Плацентарная недостаточность (ПН) и связанные с ней осложнения беременности (задержка роста плода (ЗРП) и преэклампсия) являются клиническим проявлением патологии плацентарного кровообращения. Патогенез ПН основан на нарушениях ангиогенеза в плаценте и аномалии созревания ворсинчатого древа, которые обусловлены рядом патологических процессов:
1) неполноценной инвазией трофобласта; 2) отсутствием ремоделирования спиральных артерий; 3) дисбалансом про- и антиангиогенных факторов; 4) изменениями реологических свойств крови матери [1]. Таким образом, особое внимание при изучении этиологии ПН следует обращать на многофункциональные регуляторные системы, потенциально задействованные на каждом этапе формирования синдрома. К ним относится система урокиназы (активатор плазминогена урокиназного типа, uPA), состоящая из самого урокиназного активатора плазминогена, ее основного субстрата — плазминогена, ингибиторов активатора (PAI-1, PAI-2), а также рецептора урокиназы (uPAR), при условии взаимодействия с которым протеолиз, опосредованный урокиназой, происходит более эффективно [2]. Урокиназный комплекс, благодаря возможности запускать различные сигнальные каскады, способен не только изменять клеточное окружение путем протеолиза внеклеточного матрикса, но и инициировать в ответ на эти изменения процессы миграции и пролиферации клеток [3].
Почти все белки урокиназной системы имеют в своих генах полиморфные маркеры, влияющие на активность фермента или уровень его экспрессии, и для некоторых из них уже накоплены данные, подтверждающие их роль в развитии акушерской патологии. С точки зрения связи генетической вариабельности и клинических проявлений ПН из всех белков урокиназной системы наиболее изучен PAI-1. Уже доказана ассоциация инсерционноделеционной мутации в промотере –675 5G/4G SERPINE1 с невынашиванием беременности, преэклампсией [4, 5].

В меньшей степени изучен полиморфизм гена урокиназы и ее рецептора. В настоящей работе были выбраны две однонуклеотидные замены в гене PLAU (rs2227564, rs4065) и две — в гене PLAUR (rs344781, rs2302524) для исследования связи между ними и развитием ПН. Полиморфизм гена PLAU rs4065 С/T 3′UTR — замена C/T в некодирующей области, приводящая к изменению уровня uPA за счет увеличения стабильности мРНК [6]. Полиморфизм гена PLAU rs2227564 Pro141Leu обусловливает увеличение гидрофобности крингл-домена, что приводит к снижению афинности к фибрину и, возможно, компонентам внеклеточного матрикса [7]. Хотя роль крингл-домена урокиназы не до конца ясна, данный полиморфизм может оказывать влияние на ее активность. Полиморфизм PLAUR rs2302524 (A659G) также представляет собой миссенс-мутацию и потенциально может оказывать влияние на активность урокиназной системы [8]. Полиморфизм PLAUR rs344781 отражается на активности промотера гена, причем аллель T приводит к усилению экспрессии [9]. Учитывая необходимость оценки как материнского, так и плодового компонентов системы «мать–плацента–плод», был исследован и генотип матери, и генотип плода. Данные генотипирования впоследствии были соотнесены с результатами гистологического исследования микропрепаратов плацент с целью оценки влияния полиморфизмов на морфометрические показатели и экспрессию соответствующих белков. Таким образом, целью работы было исследовать ассоциацию SNP генов белков uPA–uPAR-системы с развитием ПН, их влияние на интенсивность иммуногистохимической экспрессии соответствующих белков в плаценте и ее строение.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили в 2018 г. в Медицинском научнообразовательном центре МГУ имени М. В. Ломоносова. Образцы венозной крови, ткани плаценты, пуповины и клинические данные были получены из биобанка Медицинского научно-образовательного центра МГУ имени М. В. Ломоносова. Перечисленный материал был собран у 162 пациенток (20–49 лет) и 95 новорожденных детей непосредственно после завершения родов. Контрольную группу составили 114 здоровых женщин. Критерии включения в контрольную группу: физиологическое течение беременности и родов. В группу ПН включили 48 пациенток. Критерии включения в группу ПН: ранняя преэклампсия (до 34 недель гестации) и/или ранняя ЗРП (до 32 недель) II–III степени. Диагноз ЗРП II–III степени устанавливали при отставании фетометрических показателей более чем на 2 недели от фактического срока гестации, определенного по первому дню последней менструации и ранним УЗИ. Диагноз преэклампсии был установлен при уровне систолического АД ≥ 140 мм рт. ст. и диастолического АД ≥ 90 мм рт. ст., зафиксированном не менее 2 раз после 20-й недели, и наличии одного и более следующих признаков: протеинурии ≥ 300 мг/сут., почечного повреждения (гиперкреатиниемии ≥ 90 мкмоль/л), нарушения функции печени (АЛТ или АСТ > 40 МЕ/л), нарушения кровотока в системе мать–плацента–плод по данным допплерометрии, тромбоцитопении < 150 000/мкл, неврологических симптомов. Критерии исключения пациенток из исследования: наличие многоплодной беременности; Rh-сенсибилизация; гестационный сахарный диабет, тяжелая экстрагенитальная патология; наркомания; табакокурение; пороки развития и генетические аномалии плода. Все беременности наступили самопроизвольно. С целью исключения феномена конституционально маленького плода (small for gestational age) проводили допплерометрию кровотока в артерии пуповины, из исследования были исключены пациентки с нормальными характеристиками кровотока.

