Лейомиома матки — одна из наиболее распространенных доброкачественных опухолей женской половой системы [1]. Среди женщин репродуктивного возраста частота ее встречаемости составляет 40–50%, у одной трети пациенток развитие таких опухолей сопровождается серьезными симптомами [1–4].
Миома матки зачастую протекает бессимптомно, особенно в начале развития заболевания, при небольших размерах узлов, их небольшом количестве. Однако существуют тревожные симптомы, которые могут стать причиной значительного снижения качества жизни у большей части женского населения. Основные жалобы пациенток связаны с болевым синдромом при растущей миоме; утомляемостью, слабостью, рассеянностью, появляющимися на фоне менометроррагии и хронической анемии; диспареунией, психологическим стрессом, связанным с вышеуказанными проблемами и страхом перед возможными медицинскими вмешательствами или перед нарушениями репродуктивной функции [5–8].
Важную роль данной гинекологической патологии отводят и в качестве причины женского бесплодия. При обследовании по поводу как первичного, так и вторичного бесплодия миому матки обнаруживают в 23,5% случаев [9]. В мире лейомиома ассоциирована с 10% случаев бесплодия у женщин и является единственной причиной бесплодия у 1–3% пациенток. Влияние миомы матки на бесплодие в значительной степени зависит от локализации миоматозных узлов [10].
Социальная значимость данного заболевания также высока по ряду причин. Современная женщина ведет активный образ жизни, и симптомы, связанные с ростом миомы, могут существенно ухудшать качество жизни женщины, снижать ее работоспособность, увеличивать частоту госпитализаций в гинекологические стационары, в связи с этим увеличиваются затраты государства на лечение таких пациенток.

Научная литература содержит большой объем информации, посвященной поискам факторов, вызывающих развитие миомы матки, среди которых генетические, гормональные и ряд других. Однако однозначных причинно-следственных отношений между этими факторами и патогенезом миом пока не установлено. Согласно популяционным исследованиям распространенности заболевания, важнейшую роль в развитии миом играет генетическая предрасположенность — примерно у 5–10% женщин наблюдается «семейная форма» миомы матки [1]. Опубликован также ряд исследований, показывающих, что для женщин афро-американского происхождения характерен повышенный риск развития лейомиомы, что демонстрирует генетические различия между расами в отношении рисков развития заболевания. Согласно современным данным, в возрасте 50 лет примерно у 70– 80% женщин обнаруживают хотя бы один миоматозный узел, а развитие тяжелых осложнений возможно почти у 15–30% больных [11–14].

Уже более 20 лет активно идут поиски генетических маркеров развития лейомиом. Так как миомы являются моноклональными опухолями, т. е. развиваются из одной клетки-предшественницы, то с появлением NGS-методов соматические изменения генома миом стали изучать довольно интенсивно. Было установлено, что наиболее частым вариантом соматических изменений генома в лейомиомах становятся мутации в гене MED12, большая часть из которых представляет собой однонуклеотидные замены в кодонах 43 и 44 экзона 2 [15]. Данный вид соматических мутаций выявлен в 70% случаев. Это стало наиболее значимым открытием, связанным с патогенезом миом, поскольку в миомах с мутацией в MED12 не обнаружили больше никаких соматических изменений генома. Кроме того, было показано, что в миомах с мутацией в MED12 возрастает экспрессия гена RAD51B, что также может способствовать клеточной пролиферации и росту опухоли [16–17]. Ген MED12 расположен на Х-хромосоме и кодирует белок массой 250 кДа, представляющий собой субъединицу большого медиаторного комплекса и участвующего в регуляции транскрипции комплекса РНК-полимеразы II.

