Флуоресцентные белки широко используют как генетически кодируемые метки в технологиях оптического мечения живых систем [1]. Поскольку хромофор в таких белках находится внутри глобулы и защищен от окружающего растворителя, большинство существующих флуоресцентных белков являются пассивными репортерными молекулами — облучение их светом незначительно влияет на физиологию клетки.
В то же время на основе белка anm2CP было разработано уникальное семейство генетически кодируемых фотосенсибилизаторов — фототоксичных флуоресцентных белков, производящих при облучении активные формы кислорода, способные убить клетку [2].
В фототоксичных флуоресцентных белках обнаруживается заполненный молекулами воды канал, соединяющий находящийся в центре глобулы белка хромофор с молекулами растворителя и являющийся структурным механизмом, обеспечивающим эффективную генерацию активных форм кислорода этими белками [3, 4].
Созданный первым, генетически кодируемый фотосенсибилизатор — белок KillerRed — при освещении зеленым или оранжевым светом производит активные формы кислорода и демонстрирует на три порядка более высокий уровень фототоксичности, чем другие флуоресцентные белки [2]. В зависимости от клеточной локализации и дозы светового облучения активные формы кислорода, генерируемые KillerRed, могут приводить к различным физиологическим последствиям, от инактивации белка слияния [2] до остановки клеточного деления [5, 6] и гибели клеток через некроз или апоптоз [2, 7].
Благодаря этим свойствам KillerRed используют в качестве оптогенетического инструмента в клеточной биологии для инактивации белков светом, изучения внутриклеточного окислительного стресса, а также для уничтожения интересующих экспериментатора клеточных популяций. KillerRed был также использован в качестве фотосенсибилизатора для лечения опухолей в модельных системах [7–9].
На основе KillerRed были созданы другие генетически кодируемые фотосенсибилизаторы, генерирующие активные формы кислорода: SuperNova, спектрально близкий к KillerRed мономерный вариант белка [10], и спектрально отличные от них оранжевый флуоресцентный белок KillerOrange [11] и зеленый флуоресцентный белок SuperNova Green [12]. Кроме того, на основе неродственных флуоресцентным белкам флавопротеинов были разработаны фотосенсибилизаторы miniSOG и Pp2FbFP и другие, генерирующие синглетный кислород при облучении синим светом [13, 14].
К сожалению, ни один из созданных на сегодняшний день фотосенсибилизаторов с флуоресценцией в зеленой области спектра нельзя назвать универсальным для широкого круга задач из-за неполного или медленного созревания хромофора, различных типов генерируемых активных форм кислорода, или зависимости работы белка от доступности внешнего хромофора [15]. Целью настоящей работы было найти мутантный вариант KillerRed, который не формировал бы DsRed-подобный «красный» хромофор и мог служить основой для разработки нового поколения фотосенсибилизаторов с флуоресценцией в зеленой области спектра.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Амплификация ДНК и анализ продуктов амплификации

Амплификацию ДНК проводили с использованием набора Encyclo PCR Kit (Евроген; Россия) на приборе PTC-200 Thermal Cycler (MJ Research; США). Анализ продуктов амплификации проводили в 1–2%-м агарозном геле. В качестве красителя использовали бромистый этидий в концентрации 0,5 мкг/мл.

Создание библиотек случайных мутантов для направленной эволюции

При создании библиотеки мутантов белка KillerRed использовали протокол мутагенеза, основанный на методе ПЦР с ошибками. В реакционную смесь добавляли соли марганца и определенное соотношение нуклеотидтрифосфатов, что в среднем приводило к 8 нуклеотидным ошибкам на 1000 амплифицированных нуклеотидов за 25 циклов ПЦР.
Перед проведением электротрансформации с целью удаления солей реакцию лигирования очищали с использованием набора для очистки ДНК Сleanup Mini (Евроген; Россия). Продукты лигирования смывали с колонки с помощью 10 мкл mQ. Электрокомпетентные клетки в количестве 40 мкл размораживали при
0 °C и в размороженные клетки вносили 5 мкл реакции лигирования. Клетки переносили в предварительно охлажденную кювету для электропорации (BioRad; США) и производили электропорацию в приборе MicroPulser (BioRad; США). Сразу после этого в кювету добавляли 3 мл среды SOB, полученную бактериальную суспензию переносили в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл и инкубировали 1 ч в термостате при температуре 37 °C. Бактериальную суспензию высевали на агар, приготовленный на основе среды LB, и инкубировали при температуре 37 °C в течение 18 ч. Средняя плотность колоний E. coli составляла 5000 на чашку Петри, общее разнообразие мутантов в библиотеке составило около 100 000 клонов. Количество флуоресцентных колоний — 22%.

