ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Наследственные факторы риска развития миомы матки: поиск маркерных однонуклеотидных полиморфизмов

К. А. Свирепова1, М. В. Кузнецова1, Н. С. Согоян1, Д. В. Зеленский2, Е. А. Лоломадзе1, Г. В. Михайловская1, Н. Д. Мишина1, А. Е. Донников1, Д. Ю. Трофимов1
Информация об авторах

1 Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова, Москва, Россия

2 Валуйская центральная районная больница, Валуйки, Россия

Для корреспонденции: Ксения Александровна Свирепова
ул. Академика Опарина, д. 4, г. Москва, 117997; ur.xednay@iwsesk

Информация о статье

Финансирование: работа выполнена в рамках госзадания 2019 г. «Совершенствование тактики ведения больных доброкачественными заболеваниями органов репродуктивной системы с использованием высокотехнологичных методов функциональной визуальной диагностики и панели молекулярно-биологических маркеров прогрессирования и рецидива заболеваний».

Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом Национального медицинского исследовательского центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова. Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Вклад авторов: К. А. Свирепова — анализ литературы, проведение исследования, написание текста статьи; М. В. Кузнецова — проведение исследования, написание текста статьи; Н. С. Согоян — сбор материала и ведение коллекции в биобанке; Д. В. Зеленский — сбор и предоставление материала для исследования; Е. А. Лоломадзе, Г. В. Михайловская — помощь в проведении лабораторной части исследования; Н. Д. Мишина — статистическая обработка результатов; А. Е. Донников, Д. Ю. Трофимов — общее руководство и редактирование статьи.

Статья получена: 05.02.2020 Статья принята к печати: 19.02.2020 Опубликовано online: 29.02.2020
|

Лейомиома матки — одна из наиболее распространенных доброкачественных опухолей женской половой системы [1]. Среди женщин репродуктивного возраста частота ее встречаемости составляет 40–50%, у одной трети пациенток развитие таких опухолей сопровождается серьезными симптомами [14].
Миома матки зачастую протекает бессимптомно, особенно в начале развития заболевания, при небольших размерах узлов, их небольшом количестве. Однако существуют тревожные симптомы, которые могут стать причиной значительного снижения качества жизни у большей части женского населения. Основные жалобы пациенток связаны с болевым синдромом при растущей миоме; утомляемостью, слабостью, рассеянностью, появляющимися на фоне менометроррагии и хронической анемии; диспареунией, психологическим стрессом, связанным с вышеуказанными проблемами и страхом перед возможными медицинскими вмешательствами или перед нарушениями репродуктивной функции [58].
Важную роль данной гинекологической патологии отводят и в качестве причины женского бесплодия. При обследовании по поводу как первичного, так и вторичного бесплодия миому матки обнаруживают в 23,5% случаев [9]. В мире лейомиома ассоциирована с 10% случаев бесплодия у женщин и является единственной причиной бесплодия у 1–3% пациенток. Влияние миомы матки на бесплодие в значительной степени зависит от локализации миоматозных узлов [10].
Социальная значимость данного заболевания также высока по ряду причин. Современная женщина ведет активный образ жизни, и симптомы, связанные с ростом миомы, могут существенно ухудшать качество жизни женщины, снижать ее работоспособность, увеличивать частоту госпитализаций в гинекологические стационары, в связи с этим увеличиваются затраты государства на лечение таких пациенток.

Научная литература содержит большой объем информации, посвященной поискам факторов, вызывающих развитие миомы матки, среди которых генетические, гормональные и ряд других. Однако однозначных причинно-следственных отношений между этими факторами и патогенезом миом пока не установлено. Согласно популяционным исследованиям распространенности заболевания, важнейшую роль в развитии миом играет генетическая предрасположенность — примерно у 5–10% женщин наблюдается «семейная форма» миомы матки [1]. Опубликован также ряд исследований, показывающих, что для женщин афро-американского происхождения характерен повышенный риск развития лейомиомы, что демонстрирует генетические различия между расами в отношении рисков развития заболевания. Согласно современным данным, в возрасте 50 лет примерно у 70– 80% женщин обнаруживают хотя бы один миоматозный узел, а развитие тяжелых осложнений возможно почти у 15–30% больных [1114].