При дальнейшем изучении было установлено, что в гене MED12 наиболее распространена соматическая мутация 131G>A. Всего в экзоне 2 гена MED12 удалось выявить шесть вариантов однонуклеотидных замен в трех позициях: 130G>A, 130G>С, 130G>Т, 131G>Т, 130G>Т, 131G>С (расположены по увеличению частоты встречаемости) [18].
Несмотря на высокую распространенность мутаций MED12 в лейомиомах матки человека, причины их возникновения и механизм действия до сих пор неизвестны. В опубликованном нашей группой в 2016 г. исследовании было выявлено, что соматические мутации в экзоне 2 гена MED12 обнаруживали в 50% образцов миоматозных узлов среди исследованной выборки российских женщин [19–20]. Перспективным представляется дальнейший поиск генетических маркеров, ассоциированных с риском развития заболеваний. Такой подход уже используют при изучении целого ряда онкологических заболеваний. Так, для эндометриоза уже выявлены однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), наличие патогенных аллелей которых повышает риск развития этого заболевания [21].

Поиск генетических маркеров развития лейомимы идет во все мире. В метаанализе, проведенном в 2020 г. [22], продемонстрирована прямая связь девяти SNP с риском развития миомы матки на уровне значимости всего генома (p < 6,6 · 10^–9): rs3820282 (1p36.12), rs124793436 (2p25.1), rs2251795 (3q26.2), rs2242652 (5p15.33), rs75228775 (10q24.33), rs2280543 (11p15.5), rs17033114 (12q23.2), rs7989971 (13q14.11) и rs12484776 (22q13.1) в популяции японских женщин. При этом rs2251795, rs2242652, rs75228775, rs2280543 и rs7989971 показали статистически значимые эффекты у пациенток с множественными миоматозными узлами по сравнению с пациентками с одиночным миоматозным узлом. Два SNP (rs2251795 и rs75228775) были ассоциированы с субмукозной лейомиомой, а rs2280543 на 11p15.5 был связан с интрамуральной лейомиомой матки. Данные ассоциации подчеркивают важность дальнейших исследований в этой области с целью выявить влияние вариантов аллелей различных генов на патогенез столь распространенного и до конца непонятного заболевания, как лейомиома матки.
Цель исследования заключалась в поиске маркерных SNP развития лейомиомы матки.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Отбор пациентов для проведения исследования осуществляли в отделении оперативной гинекологии Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова и в гинекологическом отделении Валуйской центральной районной больницы в период с 2018–2019 гг. В исследование были включены 100 пациенток с диагнозом миомы матки. Критерии включения пациенток в исследование: репродуктивный возраст; наличие миомы матки, подтвержденной клинически и функциональными методами исследования (для основной группы); показания к оперативному лечению. Критерии исключения пациенток: острые инфекционные заболевания; аденомиоз III, IV степени; злокачественные заболевания органов малого таза; противопоказания к оперативному вмешательству. Для проверки гипотезы о том, что наследственность играет важную роль в патогенезе миом, основную группу, состоящую из 100 пациенток с подтвержденным диагнозом миомы матки, разделили на две подгруппы:
- в подгруппу Ia вошли 53 пациентки в возрасте 20–46 лет с отягощенным анамнезом, у которых миома была диагностирована у ближайших родственниц по материнской линии (мамы, бабушки, сестры, тети) с единичными или множественными миоматозными узлами;
- в подгруппу Iб вошло 47 пациенток в возрасте 19–42 лет с неотягощенным анамнезом по миоме матки с единичными или множественными миоматозными узлами. Выделение данных подгрупп проводили на стадии опроса и сбора анамнеза пациенток. Группа сравнения была сформирована из 30 пациенток (женщины в постменопаузе, не имевшие в анамнезе миому матки, отрицавшие наличие миом у ближайших родственниц).

Отбор образцов

Сбор образцов тканей миом производили непосредственно во время операций миомэктомии или гистероэктомии (объем операций зависел от размера и количества узлов). Фрагменты тканей помещали в физиологический раствор, отправляли в биобанк и замораживали при –70 °С для последующего хранения в коллекции. Образцы каждого узла подвергали гистологическому исследованию с целью подтверждения наличия исключительно ткани миоматозного узла в образце и отсутствия в нем ткани капсулы или миометрия.

Выделение ДНК

ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen; США) согласно протоколу производителя.