Образцы пуповины были получены от 60 новорожденных детей группы ПН (беременность матери была осложнена преэклампсией и/или ЗРП), и от 35 новорожденных контрольной группы (с физиологическим течением беременности и родов). Для анализа отбирали фрагмент пуповины на расстоянии 8–10 см от плаценты и фиксировали в 10%-м формалине или замораживали при –80 °С. В 53 случаях были отобраны и образец крови матери, и фрагмент пуповины новорожденного, и ткань плаценты (25 случаев с ПН, 28 случаев из контрольной группы). Для каждой пары мать–новорожденный собирали по три фрагмента ткани плаценты размерами 1 × 0,5 × 0,5 см из краевой, парацентральной и центральной зон визуально неизмененной плаценты; фрагменты фиксировали 10%м забуференным раствором формальдегида в течение 12 ч, далее осуществляли гистологическую проводку и заливку в парафиновые блоки. Роды всех пациенток, для которых проводили гистологическое исследование плаценты, происходили путем операции кесарева сечения на сроке от 28 недель в группе ПН (2 пациентки — до 34-й недели, 6 — после 34-й недели), на доношенном сроке — в контрольной группе.

Генотипирование

Выделение ДНК из цельной периферической крови матери с консервантом ЭДТА К2 проводили с помощью набора «QIAmp DNA Blood Mini Kit», из ткани пуповины — при помощи набора «DNeasy Blood and Tissue Kit» (QIAGEN; Германия) по стандартной методике, рекомендованной производителем (с минимальной массой образца пуповины 25 мг и пролонгированным лизисом в течение ночи).
Определение полиморфизмов С/T 3′-UTR (rs4065) гена PLAU и T(-516)C (rs344781) гена PLAUR проводили при помощи ПЦР с детекцией в реальном времени. Амплификацию осуществляли в детектирующем термоциклере «RotorGene Q» (QIAGEN; Германия). Применяли аллельспецифичные гидролизуемые зонды. Праймеры и зонды:

rs4065_F: 5'-TGGTTGTCATTTTTGCAGTAGAGTC-3';
rs4065_R: 5'-GGCCTATGCCTGAGGGTAAAG-3';
rs4065_prC: FAM-5'-AAGCTATTGTCGTTCGCCCTGGTGG3'-BHQ1;
rs4065_prT: HEX-5'-AAGCTATTGTCGTTCACCCTGGTGGG3'-BHQ1;
rs344781_F: 5'-ATCCTGAAATATGCATCTCTTAAACACT-3';
rs344781_R: 5'-TTAACATTTACCAAGGACCTACTTCG-3';
rs344781_prC: FAM-5'-CACAGCGGGAAGCAAAGCAAGGGT3'-BHQ1;
rs344781_prT: HEX-5'-CACAGCAGGAAGCAAAGCAAGGGT3'-BHQ1).