Уже более 20 лет активно идут поиски генетических маркеров развития лейомиом. Так как миомы являются моноклональными опухолями, т. е. развиваются из одной клетки-предшественницы, то с появлением NGS-методов соматические изменения генома миом стали изучать довольно интенсивно. Было установлено, что наиболее частым вариантом соматических изменений генома в лейомиомах становятся мутации в гене MED12, большая часть из которых представляет собой однонуклеотидные замены в кодонах 43 и 44 экзона 2 [15]. Данный вид соматических мутаций выявлен в 70% случаев. Это стало наиболее значимым открытием, связанным с патогенезом миом, поскольку в миомах с мутацией в MED12 не обнаружили больше никаких соматических изменений генома. Кроме того, было показано, что в миомах с мутацией в MED12 возрастает экспрессия гена RAD51B, что также может способствовать клеточной пролиферации и росту опухоли [1617]. Ген MED12 расположен на Х-хромосоме и кодирует белок массой 250 кДа, представляющий собой субъединицу большого медиаторного комплекса и участвующего в регуляции транскрипции комплекса РНК-полимеразы II.

При дальнейшем изучении было установлено, что в гене MED12 наиболее распространена соматическая мутация 131G>A. Всего в экзоне 2 гена MED12 удалось выявить шесть вариантов однонуклеотидных замен в трех позициях: 130G>A, 130G>С, 130G>Т, 131G>Т, 130G>Т, 131G>С (расположены по увеличению частоты встречаемости) [18].
Несмотря на высокую распространенность мутаций MED12 в лейомиомах матки человека, причины их возникновения и механизм действия до сих пор неизвестны. В опубликованном нашей группой в 2016 г. исследовании было выявлено, что соматические мутации в экзоне 2 гена MED12 обнаруживали в 50% образцов миоматозных узлов среди исследованной выборки российских женщин [1920]. Перспективным представляется дальнейший поиск генетических маркеров, ассоциированных с риском развития заболеваний. Такой подход уже используют при изучении целого ряда онкологических заболеваний. Так, для эндометриоза уже выявлены однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), наличие патогенных аллелей которых повышает риск развития этого заболевания [21].

Поиск генетических маркеров развития лейомимы идет во все мире. В метаанализе, проведенном в 2020 г. [22], продемонстрирована прямая связь девяти SNP с риском развития миомы матки на уровне значимости всего генома (p < 6,6 · 10–9): rs3820282 (1p36.12), rs124793436 (2p25.1), rs2251795 (3q26.2), rs2242652 (5p15.33), rs75228775 (10q24.33), rs2280543 (11p15.5), rs17033114 (12q23.2), rs7989971 (13q14.11) и rs12484776 (22q13.1) в популяции японских женщин. При этом rs2251795, rs2242652, rs75228775, rs2280543 и rs7989971 показали статистически значимые эффекты у пациенток с множественными миоматозными узлами по сравнению с пациентками с одиночным миоматозным узлом. Два SNP (rs2251795 и rs75228775) были ассоциированы с субмукозной лейомиомой, а rs2280543 на 11p15.5 был связан с интрамуральной лейомиомой матки. Данные ассоциации подчеркивают важность дальнейших исследований в этой области с целью выявить влияние вариантов аллелей различных генов на патогенез столь распространенного и до конца непонятного заболевания, как лейомиома матки.
Цель исследования заключалась в поиске маркерных SNP развития лейомиомы матки.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Отбор пациентов для проведения исследования осуществляли в отделении оперативной гинекологии Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова и в гинекологическом отделении Валуйской центральной районной больницы в период с 2018–2019 гг. В исследование были включены 100 пациенток с диагнозом миомы матки. Критерии включения пациенток в исследование: репродуктивный возраст; наличие миомы матки, подтвержденной клинически и функциональными методами исследования (для основной группы); показания к оперативному лечению. Критерии исключения пациенток: острые инфекционные заболевания; аденомиоз III, IV степени; злокачественные заболевания органов малого таза; противопоказания к оперативному вмешательству. Для проверки гипотезы о том, что наследственность играет важную роль в патогенезе миом, основную группу, состоящую из 100 пациенток с подтвержденным диагнозом миомы матки, разделили на две подгруппы:
- в подгруппу Ia вошли 53 пациентки в возрасте 20–46 лет с отягощенным анамнезом, у которых миома была диагностирована у ближайших родственниц по материнской линии (мамы, бабушки, сестры, тети) с единичными или множественными миоматозными узлами;
- в подгруппу Iб вошло 47 пациенток в возрасте 19–42 лет с неотягощенным анамнезом по миоме матки с единичными или множественными миоматозными узлами. Выделение данных подгрупп проводили на стадии опроса и сбора анамнеза пациенток. Группа сравнения была сформирована из 30 пациенток (женщины в постменопаузе, не имевшие в анамнезе миому матки, отрицавшие наличие миом у ближайших родственниц).

