросклероза или цереброваскулярной болезни с дебютом заболевания в возрасте до 55 лет у мужчин и до 60 лет у женщин и/или дислипидемиями (уровень ЛНП > 4,9 ммоль/л). Критерии исключения: острый инфаркт миокарда, острый инсульт, сахарный диабет, вторичные дислипидемии. В исследование не включали пациентов, получавших на момент обследования липидснижающую терапию.
У 16 пациентов на момент включения в исследование была артериальная гипертензия (45,7%), у 10 (28,6%) — ИБС, у одного пациента (2,9%) — симптомный периферический атеросклероз. Девятнадцать пациентов (54,3%) имели отягощенный по сердечно-сосудистым заболеваниям семейный анамнез. Девять пациентов (25,7%) курили ранее, но прекратили курение до включения в исследование, 8 пациентов курили на момент включения в исследование (22,9%).
Вероятность наличия семейной гиперхолестеринемии (СГХС) рассчитывали по шкале сети голландских липидных клиник. У 10 пациентов вероятность СГХС оценивали как низкую (1–2 балла), у 22 пациентов диагноз расценивали как вероятную СГХС (3–5 баллов). У 3 пациентов была возможная или определенная СГХС (2 пациента — 6 баллов, один пациент — 9 баллов).
Взятие крови для биохимического и масс- спектрометрического анализа осуществляли в день включения пациентов в исследование (утром натощак, после 12-часового голодания). Взятие крови проводили из кубитальной вены в стерильные пробирки типа «вакутейнер». Сыворотку получали путем центрифугирования крови на скорости 3000 об./мин в течение 15 мин. Определяли параметры со следующими референсными значениями: общий холестерин (OXС, 2,0–5,2 ммоль/л), холестерин липопротеинов низкой плотности (ХС ЛНП, до 3,3 ммоль/л), липопротеинов высокой плотности (ХС ЛВП, 0,91–1,56 ммоль/л), триглицеридов сыворотки крови (ТГ, 0,50–1,70 ммоль/л). Для определения параметров сыворотки использовали биохимический анализатор CLIMA MC-15 (RAL; Испания).
Липиды выделяли из плазмы по методу Блайя–Дайера [6]. Масс-спектрометрическое детектирование молекулярных видов сфингомиелинов, церамидов и сфингоидных оснований (сфингозина и сфинганина), а также галактозилцерамидов проводили с помощью прибора TSQ Endura (Thermo Fisher Scientific; Германия) в режиме мониторинга множественных реакций (ММР) при давлении в ячейке соударений 1,5 мТорр. Разрешение на Q1 и Q3 составляло 1,2 Да.
Для церамидов фрагментацию исходных протонированных и дегидратированных молекул проводили при энергии 25 эВ до иона с отношением массы к заряду (m/z) 264,4 Да, время удержания составляло 25 мс.
Для сфингомиелинов фрагментацию исходных протонированных молекул проводили при энергии 25 эВ до иона с m/z 184,1 Да, время удержания составляло 25 мс.
Для сфингозина и его дейтерированного стандарта (d7, Avanti; США) фрагментацию протонированных молекул проводили при энергии 12,5 эВ до ионов с m/z 264,4 и 259,3 Да соответственно, время удержания составляло 25 мс. Для сфинганина фрагментацию исходной протонированной молекулы проводили при энергии 12,5 эВ до иона с m/z 266,4 Да, время удержания составляло 50 мс.
Для галактозилцеромида d18 : 1/18 : 0: ион [M + H]+ с массой 728,5 Да.
Использовали следующие параметры источника ионизации: температура нагревателя 300 °С, температура капилляра 340 °С, поток газа завесы — 45 п.е. (приборные единицы), поток вспомогательного газа — 13 п.е., поток продувочного газа — 1 п.е.
В качестве стандартов использовали сфингозин d7, сфинганин, сфингомиелин d18 : 1/16 : 0, сфингомиелин d18 : 1/18 : 0, церамид d18 : 1/16 : 0, церамид d18 : 1/18 : 1, церамид d18 : 1/18 : 0, церамид d18 : 1/24 : 1, церамид d18 : 1/24 : 0, галактозилцерамид d18 : 1/18 : 0 (Avanti; США).