Определение C/T 7240 (rs2227564) гена PLAU, A659G (rs2302524) гена PLAUR, -675 5G/4G SERPINE1 проводили при помощи ПЦР с детекцией в реальном времени и готовых наборов для определения SNP (ДНК-технология; Россия).

Морфометрическое и иммуногистохимическое исследования

Из парафиновых блоков изготавливали срезы 4 мкм, которые затем монтировали на предметные стекла с адгезивным покрытием «Polysine Slides» (Menzel GmbH & Co KG; Германия). Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили при помощи буфера «Dewaxand HIER BufferM» (pH 8,0) (Thermo; Великобритания) при температуре 95–98 °С, в течение 20 мин в модуле предобработки к «PT-Module» (Thermo; Великобритания). Иммуногистохимические реакции проводили в автоматизированном режиме с помощью автостейнера «Thermo Scientific LabVision Autostainer 480S» (Thermo; Великобритания). Для проведения иммуногистохимического исследования использовали кроличьи моноклональные антитела к урокиназе (ab133563) в разведении 1 : 150 и кроличьи поликлональные антитела к рецептору урокиназы (ab103791) в разведении 1 : 100 (Abcam; Великобритания), время инкубации — 30 мин. В качестве системы детекции применяли систему «Ultra Vision Quanto Detection System» (Thermo; Великобритания) с DAB-хромогеном. После этого срезы докрашивали гематоксилином (1–3 мин) и заключали под покровное стекло. Результаты реакции учитывали с помощью микроскопа «Leica DM 1000»: объектив HI PLAN 40×/0.65 ∞/0.17/0FN25 с цифровой камерой высокого разрешения «Leica DMC 2900»; программное обеспечение «Leica Application Suite 8.0» (Leica; Германия). Суммарно было получено 1060 микрофотографий: 530 для uPARокрашенных стекол, 530 — для uPA-окрашенных.

Обработка изображений

В каждом изображении выбирали участок фона размерами 7 × 7 пикселей и присваивали ему среднее значение цвета всех пикселей, которые в нем содержатся. По данному цвету корректировали баланс белого так, чтобы полученный цвет становился белым. В результате на всех микрофотографиях цвет фона очень близок к белому, а цветовое пространство стало однородным. После этого в каждой фотографии вручную выделяли и удаляли крупные скопления эритроцитов и артефакты. Все изображения приводили к размеру 1024 × 768 пикселей.

Измеряемые параметры

В программе ImageJ, v1.51s (National Institutes of Health; США) для каждого изображения рассчитывали площадь ворсин (мм2) и площадь межворсинчатого пространства (мм2). При помощи выделения сосудов на микрофотографиях вручную оценивали площадь сосудов (% от площади ворсин), стромально-сосудистое соотношение и интенсивность иммуногистохимической экспрессии uPA и uPAR ворсинами. Стромальнососудистое соотношение рассчитывали по формуле: площадь сосудов ворсин / (площадь ворсин — площадь сосудов ворсин). Все параметры вычисляли как геометрическое среднее показателей, полученных после обработки 10 изображений для каждого среза.

Оценка интенсивности иммуногистохимической экспрессии

В соответствующих ворсинам участках отбирали пиксели со значениями цвета в следующих диапазонах: hue [0;37], saturation [46;255], brightness [62;251]. Данные параметры позволяют определить большое количество оттенков коричневого цвета. Отобранные участки изображений переводили в черно-белый спектр для определения интенсивности окрашивания пикселей. Абсолютно черным пикселям присваивали значение 255, абсолютно белым — 0.
Все пиксели, не входившие в состав ворсин, либо не отобранные по цветовому диапазону, также получили значение 0. Было посчитано среднее значение цвета пикселей в изображении без учета белых (со значением 0). Интенсивность экспрессии рассчитывали по формуле:

формула

где INT — интенсивность; c — среднее значение цвета не белых пикселей; N — количество не белых пикселей на обработанном изображении; V — доля площади изображения, занятая ворсинами, от 0 до 1. Результат расчета по указанной формуле можно интерпретировать как интенсивность экспрессии маркера от 0 (нет экспрессии) до 255 (максимальная экспрессия) в ворсине при условии ее равномерного окрашивания.