Отбор образцов

Сбор образцов тканей миом производили непосредственно во время операций миомэктомии или гистероэктомии (объем операций зависел от размера и количества узлов). Фрагменты тканей помещали в физиологический раствор, отправляли в биобанк и замораживали при –70 °С для последующего хранения в коллекции. Образцы каждого узла подвергали гистологическому исследованию с целью подтверждения наличия исключительно ткани миоматозного узла в образце и отсутствия в нем ткани капсулы или миометрия.

Выделение ДНК

ДНК выделяли с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen; США) согласно протоколу производителя.

Постановка ПЦР-реакции

ПЦР-реакции проводили в термоциклере S1000тм (BioRad; США) при следующих температурных режимах: начальная денатурация в течение 2 мин при 94 °С, далее 35 циклов с последовательной сменой температур: денатурация при 94 °С в течение 60 с, отжиг праймера при 64 °С — 60 с, элонгация при 72 °С — 1,5 мин, конечная стадия 72 °С — 10 мин (табл. 1). Эффективность амплификации определяли с помощью электрофореза в 2%-м агарозном геле. Гели окрашивали бромистым этидием. Для визуализации и документирования результатов электрофореза применяли систему гель-документирования ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad ChemiDoc XRS Gel Photo Documentation System) (Bio-Rad; США).

Постановка сиквенсной реакции

Первичную нуклеотидную последовательность определяли секвенированием по методу Сэнгера. ПЦР-реакцию для секвенирования проводили с помощью набора Big Dye X-terminator v. 1.1 (Applied Biosystems; США). Полученные ПЦР-продукты анализировали на приборе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems; США). Последовательности ампликонов сопоставляли с соответствующими референсными последовательностями по каждому rs. При анализе последовательностей использовали программный пакет BioEdit (Tom Hall; США).

Метод прямого переосаждения ДНК в мягких условиях

Очищенный ПЦР-продукт получали методом прямого осаждения ДНК в мягких условиях для очистки смеси от праймеров и других компонентов ПЦР-реакции, без использования коммерческих продуктов. Применяли смесь NH Ac + EtOH (конечная концентрация ацетата аммония — 0,125 М, этанола — 70%). В каждую из пробирок с ПЦР-продуктом (10 мкл ПЦР-смеси) добавляли 50 мкл смеси ацетата аммония с этанолом, перемешивали на вортексе или переворачиванием. Высаживание проводили при комнатной температуре в течение 20 мин, затем центрифугировали при 13 000 об./мин в течение 15 мин, удаляли супернатант, осадок промывали 100 мкл 70%-го этанола комнатной температуры, центрифугировали еще 15 мин при 13 000 об./мин, удаляли супенатант и высушивали в термостате или вакуумной центрифуге, после этого добавляли в каждую пробирку по 20 мкл формамида.

Обработка полученных результатов в редакторе BioEdit

На основании полученных сиквенсных хроматограмм были определены генотипы пяти исследуемых полиморфизмов для изучаемых образцов в редакторе выравнивания биологических последовательностей BioEdit (Tom Hall; США).