Постановка ПЦР-реакции

ПЦР-реакции проводили в термоциклере S1000тм (BioRad; США) при следующих температурных режимах: начальная денатурация в течение 2 мин при 94 °С, далее 35 циклов с последовательной сменой температур: денатурация при 94 °С в течение 60 с, отжиг праймера при 64 °С — 60 с, элонгация при 72 °С — 1,5 мин, конечная стадия 72 °С — 10 мин (табл. 1). Эффективность амплификации определяли с помощью электрофореза в 2%-м агарозном геле. Гели окрашивали бромистым этидием. Для визуализации и документирования результатов электрофореза применяли систему гель-документирования ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad ChemiDoc XRS Gel Photo Documentation System) (Bio-Rad; США).

Постановка сиквенсной реакции

Первичную нуклеотидную последовательность определяли секвенированием по методу Сэнгера. ПЦР-реакцию для секвенирования проводили с помощью набора Big Dye X-terminator v. 1.1 (Applied Biosystems; США). Полученные ПЦР-продукты анализировали на приборе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems; США). Последовательности ампликонов сопоставляли с соответствующими референсными последовательностями по каждому rs. При анализе последовательностей использовали программный пакет BioEdit (Tom Hall; США).

Метод прямого переосаждения ДНК в мягких условиях

Очищенный ПЦР-продукт получали методом прямого осаждения ДНК в мягких условиях для очистки смеси от праймеров и других компонентов ПЦР-реакции, без использования коммерческих продуктов. Применяли смесь NH Ac + EtOH (конечная концентрация ацетата аммония — 0,125 М, этанола — 70%). В каждую из пробирок с ПЦР-продуктом (10 мкл ПЦР-смеси) добавляли 50 мкл смеси ацетата аммония с этанолом, перемешивали на вортексе или переворачиванием. Высаживание проводили при комнатной температуре в течение 20 мин, затем центрифугировали при 13 000 об./мин в течение 15 мин, удаляли супернатант, осадок промывали 100 мкл 70%-го этанола комнатной температуры, центрифугировали еще 15 мин при 13 000 об./мин, удаляли супенатант и высушивали в термостате или вакуумной центрифуге, после этого добавляли в каждую пробирку по 20 мкл формамида.

Обработка полученных результатов в редакторе BioEdit

На основании полученных сиквенсных хроматограмм были определены генотипы пяти исследуемых полиморфизмов для изучаемых образцов в редакторе выравнивания биологических последовательностей BioEdit (Tom Hall; США).