Хроматографическое разделение

Хроматографическое разделение проводили с использованием системы Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific; Германия) на колонке Eclipse Plus C8 3.0 × 150 мм (Agilent; США), размер частиц 3,5 мкм. Температура составляла 50 °С, поток — 400 мкл/мин.
При определении сфингозина, церамидов и сфингомиелина использовали следующие составы мобильных фаз: фаза А — вода + 0,1% (по объему) муравьиной кислоты, фаза Б — метанол + 0,1% (по объему) муравьиной кислоты (0,7 мин 55% фазы Б, 100% фазы Б к 6, 7-й мин, 100% фазы Б до 12-й мин, 55% фазы Б от 13-й до 17-й мин, 55% фазы Б к 13-й мин).
При определении сфинганина использовали следующие составы мобильных фаз: фаза А — вода + 0,1% (по объему) муравьиной кислоты, фаза Б — 50% метанол + 50% ацетонитрил + 0,1% (по объему) муравьиной кислоты (1,5 мин 20% фазы Б, 100% фазы Б к 3, 2-й мин, 100% фазы Б до 6, 7-й мин, 20% фазы Б к 7, 7 мин, 20% фазы Б до 10-й мин).

Обработка данных

Относительное содержание церамидов оценивали по внешней калибровке (метод стандарта). В качестве калибранта использовали смесь церамидов Ceramide Porcine Brain 860052P (Avanti; США) с содержанием церамида d18 : 1/18 : 0 50% и d18 : 1/24 : 1 20%. Вычисления проводили по сумме площадей пиков ММР-переходов MH+·→ m/z 264,4 Да и (МН-Н₂О)+·→ m/z 264,4 Да.
Калибрантом для сфингомиелинов были смесь Sphingomielin Porcine Brain 860062P (Avanti; США) и сфингомиелины d18 : 1/16 : 0, d18 : 1/18 : 0 (Avanti; США). Вычисление проводили по площадям пиков MRM- переходов MH+·→ m/z 184,1 Да.
Содержание сфингозина d18 : 1 определяли по внутренней калибровке (метод внутреннего стандарта, стандарт D-erythro-sphingosine d7, Sigma; США) по площадям MMР-переходов (m/z 300+·→ m/z 264,4 Да для недейтерированного и m/z 307+·→ m/z 259,3 Да для дейтерированного сфингозина).
Содержание сфинганина d18:0 определяли по внешней калибровке (стандарт — DL-erythro-dihidrosphingosine, Sigma; США) по площадям MMР-переходов m/z 302+·→ m/z 266 Да.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ SPSS, версия 23.0 (IBM; США). Количественные переменные представлены в виде среднего с учетом стандартного отклонения. Для всех переменных была выполнена проверка на соответствие нормальному распределению с использованием теста Шапиро–Уилка. Распределение всех количественных переменных отличалось от нормального. Достоверность различий оценивали для двух независимых выборок по критерию Манна–Уитни, для трех и более выборок — по критерию Краскела–Уоллиса. Значимость корреляций определяли по критерию Спирмена. Для всех видов анализа достоверными считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнение уровня липидов крови и сфинголипидов было проведено в группах пациентов с различной клинической вероятностью семейной гиперлипидемии (табл. 1).
У пациентов с СГХС наблюдали более высокий уровень ОХС и ЛНП. Кроме того, у пациентов с СГХС отмечали тенденцию к повышению уровню сфингозина по сравнению с группой пациентов с низкой вероятностью СГХС (р < 0,05). У больных с СГХС отмечали увеличение доли длинноцепочечного сфингомиелина SM 18 : 1/22 : 0, а также выявляли существенное повышение уровня церамидов с длинной углеродной цепью, С 20 : 1 и С 22 : 1.
Достоверных различий в соотношениях С 18 : 0/С 24 : 0 и С 24 : 1/С 24 : 0 обнаружено не было.
Мы проанализировали связь между уровнем различных липидов и сфинголипидов и наличием у пациентов отягощенного семейного анамнеза (табл. 2). Пациенты с отягощенным семейным анамнезом имели более высокий уровень сфингозина и достоверно более высокий уровень церамидов С 20 : 0, С 20 : 1, С 22 : 0.
Была выявлена прямая корреляция уровня ЛПН и сфингозина (рис. 1). Кроме того, удалось выявить обратные корреляции уровня ЛВП, сфинганина (рис. 2) и галактозилцерамида (r = –0,56; p = 0,001). Корреляционный анализ уровня фракций сфингомиелинов и церамидов с «классическими» липидными фракциями представлен в табл. 3. Обращает на себя внимание прямая корреляция уровня церамидов С 24 : 0 и С 24 : 1 с уровнем ОХС и ЛНП.
Для церамида С 20 : 0 была выявлена прямая корреляция с уровнем ЛВП и триглицеридов и обратная — с уровнем ЛНП. Для церамида С 22 : 0 была обнаружена обратная корреляция с уровнем ЛВП.
Нами были проанализированы корреляции между уровнем классических липидов и сфинголипидов у пациентов с отягощенным и неотягощенным семейными анамнезами. Обращает на себя внимание тот факт, что прямая корреляция между уровнем ХС ЛНП и сфингозина, выявленная в целом по группе, имела большую силу у пациентов с отягощенным семейным анамнезом (r = 0,536; p = 0,022). У пациентов с неотягощенным семейным анамнезом корреляция между уровнем холестерина ЛНП и сфингозина была обратной (r = –0,351; p = 0,048) (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследований особенностей профиля сфингомиелинов и церамидов у пациентов с семейной гиперлипидемией немного. На животной модели семейной гиперлипидемии, вызванной мутациями гена рецептора липопротеинов низкой плотности, было показано достоверное увеличение общего сфингомиелина и церамида С 18 : 0 при гомозиготном носительстве мутации [7]. В настоящем исследовании мы отмечали только увеличение фракции SM 18 : 1/22 : 0 и церамида С 20 : 1.
Показана связь уровня церамидов с другими факторами риска развития ИБС — избыточной массой тела и формированием инсулинорезистентности. Считается, что некоторые фракции церамидов могут стимулировать синтез провоспалительных цитокинов (например, фактора некроза опухоли) при повышенном потреблении сатурированных жиров с пищей [8]. При снижении веса после проведения бариатрических хирургических вмешательств снижение уровня атерогенных сфиногомиелинов и церамидов наблюдается раньше и в значительно большей степени, чем происходит снижение веса, что коррелирует со снижением сердечно- сосудистых рисков [9].
Установлено, что в окисленных ЛНП существенно выше оказывается содержание общих сфинголипидов и церамидов, что может служить подтверждением роли сфинголипидов в дестабилизации атеросклеротической бляшки и формировании обострения ИБС и других заболеваний [10]. Сфингозин вызывает агрегацию Cu2+- перекисных везикул и ускоряет процессы перекисного окисления ЛНП, делая их более атерогенными. Катализаторами этого процесса могут служить длинноцепочечные церамиды. Церамиды с длиной цепи С 6, С 8, С 10 такой активностью не обладают. Сфинганин, напротив, блокирует процессы перекисного окисления [11]. В нашем исследовании у пациентов с определенной семейной дислипидемией отмечали существенное повышение уровня сфингозина. Уровень сфинганина у пациентов с низкой и высокой вероятностью семейной гиперлипидемии достоверно не отличался.
Полиморфизм гена ApoE (2/3/4) ассоциирован с увеличением патогенных фракций церамидов, что связывают с увеличением риска ИБС у молодых пациентов [12].