Статистическая обработка данных

Для проведения статистического анализа данных использовали следующие программные продукты: Microsoft Excel 2013 (Microsoft; США), библиотеки SciPy (SciPy 1.4.1, Python Software Foundation; США), Pandas для языка программирования Python 2.7 (pandas 1.0.1., Wes McKinney; США). Для оценки характера распределения количественных данных предварительно проводили тест с W-критерием Шапиро–Уилка. Поскольку в большинстве случаев распределение данных было отлично от нормального, использовали методы непараметрической статистики. В качестве меры центральной тенденции количественных признаков была выбрана медиана (Me), а в качестве интервальной оценки — верхний (H) и нижний квартили (L). Результаты представляли в виде Me (L–H). Для оценки значимости межгрупповых различий применяли U-критерий Манна–Уитни для несвязанных совокупностей. Достоверность различий в частоте встречаемости качественных признаков определяли по критерию χ2 с поправкой на правдоподобие. Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону Харди–Вайнберга проводили по критерию χ2 в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05 (95%-й уровень значимости). Отношение шансов (ОШ) представлено с 95%-м доверительным интервалом (ДИ). При оценке ассоциации аллеля с фенотипическим признаком (наличие миомы матки и наследственная отягощенность анамнеза по этому заболеванию) сравнивали генотипические частоты анализируемого аллеля в группах пациенток, имеющих и не имеющих данный признак. При наличии статистически значимых различий в распределении аллелей сравнивали распределение генотипов в данных группах. При этом проверяли гипотезы об аутосомно-доминантном и аутосомно-рецессивном типе наследования анализируемого признака методом построения соответствующих модели четырехпольных таблиц. Для каждой таблицы рассчитывали двухсторонний критерий Фишера (F) при количестве наблюдений в одной из ячеек менее пяти или критерий χ2. Также рассчитывали отношение шансов (ОШ) проявления признака при соответствующем генотипе (гомозиготы при аутосомно-рецессивном типе наследования и гетеро -и гомозиготы для аутосомно-доминантного). ОШ приведено с 95%-м доверительным интервалом (ДИ). 95%-е доверительные интервалы рассчитывали на основании распределения χ2, как описано в Statistical Methods for Rates and Proportions [23]. Заключение о наиболее вероятном типе наследования делали по результатам сравнения моделей: наилучшей признавали модель с максимальной статистической значимостью различий в распределении генотипов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Генотипирование образцов проводили по следующим локусам: KCNMB2 — rs12637801, CELF4 — rs2861221, ESR1 — rs3020434, FBN2 — rs11742635, CELF4 — rs12457644. Данные SNP были выбраны на основании пилотного исследования, проведенного с помощью микроматричного анализа на чипах SNP 6.0 (Thermofisher; США) для 20 пациенток с отягощенным семейным анамнезом по миоме матки и наличием соматических мутаций в гене MED12 и 14 пациенток контрольной группы (женщины в постменопаузе, не имевшие в анамнезе миому матки). С помощью статистического анализа было проведено сопоставление частот 906 600 SNP между группами, после чего шесть кандидатных SNP, для которых выявили различия в распределении аллелей и генотипов, были выбраны для генотипирования на более широкой выборке из 100 пациенток с миомами (табл. 2).
Был проведен анализ ассоциации между наличием заболевания/наследственной отягощенностью анамнеза и распределением аллелей исследуемого полиморфизма. Распределение частот генотипов для всех исследованных полиморфизмов соответствовало закону Харди–Вайнберга. Для оценки ассоциации генотипа пациентки с миомой матки были проанализированы распределения генотипов исследуемых полиморфизмов среди трех групп пациенток (табл. 3, табл. 4).
При сопоставлении группы сравнения (данная группа представлена меньшей выборкой по сравнению с основной группой женщин, имеющих миому матки) с подгруппой Ia (пациенток с отягощенным анамнезом по миоме матки), была обнаружена статистически значимая разница в частоте выявления «протективных» вариантов полиморфизмов и аллелей рисков развития миомы матки, что указывает на возможность использовать данные полиморфизмы в качестве маркеров для прогнозирования вероятности развития миомы. Увеличение частот минорных аллелей в группе сравнения в сопоставлении с группой женщин с миомами гораздо достовернее выявлено в подгруппе больных с отягощенным семейным анамнезом, что свидетельствует о роли генетической компоненты в развитии наследственных, «семейных» форм лейомиоматоза.
Статистический анализ результатов, приведенных в табл. 4, показал, что частота распространенного аллеля G однонуклеотидного полиморфизма rs11742635 достоверно выше в подгруппе с неотягощенным анамнезом, что делает его фактором риска развития миомы матки, но не связывает с наследственной предрасположенностью. Возможно, данный аллель больше ассоциирован с другими факторами развития данной патологии.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящее время ученые ведут поиск генетических маркеров развития различных социально значимых гинекологических заболеваний для создания генетических панелей ранней диагностики, прогнозирования рецидивирования, оптимизации тактики ведения и создания новых препаратов для лечения данных заболеваний.
Факторы, вызывающие развитие миомы матки, не установлены, хотя научная литература содержит большой объем информации, имеющий отношение к эпидемиологии, генетике, гормональным аспектам и молекулярной биологии этой опухоли. Перечисленные выше факты определяют актуальность изучения данного заболевания.
Впервые «семейные случаи» миомы матки, а также зависимость частоты и тяжести течения данного заболевания от этнического происхождения женщин были показаны в исследованиях американских генетиков [2425]. Ученым удалось обнаружить геномные ассоциации с развитием миомы матки при генотипировании 261 женщины европеоидной расы, являющихся членами одной семьи (первая линия родства). Иммуногистохимическое и генетическое исследования данной группы пациенток выявили аллель риска развития миомы матки — ген FASN, кодирующий синтазу жирных кислот, локализованный в участке 17q25.3 [2425].
В полногеномном исследовании было проанализировано 457 044 SNP у 1607 женщин с клинически диагностированной миомой матки и 1428 женщин группы контроля [26]. SNP с высокой ассоциацией (р < 5·10–5) были дополнительно генотипированы у 3466 пациенток с миомой матки и 3245 из группы контроля без миомы матки в истории болезни. Значимые ассоциации с миомой матки для всего генома были выявлены на трех локусах хромосом 10q24.33, 22q13.1 и 11p15.5. Наиболее значимыми при комбинированном анализе в каждом из этих локусов оказались rs7913069 (p = 8,65 · 10–14, отношение шансов (OR) = 1,47), rs12484776 (p = 2,79 · 10–12, OR = 1,23) и rs2280543 (p = 3,82 · 10–12, OR = 1,39) соответственно, дальнейшее изучение которых, по мнению авторов, может способствовать выявлению причин развития миомы матки.

