Известно, что регуляторные пептиды семейства меланокортинов и их фрагменты обладают широким спектром биологических эффектов, что послужило основанием для создания ряда синтетических аналогов с целью структурно-функционального анализа молекул и разработки фармакологических препаратов [1, 2]. Известно, что N-концевые участки адренокортикотропного гормона (АКТГ) оказывают нейротропное действие, в том числе на болевую чувствительность [3]. При этом последовательность His-Phe-Arg-Trp, соответствующая участку АКТГ_6-9, необходима для активации всех видов меланокортиновых рецепторов [4]. Показано, что после присоединения трипептида Pro-Gly-Pro (PGP) к С-концу АКТГ_6-9 для повышения устойчивости к действию карбоксипептидаз ряд его нейротропых эффектов сохранялся [5]. Однако влияние пептида АКТГ_6-9-PGP на болевую чувствительность до настоящего времени не было изучено. В то же время структурно близкий синтетический фрагмент АКТГ_4-7-PGP, являющийся активной субстанцией фармакологического препарата «семакс», обладает подобными эффектами [3]. Поэтому с целью структурно- функционального анализа N-концевых фрагментов АКТГ представлялось необходимым исследовать данный вид нейротропной активности у молекулы АКТГ_6-9-PGP.
Целью данной работы было изучить влияние пептида АКТГ_6-9-PGP на спинальные и супраспинальные механизмы формирования болевой чувствительности у крыс и сравнить с эффектами АКТГ_4-7-PGP.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполняли на крысах-самцах Вистар массой 150–190 г (всего 121 животное). Крыс содержали в клетках по 10 особей в стандартных условиях вивария при 12-часовом световом режиме (12 ч — свет, 12 ч — темнота) и контролируемой температуре (22 ± 2 °С); животные получали стандартный гранулированный корм и воду в свободном доступе. Исследования проводили в промежуток времени с 9 до 15 ч.
Крысы были разделены на 11 групп (10 опытных и 1 контрольная) по 11 особей в каждой. Каждая опытная группа животных получала АКТГ_6-9-PGP или АКТГ_4-7-PGP (семакс) в одной из исследуемых доз. В работе применяли пептиды, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН. АКТГ_6-9-PGP растворяли в физиологическом растворе 0,9% натрия хлорида и вводили животным первых семи опытных групп внутрибрюшинно в дозах 0,5, 1,5, 5, 15, 50, 150 и 450 мкг/кг однократно за 15 мин до начала эксперимента (одна доза на одну опытную группу).
АКТГ_4-7-PGP также растворяли в физиологическом растворе и вводили животным из трех оставшихся опытных групп однократно внутрибрюшинно за 15 мин до начала опыта в дозах 50, 150 и 450 мкг/кг по аналогичной схеме. Группе контрольных животных вводили эквивалентные объемы физиологического раствора из расчета 1 мл на 1 кг массы.

Изучение болевой чувствительности при термическом воздействии проводили с использованием тестов «горячая пластина» и «отдергивание хвоста» [6] на специальном оборудовании (PanLab Harvard Apparatus; Испания): приборе «Hot plate» (модель LE7406), приборе «Tail-flick» (модель LE7106). В тесте «горячая пластина» при температуре 53 °С проводили четыре испытания с интервалом 15 мин: однократное измерение исходного болевого порога до введения пептидов и три измерения болевого порога после введения пептидов. Регистрировали время с момента помещения животного на горячую пластину до появления поведенческого ответа на ноцицептивный стимул (облизывание задних лап, выпрыгивание). В тесте «отдергивание хвоста» болевое раздражение наносили на середину хвоста локально тепловым излучением интенсивностью 50 ед. по шкале прибора и регистрировали латентный период реакции избавления от болевого раздражителя (отдергивание хвоста). Проводили пять измерений: дважды до введения пептида (с вычислением среднего значения исходного болевого порога) и три измерения болевого порога после введения пептида. Все измерения проводили с интервалом в 15 мин. При обработке полученных результатов рассчитывали величину максимально возможного эффекта (МВЭ) по формуле [6]:

формула

где ЛП_оп — латентный период реакции после введения вещества, ЛП_контр — латентный период реакции до введения вещества, МАХ_время — максимальное время нанесения раздражителя (45 с — для теста «горячая пластина» и 9 с — для теста «отдергивание хвоста»).
Статистическую обработку проводили с использованием программного обеспечения «MS Excel 2016» (Microsoft; США), программы «Statictica 13.3» (StatSoft; США) и программной среды вычислений R (The R Foundation for Statistical Computing; Австрия). Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка, оценку равенства дисперсий — с помощью критерия Левене (пакет lawstat). Полученные результаты выражали в виде медианы (Me), нижнего (25) и верхнего (75) перцентилей (Q1 и Q3). Значимость данных оценивали с применением непараметрического однофакторного дисперсионного анализа с помощью критерия Краскела–Уоллиса, для выявления межгрупповых различий в качестве post-hoc- анализа использовали критерий Манна–Уитни (U-тест) с поправкой Бенджамини–Хохберга. Критический уровень значимости (р-value) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Введение пептида АКТГ_6-9-PGP дозозависимо влияло на изменение величины максимально возможного эффекта в тесте «горячая пластина» (см. таблица). Так, после введения пептида в дозе 5 мкг/кг на 15-й и 45-й минутах наблюдали наиболее выраженный анальгетический эффект с достоверным увеличением болевого порога в 2,5 и 7 раз соответственно (p = 0,04 и p = 0,02). При уменьшении вводимой дозы до 1,5 мкг/кг пептид не оказывал существенного влияния на болевую чувствительность. Однако дальнейшее снижение дозы до 0,5 мкг/кг привело к смене направленности эффекта: через 30 мин после введения АКТГ_6-9-PGP наблюдали тенденцию к алгическому эффекту — снижению величины МВЭ на 193% (p = 0,15), которое сохраняется до 45-й мин эксперимента (p = 0,07).
Увеличение вводимой дозы АКТГ_6-9-PGP до 15 мкг/кг не сопровождалось достоверным эффектом. При использовании пептида в дозе 50 мкг/кг отмечена тенденция к алгическому эффекту через 45 минуты (p = 0,1). Последующее повышение дозы до 150 мкг/кг вновь сопровождалось достоверным увеличением болевого порога на 15-й (p = 0,04) и 45-й (p = 0,04) минутах после введения пептида. В дозе 450 мкг/кг АТКГ-_6-9-PGP не оказывал достоверного влияния на исследованные показатели.
Введение АКТГ_4-7-PGP на протяжении всего теста «горячая пластина» не приводило к достоверным различиям между животными опытных групп во всех используемых дозах по сравнению с контрольной.
При исследовании влияния АКТГ_6-9-PGP на величину болевого порога у крыс в тесте «отдергивание хвоста» в группах животных, получавших пептид в дозах 0,5, 1,5, 15, 50 и 450 мкг/кг, достоверных изменений порогов болевой чувствительности выявлено не было (см. таблица).
Важно отметить, что при отсутствии достоверных эффектов пептида в тесте «горячая пластина» в дозах 5 и 150 мкг/кг через 30 мин после введения в тесте «отдергивание хвоста» АКТГ_6-9-PGP оказывал влияние на температурную болевую чувствительность в аналогичном интервале времени: в дозе 150 мкг/кг наблюдали достоверное снижение болевого порога (p = 0,04), а в дозе 5 мкг/кг — тенденцию к алгическому эффекту (p = 0,1).
При исследовании влияния АКТГ_4-7-PGP на болевую чувствительность в тесте «отдергивание хвоста» достоверных изменений зафиксировано не было.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Биологические эффекты меланокортинов реализуются через различные типы меланокортиновых рецепторов (MCR). В частности, MСR1 экспрессируется в нейронах околоводопроводного серого вещества, МСR3 — в коре и таламусе, МСR4 — в стволе головного мозга. Активация указанных структур играет важную роль в формировании боли, ограничивая ее развитие [7, 8]. Учитывая, что болевые реакции в тесте «горячая пластина» формируются с участием супраспинальных структур [6], взаимодействие АКТГ_6-9-PGP с тем или иным типом рецепторов в головном мозге может оказывать влияние на исследованный вид болевой чувствительности.
Кроме того, МСR4 обнаруживаются в структурах спинного мозга [3, 8] и изменение их активности после введения АКТГ_6-9-PGP может оказывать влияние на функционирование сегментарных механизмов боли, наблюдавшееся в тесте «отдергивание хвоста». При этом вопрос о действии аналогов АКТГ через меланокортиновые рецепторы остается открытым и можно предполагать наличие как минимум еще одного неописанного подтипа рецепторов [9, 10].
Отмеченные различия в выраженности и направленности эффектов пептида при использовании различных доз могут быть обусловлены как взаимодействием пептида с теми или иными типами MCR по пути его распространения по структурам мозга, так и с возможными особенностями внутриклеточных механизмов реализации его действия. В частности, трансмембранная и последующая внутриклеточная передача сигнала с одного и того же MCR в зависимости от концентрации лиганда может быть осуществлена различными путями: за счет активации цАМФ, инозитолфосфатной системой [1, 11], а также Са2+ и протеинкиназами [1]. Данные особенности установлены для всех типов меланокортиновых рецепторов [1]. Активация того или иного механизма передачи сигнала влияет на направленность, силу и продолжительность эффекта, вызванного соответствующим стимулом [1, 2]. Указанные выше факты согласуются с установленными в нашей работе дозозависимыми и разнонаправленными изменениями болевой чувствительности после введения АКТГ_6-9-PGP, что характерно для регуляторных пептидов как особого класса биологически активных веществ [11 12].