В патогенезе каротидного атеросклероза у больных с ВИЧ-инфекцией было показано значение уровня церамидов C 16 : 0, C 22 : 0, C 24 : 0, C 24 : 1. Для длинноцепочечных церамидов С 22 и С 24 была установлена корреляция с уровнем ОХС и ЛНП [13]. Положительная корреляция сфингомиелинов SM d16 : 0/28 : 5, SM d18 : 1/24 : 1 и SM d 18 : 1/16 : 0 с уровнем ОХС и ХС ЛНП была обнаружена при исследовании животной модели дислипидемии (АроЕ-дефицитные мыши). Уровень указанных фракций у животных с гиперлипидемией был повышен. Такие сфинголипиды считаются проатерогенными [14]. Есть данные о том, что окислительный стресс и липотоксичность ассоциированы именно с увеличением уровня длинноцепочечных церамидов, что, например, становится явным в условиях инсулинорезистентности [15]. В нашем исследовании уровень сфингомиелина SM 18 : 1/22 : 0 был повышен у пациентов с вероятной/ определенной гиперлипидемией. Были выявлены прямые корреляции уровня холестерина крови и церамидов С 24 : 0 и С 24 : 1.
Настоящее исследование имеет ряд ограничений, таких как одноцентровой характер исследования, малый объем выборки, отсутствие данных крупных наблюдательных исследований о наличии эпидемиологической связи между выявленными изменениями компонентов липидома и сердечно-сосудистыми событиями (инфаркты, инсульты, сердечно-сосудистая смерть).

ВЫВОДЫ

Пациенты с определенной/вероятной СГХС имеют не только высокий уровень ОХС и ХС ЛНП, но и проатерогенного сфингозина, сфингомиелина SM 18 : 1/22 : 0, церамидов с длинной углеродной цепью (С 20 : 1 и С 22 : 1). Выявленные нами особенности липидома требуют уточнения их клинической значимости. Наличие изменений липидома может объяснять механизм повышения риска развития и раннего дебюта атеросклероза в этой группе пациентов. О значении сфингозина как дополнительного фактора риска, ассоциированного с семейным характером заболевания, свидетельствует то, что прямая корреляция между уровнем сфингозина и ЛНП была выявлена только у пациентов с отягощенным семейным анамнезом.