В 2017–2018 гг. в пилотном исследовании с целью поиска генетических маркеров развития миом было проведено генотипирование образцов по 906 600 SNP пациенток с миомой матки, с выявленной в анамнезе отягощенностью по данному заболеванию (миома матки у родственниц первой линии родства по материнской линии) и контрольной группы, в которую вошли женщины без миомы матки в анамнезе [27]. В результате генотипирования удалось выявить шесть полиморфизмов (rs3020434, rs11742635, rs124577644, rs12637801, rs2861221, rs17677069 генов ESR1, FBN2, CELF4, KCWMB2), частоты которых статистически различались в обеих исследуемых группах по сравнению с остальными SNP, при этом были больше в группе женщин с отягощенным анамнезом по сравнению с группой контроля. Дальнейшее исследование рассматривало только указанные выше шесть полиморфизмов, которые, вероятно, связаны с развитием миомы матки. В этой работе не было обнаружено редких аллелей полиморфизмов генов rs3020434, rs11742635, rs2861221, и rs17677069 в группах с отягощенным анамнезом [27].
В нашем исследовании проведено генотипирование образцов по 5 SNP (rs12637801, rs2861221, rs3020434, rs11742635, rs12457644) пациенток с отягощенным анамнезом, у которых миома была диагностирована у ближайших родственниц по материнской линии (мама, бабушка, сестра, тетя) — подгруппа Ia, пациенток без отягощенного анамнеза — подгруппа Iб и пациенток группы сравнения без миомы матки в анамнезе. Согласно полученным данным, генотипическая частота встречаемости аллеля С однонуклеотидного полиморфизма в гене KCWMB2 (rs12637801) статистически значимо выше в подгруппе пациенток с отягощенным анамнезом по сравнению с группой сравнения (87% против 77%; р = 0,04; OR = 2,63) и генотипическая частота встречаемости аллеля G однонуклеотидного полиморфизма в гене СELF4 (rs124577644) статистически значимо выше в подгруппе пациенток с отягощенным анамнезом по сравнению с группой сравнения (85% против 0,70%; р = 0,04; OR = 2,63) соответственно. Наличие данных аллелей может быть связано с повышенным риском развития миомы матки и являться наследственной предрасположенностью к развитию данного заболевания.

ВЫВОДЫ

В данной работе была выявлена ассоциация полиморфизмов генов rs12637801, rs2861221, rs3020434, rs11742635, rs12457644 с отягощенностью анамнеза пациенток по миоме матки и оценена зависимость риска развития данного заболевания от генотипа по исследованным генетическим локусам. Возможно, наша тактика исследования полиморфизмов генов сможет объяснить механизмы формирования «семейных случаев» миомы матки и поможет создать генетическую диагностическую панель для оценки степени риска развития лейомиомы. Направлением дальнейших исследований является генотипирование родственниц пациенток, имеющих семейный анамнез для подтверждения связи заболевания с выявленными генетическими маркерами.

КОММЕНТАРИИ (0)