Статистическая обработка данных

Для проведения статистического анализа данных использовали следующие программные продукты: Microsoft Excel 2013 (Microsoft; США), библиотеки SciPy (SciPy 1.4.1, Python Software Foundation; США), Pandas для языка программирования Python 2.7 (pandas 1.0.1., Wes McKinney; США). Для оценки характера распределения количественных данных предварительно проводили тест с W-критерием Шапиро–Уилка. Поскольку в большинстве случаев распределение данных было отлично от нормального, использовали методы непараметрической статистики. В качестве меры центральной тенденции количественных признаков была выбрана медиана (Me), а в качестве интервальной оценки — верхний (H) и нижний квартили (L). Результаты представляли в виде Me (L–H). Для оценки значимости межгрупповых различий применяли U-критерий Манна–Уитни для несвязанных совокупностей. Достоверность различий в частоте встречаемости качественных признаков определяли по критерию χ2 с поправкой на правдоподобие. Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону Харди–Вайнберга проводили по критерию χ2 в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05 (95%-й уровень значимости). Отношение шансов (ОШ) представлено с 95%-м доверительным интервалом (ДИ). При оценке ассоциации аллеля с фенотипическим признаком (наличие миомы матки и наследственная отягощенность анамнеза по этому заболеванию) сравнивали генотипические частоты анализируемого аллеля в группах пациенток, имеющих и не имеющих данный признак. При наличии статистически значимых различий в распределении аллелей сравнивали распределение генотипов в данных группах. При этом проверяли гипотезы об аутосомно-доминантном и аутосомно-рецессивном типе наследования анализируемого признака методом построения соответствующих модели четырехпольных таблиц. Для каждой таблицы рассчитывали двухсторонний критерий Фишера (F) при количестве наблюдений в одной из ячеек менее пяти или критерий χ2. Также рассчитывали отношение шансов (ОШ) проявления признака при соответствующем генотипе (гомозиготы при аутосомно-рецессивном типе наследования и гетеро -и гомозиготы для аутосомно-доминантного). ОШ приведено с 95%-м доверительным интервалом (ДИ). 95%-е доверительные интервалы рассчитывали на основании распределения χ2, как описано в Statistical Methods for Rates and Proportions [23]. Заключение о наиболее вероятном типе наследования делали по результатам сравнения моделей: наилучшей признавали модель с максимальной статистической значимостью различий в распределении генотипов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Генотипирование образцов проводили по следующим локусам: KCNMB2 — rs12637801, CELF4 — rs2861221, ESR1 — rs3020434, FBN2 — rs11742635, CELF4 — rs12457644. Данные SNP были выбраны на основании пилотного исследования, проведенного с помощью микроматричного анализа на чипах SNP 6.0 (Thermofisher; США) для 20 пациенток с отягощенным семейным анамнезом по миоме матки и наличием соматических мутаций в гене MED12 и 14 пациенток контрольной группы (женщины в постменопаузе, не имевшие в анамнезе миому матки). С помощью статистического анализа было проведено сопоставление частот 906 600 SNP между группами, после чего шесть кандидатных SNP, для которых выявили различия в распределении аллелей и генотипов, были выбраны для генотипирования на более широкой выборке из 100 пациенток с миомами (табл. 2).
Был проведен анализ ассоциации между наличием заболевания/наследственной отягощенностью анамнеза и распределением аллелей исследуемого полиморфизма. Распределение частот генотипов для всех исследованных полиморфизмов соответствовало закону Харди–Вайнберга. Для оценки ассоциации генотипа пациентки с миомой матки были проанализированы распределения генотипов исследуемых полиморфизмов среди трех групп пациенток (табл. 3, табл. 4).
При сопоставлении группы сравнения (данная группа представлена меньшей выборкой по сравнению с основной группой женщин, имеющих миому матки) с подгруппой Ia (пациенток с отягощенным анамнезом по миоме матки), была обнаружена статистически значимая разница в частоте выявления «протективных» вариантов полиморфизмов и аллелей рисков развития миомы матки, что указывает на возможность использовать данные полиморфизмы в качестве маркеров для прогнозирования вероятности развития миомы. Увеличение частот минорных аллелей в группе сравнения в сопоставлении с группой женщин с миомами гораздо достовернее выявлено в подгруппе больных с отягощенным семейным анамнезом, что свидетельствует о роли генетической компоненты в развитии наследственных, «семейных» форм лейомиоматоза.
Статистический анализ результатов, приведенных в табл. 4, показал, что частота распространенного аллеля G однонуклеотидного полиморфизма rs11742635 достоверно выше в подгруппе с неотягощенным анамнезом, что делает его фактором риска развития миомы матки, но не связывает с наследственной предрасположенностью. Возможно, данный аллель больше ассоциирован с другими факторами развития данной патологии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящее время ученые ведут поиск генетических маркеров развития различных социально значимых гинекологических заболеваний для создания генетических панелей ранней диагностики, прогнозирования рецидивирования, оптимизации тактики ведения и создания новых препаратов для лечения данных заболеваний.
Факторы, вызывающие развитие миомы матки, не установлены, хотя научная литература содержит большой объем информации, имеющий отношение к эпидемиологии, генетике, гормональным аспектам и молекулярной биологии этой опухоли. Перечисленные выше факты определяют актуальность изучения данного заболевания.
Впервые «семейные случаи» миомы матки, а также зависимость частоты и тяжести течения данного заболевания от этнического происхождения женщин были показаны в исследованиях американских генетиков [24–25]. Ученым удалось обнаружить геномные ассоциации с развитием миомы матки при генотипировании 261 женщины европеоидной расы, являющихся членами одной семьи (первая линия родства). Иммуногистохимическое и генетическое исследования данной группы пациенток выявили аллель риска развития миомы матки — ген FASN, кодирующий синтазу жирных кислот, локализованный в участке 17q25.3 [24–25].
В полногеномном исследовании было проанализировано 457 044 SNP у 1607 женщин с клинически диагностированной миомой матки и 1428 женщин группы контроля [26]. SNP с высокой ассоциацией (р < 5·10^–5) были дополнительно генотипированы у 3466 пациенток с миомой матки и 3245 из группы контроля без миомы матки в истории болезни. Значимые ассоциации с миомой матки для всего генома были выявлены на трех локусах хромосом 10q24.33, 22q13.1 и 11p15.5. Наиболее значимыми при комбинированном анализе в каждом из этих локусов оказались rs7913069 (p = 8,65 · 10^–14, отношение шансов (OR) = 1,47), rs12484776 (p = 2,79 · 10–12, OR = 1,23) и rs2280543 (p = 3,82 · 10^–12, OR = 1,39) соответственно, дальнейшее изучение которых, по мнению авторов, может способствовать выявлению причин развития миомы матки.