Установленная в ряде случаев разнонаправленность эффектов АКТГ_6-9-PGP также согласуется с данными литературы о противоречивости влияния фрагментов и аналогов АКТГ на формирование боли [3, 13]. При этом можно предположить, что механизмы влияния на боль АКТГ_6-9-PGP могут иметь сходство с таковыми для его структурно близкого аналога — АКТГ_4-7-PGP (семакса), который при периферическом введении снижает болевую чувствительность, реализуя свои эффекты в том числе через опиоидные и серотониновые рецепторы [3].
В связи с тем, что последовательность АКТГ_6-9 необходима для активации всех видов меланокортиновых рецепторов [4], отмеченное в работе влияние АКТГ_6-9-PGP на болевую чувствительность в сравнении с АКТГ_4-7-PGP может быть следствием возможности его взаимодействия со всеми типами MCR в структурах ЦНС, участвующих в ноцицептивных и антиноцицептивных механизмах. При этом обращают на себя внимание полученные в нашей работе данные об отсутствии противоболевых эффектов у АКТГ_4-7-PGP, описанных ранее другими авторами [3]. Учитывая, что межлинейные и межпородные особенности могут оказывать значительное влияние на характер болевой реакции [14, 15], одной из причин указанных выше различий в полученных эффектах может служить использование в предыдущих исследованиях беспородных животных, тогда как настоящее исследование выполнено на крысах Вистар.

ВЫВОДЫ

В тесте «горячая пластина» введение АКТГ_6-9-PGP в дозах 5 и 150 мкг/кг вызывало выраженное снижение температурной болевой чувствительности с участием супраспинальных механизмов через 15 и 45 мин после внутрибрюшного введения. В остальных использованных дозах эффекты отсутствовали. В тесте «отдергивание хвоста» в дозе 150 мкг/кг пептид повышал температурную болевую чувствительность с участием сегментарных спинальных механизмов. Влияния АКТГ_4-7-PGP на исследованные механизмы болевой чувствительности установлено не было. Результаты проведенных исследований расширяют данные о физиологических эффектах N-концевых аналогов АКТГ и могут служить теоретическим обоснованием для создания на их основе фармакологических препаратов с нейротропным спектром действия.