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программы RStudio v1.1.453 и веб-версии SNP Stats [10], разработанной для анализа исследований генетического полиморфизма генов. Информационный критерий Акаике (ИКА) использовали для определения модели наследования (кодоминантная, доминантная, рецессивная, сверхдоминантная или лог-аддитивная). Предпочтение отдавали моделям с наименьшими значениями ИКА, указывающими на хорошее соответствие данным при использовании меньшего числа параметров. Отличие распределения непрерывных переменных от нормального определяли при помощи теста Шапиро–Уилка. При сравнении групп в зависимости от вида распределения и числа групп использовали t-тест, тест Тьюки, однофакторный дисперсионный анализ, критерий суммы рангов Уилкоксона, критерий Краскела–Уоллиса. Категориальные переменные оценивали при помощи χ2-теста. В работе представляли также отношения шансов (ОШ) возникновения ПН. Для построения 95%-х доверительных интервалов (ДИ) и точечной оценки ОШ применяли модель однофакторной бинарной логистической регрессии. Для исследования веса и статистической значимости отдельных генотипов использовали логистическую регрессию. Статистически достоверными считали результаты при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В табл. 1 представлены показатели частот полиморфных маркеров матери и новорожденного со статистически доказанной значимостью в отношении развития ПН c поправкой на возраст матери как фактор риска возникновения ПН. Полученные результаты свидетельствуют о наличии ассоциации между развитием ПН и наличием у матери аллеля C гена PLAU rs4065, аллеля A гена PLAUR rs2302524, у новорожденного — аллеля C гена PLAU rs4065, аллеля C гена PLAUR rs344781. Для исследования совместного влияния генотипов матери и плода была построена модель, в которой зависимой переменной являлось наличие ПН, предикторами — генотипы матери и плода (наличие двух мутантных аллелей приравнивали к двум баллам, гетерозиготы — к одному, двух референсных — к нулю), далее оценивали статистическую значимость предикторов, их веса и влияние (положительное или отрицательное). Характеристики полученной модели представлены в табл. 2: достоверное влияние было подтверждено для rs4065 новорожденного — замена С/Т обладает протективным эффектом в отношении развития ПН, т. е. уменьшает вероятность ее развития, наиболее прогностически благоприятным является наличие генотипа ТТ.

В контрольной группе обнаружено нормальное строение ворсинчатого древа: преобладание терминальных ворсин с синусоидально расширенными капиллярами, тесный контакт клеток трофобласта с подлежащей сосудистой стенкой. В группе ПН выявлено большое разнообразие гистопатологических феноменов. В ряде случаев наблюдали преобладание неразветвляющего ангиогенеза в виде дефицита терминальных ворсин, их малого диаметра, отсутствия синцитиальных почек. В 16 случаях выявлены выраженные компенсаторные реакции ткани плаценты: ангиоматоз ворсин, большое количество синцитиальных почек в сгруппированных терминальных ворсинах, сужение межворсинчатого пространства. Перечисленные различия подтверждает количественная оценка площади ворсин и площади межворсинчатого пространства (табл. 3). Различий между группами по показателю удельной площади сосудистого русла, стромально-сосудистому соотношению выявлено не было (табл. 3), что может быть вызвано гетерогенностью морфологической картины при преэклампсии и ЗРП, а также разными сроками родоразрешения.
Полученные при генотипировании матери и плода данные были соотнесены с результатами микроскопического исследования плаценты, в том числе морфометрии, и количественной оценкой иммуногистохимической экспрессии uPA и uPAR. Интенсивность иммуногистохимической экспрессии uPA и uPAR синцитиотрофобластом превосходила таковую стромы и клеток эндотелия сосудов ворсин (рис. 1A–Г). При сравнении групп по показателю иммуногистохимической экспрессии uPA интенсивность была достоверно ниже в ткани плацент пациенток с ПН (p = 0,033) (табл. 3; рис. 1А–Б), различий в экспрессии uPAR выявлено не было (табл. 3; рис. 1В–Г).