В 2017–2018 гг. в пилотном исследовании с целью поиска генетических маркеров развития миом было проведено генотипирование образцов по 906 600 SNP пациенток с миомой матки, с выявленной в анамнезе отягощенностью по данному заболеванию (миома матки у родственниц первой линии родства по материнской линии) и контрольной группы, в которую вошли женщины без миомы матки в анамнезе [27]. В результате генотипирования удалось выявить шесть полиморфизмов (rs3020434, rs11742635, rs124577644, rs12637801, rs2861221, rs17677069 генов ESR1, FBN2, CELF4, KCWMB2), частоты которых статистически различались в обеих исследуемых группах по сравнению с остальными SNP, при этом были больше в группе женщин с отягощенным анамнезом по сравнению с группой контроля. Дальнейшее исследование рассматривало только указанные выше шесть полиморфизмов, которые, вероятно, связаны с развитием миомы матки. В этой работе не было обнаружено редких аллелей полиморфизмов генов rs3020434, rs11742635, rs2861221, и rs17677069 в группах с отягощенным анамнезом [27].
В нашем исследовании проведено генотипирование образцов по 5 SNP (rs12637801, rs2861221, rs3020434, rs11742635, rs12457644) пациенток с отягощенным анамнезом, у которых миома была диагностирована у ближайших родственниц по материнской линии (мама, бабушка, сестра, тетя) — подгруппа Ia, пациенток без отягощенного анамнеза — подгруппа Iб и пациенток группы сравнения без миомы матки в анамнезе. Согласно полученным данным, генотипическая частота встречаемости аллеля С однонуклеотидного полиморфизма в гене KCWMB2 (rs12637801) статистически значимо выше в подгруппе пациенток с отягощенным анамнезом по сравнению с группой сравнения (87% против 77%; р = 0,04; OR = 2,63) и генотипическая частота встречаемости аллеля G однонуклеотидного полиморфизма в гене СELF4 (rs124577644) статистически значимо выше в подгруппе пациенток с отягощенным анамнезом по сравнению с группой сравнения (85% против 0,70%; р = 0,04; OR = 2,63) соответственно. Наличие данных аллелей может быть связано с повышенным риском развития миомы матки и являться наследственной предрасположенностью к развитию данного заболевания.

ВЫВОДЫ

В данной работе была выявлена ассоциация полиморфизмов генов rs12637801, rs2861221, rs3020434, rs11742635, rs12457644 с отягощенностью анамнеза пациенток по миоме матки и оценена зависимость риска развития данного заболевания от генотипа по исследованным генетическим локусам. Возможно, наша тактика исследования полиморфизмов генов сможет объяснить механизмы формирования «семейных случаев» миомы матки и поможет создать генетическую диагностическую панель для оценки степени риска развития лейомиомы. Направлением дальнейших исследований является генотипирование родственниц пациенток, имеющих семейный анамнез для подтверждения связи заболевания с выявленными генетическими маркерами.