В литературе накоплено большое количество фактов, свидетельствующих о том, что изменение иммунологического механизма реактивности возможно при раздражении неантигенной природы. В частности, при воздействии стресса [1, 2], инфракрасного света [3], светодиодного освещения [4], магнитного поля [5], наркотических веществ [6], тяжелой физической нагрузки [7] и т. д. Боль в этом отношении не должна стать исключением.
Вовлечение нейтрофилов в острый алгогенный процесс у взрослых крыс убедительно показано Н. С. Алексеевой. Наблюдаемая этим автором реакция ярко выражена, но быстро угасает, что дало автору право сформулировать понятие о синдроме функциональной готовности нейтрофилов к эффективному фагоцитозу на случай, если сценарий долорогенной атаки найдет свое развитие при возможном повреждении тканей, их инфицировании и т. п. [8].
Есть основания полагать, что алгогенное раздражение новорожденных крысят вызовет у них комплекс ответных реакций. В их числе изменение фагоцитарной активности нейтрофилов. Показано, что среди прочих факторов врожденного иммунитета наиболее реагирующими на изменения в среде внутриутробного пребывания и при рождении оказываются нейтрофилы [9].
В доступной литературе нами не было найдено данных о влиянии острой соматической боли на киллинговую активность нейтрофилов новорожденных крыс. Цель работы — выявить изменения фагоцитарной активности нейтрофилов в ответ на краткосрочный алгогенный стимул у новорожденных крыс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования были белые новорожденные 3–5-дневные крысята средней массой по 12–14 г. Все экспериментальные животные рождались и росли в стационарных условиях в комфортном температурном режиме (около 24 °С). Пол крысят в ходе эксперимента не учитывали. Световой день составлял 12 ч. Эксперименты проводили летом.
Для определения функциональной активности нейтрофилов провели 32 эксперимента. Всех животных разделили на две неравные группы: контрольную (n = 8) и экспериментальную (n = 24). В экспериментальной группе моделировали острый болевой синдром путем электрокожного раздражения рецепторной зоны корня хвоста крысы. Он достигал 3–4-й степени интенсивности на основании критериев А. В. Вальдмана и Ю. Н. Васильева в модификации В. Г. Овсянникова в течение 2 мин [10].
После моделирования острой соматической боли животных декапитировали и осуществляли забор крови в центрифужную пробирку с гепарином (100 ЕД/мл) через 2, 30–60, 120–180 мин. Кровь разводили средой Хенкса («ПанЭко»; Россия) в соотношении 1 : 2. Центрифугировали в градиенте плотности фиколл-верографин (1,083 г/мл) в течение 45 мин при 1500 об./мин. Для оценки микробицидной активности нейтрофилов использовали спонтанный и стимулированный метод автоматизированного учета теста с нитросиним тетразолием (НСТ-теста) с выделенной клеточной взвесью [11]. Метод основан на способности практически бесцветного НСТ восстанавливаться кислородными радикалами в темно-синий диформазан.
Во все ряды вносили 0,5%-й раствор НСТ по 50 мкл. В четные ряды планшета добавляли по 50 мкл забуференного физиологического раствора (рН = 7,0) — при спонтанном НСТ-тесте. В нечетные ряды планшета вносили по 50 мкл 0,1% латексного раствора с диаметром частиц 1,5 мкм («ПанЭко»; Россия) — при стимулированном НСТ-тесте. Затем планшет инкубировали в термостате 24 мин при 37 °С. Учет результатов производили на спектрофотометре Multiscan Sky (THERMO FISHER SCIENTIFIC; США) при длине волны 540 нм. Определяли среднюю оптическую плотность в двух лунках спонтанного НСТ-теста и в двух лунках стмулированного. Результаты выражали в условных единицах (1 у. ед. = 1000 ед. оптической плотности). Затем вычисляли коэффициент микробицидности (КМ), разделив среднюю оптическую плотность в стимулированных лунках на среднюю оптическую плотность в лунках без стимуляции.