Ассоциации между наличием SNP в генах PLAU и PLAUR и интенсивностью экспрессии в ткани плаценты соответствующих белков обнаружено не было.
Протективное влияние замены C/T rs4065 у матери подтверждено взаимосвязью со степенью васкуляризации ворсин: в зависимости от генотипа удельная площадь сосудистого русла (доля от площади ворсин) и величина стромально-сосудистого соотношения были различными (рис. 2). Площадь сосудистого русла и величина стромальнососудистого соотношения достигали наибольших значений при генотипе TT (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Система uRA–uPAR многофункциональна. Наряду с фибринолитической активностью и участием в деградации внеклеточного матрикса она определяет доступность ростовых факторов, влияет на процессы миграции и пролиферации клеток. С момента имплантации эмбриона возрастает синтез урокиназы клетками трофобласта [11], повышается экспрессия uPAR на полюсе клетки, осуществляющем инвазию, параллельно активность uPA контролируют ингибиторы PAI-1,2. Таким образом, при активном участии урокиназной системы идет процесс модулируемой инвазии клеток трофобласта. Кроме клеток трофобласта источниками uPA в плаценте являются NKклетки и макрофаги. С трофобласт-независимых стадий они обеспечивают ремоделирование спиральных артерий эндометрия, и только в ассоциации с ними uPAR-позитивные гладкомышечные и эндотелиальные клетки приобретают миграционный фенотип [12, 13]. Под контролем урокиназной системы, а именно экспрессирующих данные белки клеток, находится и процесс образования и деградации фибриноида фибринового типа [14]. Протеолиз внеклеточного матрикса, в том числе сериновыми протеазами, приводит к высвобождению из его скаффолда ангиогенных факторов, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Взаимодействие VEGF с его рецептором 2 класса в свою очередь приводит к экспонированию протеолитического комплекса uPA–uPAR с интегринами [15], что подтверждает роль урокиназной системы как посредника эффектов ангиогенных факторов и участника ангиогенеза, в том числе и в плаценте.
В ходе нашей попытки оценить риск развития плацентоассоциированных осложнений беременности в зависимости от наличия однонуклеотидных замен в генах матери и плода было показано, что наиболее низкому риску развития ПН соответствует TT генотип PLAU rs4065.
Учитывая, что в большинстве случаев, генотип плаценты совпадает с генотипом плода, закономерным было определить наличие аллеля T у плода как более значимого. К сожалению, нам не удалось доказать, что изменения уровня uPA в плаценте обусловлены наличием исследованных однонуклеотидных замен в ее гене, что может быть обусловлено небольшим количеством изученных образцов. Однако ассоциация генотипа ТТ с большей площадью сосудистого компонента ворсин подтверждает выявленный при оценке риска развития ПН феномен.
Ранее было продемонстрировано, что экспрессия uPAR ворсинами хориона у пациенток с нормально протекающей беременностью выше, чем у тех, чья беременность осложнена угрозой ее прерывания [16]. В нашем исследовании уровни uPAR при иммуногистохимической оценке экспрессии белка не отличались в норме и у пациенток с плацентоассоциированными осложнениями беременности, однако были выявлены различия при сравнении групп по интенсивности экспрессии самой урокиназы.
Влияние rs4065 SNP напрямую на уровень экспрессии uPA не было доказано ранее. По полученным нами результатам можно предположить, что наличие генотипа TT усиливает процессы миграции и пролиферации клеток, носит проангиогенный характер, снижая риск развития ПН. Данный факт подтверждает влияние этого полиморфизма на опухолевую прогрессию и аналогичное потенциирование опухолевого ангиогенеза. Существуют данные о значительном увеличении риска развития злокачественных новообразований при наличии аллеля Т и генотипа ТТ [17–19]. В то же время общепринят факт, что высокий уровень uPA в ткани ряда опухолей служит предпосылкой неблагоприятного исхода [20]. Кроме того, T-аллель rs4065 связан с развитием синдрома Квебека — состояния, обусловленного избыточным фибринолизом вследствие повышенного содержания uPA в тромбоцитах [21].

ВЫВОДЫ

Высокий уровень uPA в плаценте и наличие генотипа TT у плода по rs4065 гена uPA носят протективный характер в отношении развития ПН. Мы предполагаем, что результаты проведенного исследования позволят расширить возможности неинвазивной пренатальной диагностики и прогнозировать развитие ПН путем генотипирования фетальной ДНК по rs4065 PLAU.