Экспрессия и очистка рекомбинантных белков

E. coli штамма XL1 Blue выращивали в колбах объемом 800 мл, индуцировали изопропил-β-D-1- тиогалактопиранозидом до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубировали при перемешивании в течение 3 ч. Далее все операции по выделению белка проводили на льду. Культуру клеток центрифугировали, супернатант сливали, осадок ресуспендировали в 4 мл фосфатного буфера (pH 7,4). Клетки разрушали ультразвуком, используя соникатор Sonics Vibra Cell (Sonics & Materials; США), и снова центрифугировали. Супернатант переносили в чистую пробирку и добавляли 400 мкл металл-аффинной смолы Talon (Clontech; США), уравновешенной фосфатным буфером. Пробирку помещали в шейкер на 1 ч 200 об./мин при комнатной температуре, после чего металл-аффинную смолу с белком несколько раз промывали фосфатным буфером. Затем элюировали белок раствором фосфатного буфера, содержащего 250 мМ имидазола.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для поиска мутантного варианта KillerRed с флуоресценцией в зеленой области спектра мы провели случайный мутагенез. Библиотека мутантов KillerRed была клонирована в бактериальный экспрессионный вектор под контроль промотора с высокой фоновой экспрессией, трансформирована в E. coli и выращена на чашках Петри без индукции. Мы визуально скринировали бактериальные колонии при облучении светом 400 нм и 480 нм для идентификации мутантов, обладающих значительной флуоресценцией в зеленой области спектра.
В результате скрининга был отобран мутант KillerRed I64L/D114G/T115S (см. таблица), который практически не обладал флуоресценцией в красной области спектра, зато обладал заметной зеленой флуоресценцией при облучении светом 480 нм (здесь и далее нумерация позиций в белке указана по традиционной нотации, согласно которой хромофор формируют аминокислоты в позициях 65–67 [1]). Подобные спектральные свойства свидетельствовали в пользу формирования «классического» GFP-подобного хромофора вместо DsRed-подобного хромофора, формируемого родительским KillerRed.
Поскольку белки с GFP- и DsRed-подобными хромофорами формируют легко отличимые друг от друга характерные спектры поглощения, мы получили препараты очищенного белка для мутантного белка KillerRed I64L/D114G/T115S и родительского KillerRed (рис. 1).
Спектр поглощения очищенного KillerRed I64L D114G T115S действительно существенно отличался от спектра поглощения KillerRed и демонстрировал пик с максимумом в зеленой области спектра (514 нм) и характерным для GFP-подобных хромофоров гипсохромно сдвинутым плечом.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Отсутствие пика в области 550–600 нм на спектре поглощения KillerRed I64L/D114G/T115S свидетельствует о том, что внесенные мутации почти полностью предотвращают формирование DsRed-подобного хромофора, образующегося в родительском белке. Формируемый вместо этого пик с максимумом в области 514 нм и характерным плечом в области 480–485 нм позволяет предполагать, что катализ хромофора останавливается на «классическом» GFP-подобном хромофоре [1].
Представляются интересными мутации, обнаруженные в отобранном нами варианте KillerRed. Так, мутации в позиции 64 ранее уже были описаны как влияющие на созревание хромофора: например, в Aequorea victoria GFP мутация F64L улучшает созревание хромофора при экспрессии при 37 °C, а в хромобелке из Acropora millepora мутация S64C меняет цвет белка [16]. Мутации D114G и T115S находятся в соседних остатках на петле, соединяющей β-слои 5 и 6 (рис. 2), и, предположительно, могут участвовать в адаптации структуры β-бочонка белка к замене изолейцина на лейцин в позиции 64.

ВЫВОДЫ

Описанный в настоящей работе мутант KillerRed представляет собой перспективный вариант для дальнейшей направленной эволюции с целью создания нового поколения генетически кодируемых фотосенсибилизаторов с флуоресценцией в зеленой области спектра. В отличие от других разработанных на сегодняшний день спектральных вариантов KillerRed, мутант KillerRed I64L/D114G/T115S формирует хромофор на основе тирозина и обладает флуоресценцией в зеленой области спектра.