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов программ Microsoft Office Excel 2010 Pro (Microsoft; США), STATISTICA 10.0 (Statsoft; США). Она включала в себя: проверку нормальности распределения количественных признаков с использованием критерия Колмогорова–Смирнова с поправкой Лиллиефорса и критерия Шапиро–Уилка; вычисление медианы (Ме), квантилей (Q_0,25 — нижний, Q_0,75 — верхний), интервала значений отминимального значения (Min) до максимального (Max) для данных, не подчиняющихся нормальному распределению; сравнение данных на основе U-критерия Манна–Уитни. Критическое значение уровня значимости (р) принимали равным 0,05. Результаты расчетов представлены как медиана с квантилями и интервалом значений Ме [Q_0,25; Q_0,75] (Min–Max).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

У новорожденных крысят контрольной группы Me сп НСТ = 50,7 у. ед. [Q_0,25 = 49,3 у. ед.; Q_0,75 = 52,7 у. ед.], Min — 48,9 у. ед., Max — 57,1 у.ед. Через 2 мин после алгогенного воздействия Ме сп НСТ = 51,4 у. ед. [Q_0,25 = 48,8 у. ед.; Q_0,75 = 54,1 у. ед.], Min — 41,9 у. ед., Max — 59,1 у. ед. В течении первого часа эксперимента Ме сп НСТ = 58,6 у. ед. [Q_0,25 = 57,0 у. ед.; Q_0,75 = 60,5 у. ед.], Min — 52,1 у. ед., Max — 61,3 у. ед.
В рамках третьего часа наблюдения Ме сп НСТ = 46,9 у. ед. [Q_0,25 = 43,3 у. ед.; Q_0,75 = 49,8 у. ед.], Min — 41,6 у. ед.; Max — 51,1 у. ед.
Как показал статистический анализ, после алгогенного воздействия спонтанный НСТ-тест приходит в движение. Вектор его изменения направлен в сторону активации. Статистически значимые различия по отношению к контролю и первичной реакции зарегистрированы через 30–60 мин от начала эксперимента (p < 0,01). При этом медианные значения результатов свидетельствуют о равномерном распределении показателей между нижним и верхним квантилями, а верхний квантиль приближен к максимальным значениям в выборке. Следует отметить, что наблюдаемая реакция не стойкая, непродолжительна и быстро истощаема. Через 2 ч после болевого воздействия медианные значения спонтанного НСТ-теста становились ниже, чем у животных контрольной группы (р = 0,05) (рис. 1).
Контрольные значения стимулированного НСТ-теста выше, чем спонтанного. Ме ст НСТ = 71,5 у. ед. [Q_0,25 = 68,0 у. ед.; Q_0,75 = 73,4 у. ед.], Min — 67,2 у. ед., Max — 76,5 у. ед.
Сразу после нанесения алгогенного стимула все показатели стимулированного НСТ-теста возрастали, что свидетельствует о высокой функциональной готовности нейтрофилов новорожденных крыс к противостоянию возможной микробной атаке. Ме ст НСТ = 90,4 у. ед. (р < 0,001) [Q_0,25 = 87,8 у. ед.; Q_0,75 = 93,0 у. ед.], Min — 84,8 у. ед., Max — 96,3 у. ед.
Высокая микробицидная активность сохранялась в течение часа после болевой стимуляции. Ме ст НСТ = 87,4 у. ед. (р < 0,001) [Q_0,25 = 78,8 у. ед.; Q_0,75 = 89,9 у. ед.], Min — 77,6 у. ед., Max — 93,0 у. ед.
Как и при постановке спонтанного НСТ-теста, через 2 ч было отмечено истощение резервов микробицидности. Ме ст НСТ = 64,5 у. ед. (р < 0,05) [Q_0,25 = 57,2 у. ед.; Q_0,75 = 66,9 у. ед.], Min — 54,8 у. ед., Max — 74,1 у. ед. (рис. 2).
Признавая, что НСТ-тест отражает метаболическую активность нейтрофилов, кислородзависимые механизмы их микробицидности, следует принять точку зрения разработчиков методики о том, что конечный результат, киллинговый эффект нейтрофилов более информативно описывает коэффициент микробицидности (КМ) [12], который исчисляется путем деления значения стимулированного НСТ-теста на значение спонтанного НСТ-теста. МеКМ контр = 1,40 у. ед. [Q_0,25 = 1,33 у. ед.; Q_0,75 = 1,45 у. ед.], Min — 1,26 у. ед., Max — 1,47 у. ед. Спустя 2 мин после алгогенного воздействия КМ статистически значимо отличался от контрольных значений (возрастал): МеКМ = 1,72 у. ед. (р < 0,001) [Q_0,25 = 1,68 у. ед.; Q_0,75 = 1,80 у. ед.], Min — 1,63 у. ед., Max — 2,19 у. ед.
В течение первого часа эксперимента КМ снижался, однако не достигал контрольных значений, сохранялась тенденция его превалирования над КМ контрольной группы животных: МеКМ = 1,49 у. ед. [Q_0,25 = 1,44 у. ед.; Q_0,75 = 1,51 у. ед.], Min — 1,32 у. ед., Max — 1,53 у. ед.
К концу эксперимента КМ уже не имел статистически значимого отличия от контрольных значений: МеКМ = 1,34 у. ед. [Q_0,25 = 1,30 у. ед.; Q_0,75 = 1,41 у. ед.], Min — 1,28 у. ед., Max — 1,47 у. ед. (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Построение теоретических основ влияния острой соматической боли на фагоцитарную активность нейтрофилов возможно только в контексте нейро-иммунно-эндокринных взаимоотношений. Сегодня ни у кого не возникает сомнения в динамическом единстве механизмов нейрогенной, эндокринной и иммунной природы в поддержании внутреннего гомеостаза целостного организма. Патогенез боли, по крайней мере, его инициальный фрагмент аналогичен стрессу. В основе стресса не всегда боль, но острая боль — это всегда стресс, а потому в ответ на алгогенное раздражение выделяются гормоны стресса и прежде всего катехоламины. На модели, используемой нами, ранее было показано, что уже через 2 мин после нанесения болевого стимула на периферии обнаруживается увеличение содержания адреналина и норадреналина, соотношение которых зависит от возраста животных [12].
Электрофизиологический анализ показал, что раздражение ноцицепторов и передача возбуждения по восходящим путям при этом приводят к активации структур мозга, обеспечивающих контроль вегетативных функций и в первую очередь гипоталамуса, совпадают с активацией нейтрофильных гранулоцитов [13].
Помимо нейрогенного норадреналина в кровь из мозгового вещества надпочечников поступают адреналин и норадреналин. Они находят свои мишени, и события развиваются по классическим канонам стресса. Одним из объектов воздействия являются нейтрофилы, они экспрессируют как α-, так и β-адренорецепторы [14], что было подтверждено позднее [15]. Как следствие, в нашей работе мы наблюдали увеличение фагоцитарной активности к первому часу эксперимента (спонтанный НСТ- тест), а при стимуляции — ко второй минуте после болевого воздействия (стимулированный НСТ-тест). Но уже к концу эксперимента фагоцитарная активность восстанавливается до исходных значений. В основе наблюдаемого снижения лежит активация β-адренорецепторов нейтрофилов [16]. Следует также учесть, что стресс сопровождается повышением продукции глюкокортикоидов, которые подавляют функциональную активность нейтрофилов [17].
Результат определения КМ свидетельствует о том, что нейтрофилы новорожденных крыс обладают киллинговой активностью [11, 18].
Установленные факты активации спонтанного и стимулированного НСТ-тестов, а также повышение киллинговой активности нейтрофилов в ответ на болевое раздражение на первый взгляд вступают в противоречие с достаточно устоявшимся представлением о функциональной незрелости фагоцитов новорожденных.
Одной из возможных версий объяснения вскрытой закономерности является признание наиболее рано формирующейся способности продуцировать супероксидный радикал [19] на фоне редуцированных защитных функций нейтрофилов [20].
В период новорожденности идет активная колонизация микрофлорой организма ребенка, его кожных покровов, слизистых оболочек, органов желудочно-кишечного тракта, легких, мочеполовой системы. Процесс этот весьма интенсивен и скоротечен. Несмотря на то что факт колонизации стал хрестоматийным, его продолжают освещать в научной литуратуре в новых ракурсах [21–23]. Неизменной остается лишь точка зрения о том, что интенсивная антигенная нагрузка не может не мобилизовать факторы резистентности организма, с учетом того, что механизмы адаптивного иммунитета к моменту рождения еще не развиты. Следует согласиться: факторы врожденного иммунитета и среди них нейтрофилы, как наиболее лабильные клетки, оперативно обеспечивающие первую линию защиты в период новорожденности, обретают ключевую роль. Открытие феномена бактериальной транслокации лишь подтверждает этот тезис [24].
Таким образом, система врожденного иммунитета новорожденных, с одной стороны, испытывает стимуляцию со стороны микробной колонизации, а с другой — это фон, на котором развертываются реакции, в частности нейтрофилов, на стимулы неантигенной природы, в нашем случае на острое алгогенное воздействие.

ВЫВОДЫ

1. У новорожденных крыс в ответ на острое алгогенное раздражение активируется и возрастает киллинговая активность нейтрофилов. 2. Реакции антимикробной защиты у нейтрофилов, наблюдаемые у новорожденных крыс в ответ на краткосрочную острую болевую стимуляцию, непродолжительны и быстро истощаются. 3. Проведенные исследования расширяют представления о реакции метаболической активности нейтрофилов в ответ на острую боль у новорожденных. Результаты исследования могут быть использованы для дальнейшего изучения боли, адекватной оценки изменения параметров в онтогенезе и профилактики ее негативных последствий.