Эпилепсией страдает более 75 млн людей по всему миру, и их число постоянно растет [1–2]. Ключевая проблема современной эпилептологии — фармакорезистентность, низкий процент больных эпилепсией (14,9%), достигающих стойкой ремиссии. У 48,1% происходят повторные приступы с частотой до 12 раз в год [3–4]. Половина больных эпилепсией получают несколько антиконвульсантов одновременно. Часть пациентов страдают от нерациональной замены препаратов, необоснованной политерапии, ухудшающей качество жизни, повышающей вероятность возникновения нежелательных лекарственных реакций. Остро стоит проблема приверженности лечению: 18,05% больных эпилепсией в России не получают лекарственной терапии [5]. Оптимизация фармакотерапии эпилепсии — важнейшая задача эпилептологии.
Среди многочисленных антиконвульсантов особое положение занимает вальпроевая кислота, которую синтезировал в 1882 г. Беверли С. Бертон и первоначально использовали в качестве растворителя. Противосудорожные свойства вальпроевой (2-пропилпентановой) кислоты случайно открыли в 1963 г. и с тех пор широко используют в клинической практике [6]. Вальпроаты являются противоэпилептическими средствами широкого спектра действия, в связи с чем их относят к препаратам первого выбора при эпилепсии различных форм. Долгосрочные исследования показали эффективность вальпроатов при всех формах генерализованных эпилепсий [7–9]. Существенная проблема в использовании вальпроатов — нежелательные побочные реакции, а также проявления острой и хронической интоксикации [10–12]. Из- за высокой тератогенности они не рекомендованы женщинам детородного возраста [13]. За счет химической модификации вальпроевой кислоты возможно получение более эффективных и безопасных препаратов с антиконвульсивной активностью [14].
Целью исследования было получить новый антиконвульсант из группы тиадиазолиламидных дериватов вальпроевой кислоты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты и препараты

2-Амино-5-этил-1,3,4-тиадиазол (Acros Organics; Бельгия), 2-пропилпентановая кислота (Sigma Aldrich; США), пиридин («ЛенРеактив»; Россия), изониазид («Мосхимфармпрепараты им. Н. А. Семашко»; Россия), хлористоводородная кислота («ЛенРеактив»; Россия), пропанол-2 («ЛенРеактив»; Россия), ацетонитрил (LC-MS; Scharlau, Испания), ацетат аммония (Panreac AppliChem ITW reagents, США), этанол («Медхимпром»; Россия), вода деионизированная Milli-Q.

Оборудование

Масс-селективный квадрупольный детектор AB Sciex QTrap 3200 MD (Sciex; Сингапур), высокоэффективный жидкостный хроматограф Agilent 1260 Infinity II (Agilent Technologies; Германия), пластины для тонкослойной хроматографии (силикагель 60 F 254) (Merck; Германия), спектрометр Bruker Avance-400 (Bruker; Германия), ИК- спектрометр Agilent Cary 630 FTIR (Agilent; Германия), анализатор для элементного анализа EA 1108 (Carlo Erba Instruments; Италия), аналитические весы Acculab ALC- 80d4 (Acculab; США), центрифуга с охлаждением ротора Eppendorf 5810R (Eppendorf; Германия), система получения особо чистой воды Миллипор DirectQ UV (Millipore SAS; Франция), вортекс-встряхиватель Elmi V-3 (Elmi; Латвия), шейкер Elmi S-3 (Elmi; Латвия), термостат твердотельный «Термит» («ДНК-Технология»; Россия), автоматические дозаторы Eppendorf (Eppendorf; Германия) и Black Thermo («Термо Фишер Сайентифик»; Россия).

Методы идентификации

Химическую структуру синтезированного вальпроата (N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамида) исследовали методами ИК-спектроскопии, 1Н-ЯМР, 13С-ЯМР-спектроскопии, масс-спектроскопии и элементного анализа. Чистоту и индивидуальность подтверждали методами тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Экспериментальная оценка противоэпилептической активности

Противоэпилептическую активность синтезированного вальпроата оценивали в тесте антагонизма с изониазидом. Генерализованные клонико-тонические судороги индуцировали у мышей интраперитонеальным введением изониазида (ИЗН) в дозе 250 мг/кг [15]. Использовали аутбредных мышей-самцов SNK массой 19–21 г (n = 40). Животных содержали в условиях вивария Тверского ГМУ при постоянной температуре (22 ± 2 °C) и искусственном 12-часовом режиме дня и ночи (светлое время 08:00– 20:00) со свободным доступом к воде и пище. Мыши были рандомизированы на пять групп: контрольную (изониазид-индуцированные судороги) и опытные группы (интраперитонеальное введение тестируемого препарата в дозах 75, 150, 300 и 450 мг/кг за 40 мин до изониазида). Видеонаблюдение за подопытными животными осуществляли в течение 3 ч, регистрируя латентный период первого судорожного приступа, появление клонических и тонических судорог, исходы (выживание или гибель). Рассчитывали значения ED₅₀ (средней терапевтической дозы, обеспечивающей выживание 50% животных в тесте) и терапевтического индекса (TI = DL₅₀/ЕD₅₀ — отношение среднесмертельной дозы к средней терапевтической).

Статистические методы исследования

Статистический анализ проводили с использованием программы «BioStat, 2009» (AnalystSoft; США). Для обработки результатов исследования применяли методы описательной статистики. После проверки гипотезы о нормальном распределении данных с помощью W-критерия Шапиро–Уилка проводили однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным сравнением (post-hoc тест множественного сравнения) с помощью критерия Тьюки HSD. Для статистического анализа относительных показателей использовали точный критерий Фишера. Данные представляли в виде m ± SEM. Значение ED₅₀ рассчитывали путем пробит-анализа методом Финни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Схема синтеза

Синтезированный тиадиазолиламидный дериват вальпроевой кислоты — N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамид (брутто формула С12H21N3OS) с лабораторным наименованием вальпразоламид (ВПЗ) представлен на рис. 1.
Синтез нового антиконвульсанта состоял из следующих этапов: галогенирование 2-пропилпентановой кислоты хлорангидридом сернистой кислоты; стехиометрическое взаимодействие полученного хлорангидрида 2-пропилпентановой кислоты с 2-амино-5-этил-1,3,4-тиадиазолом; получение кристаллического осадка при подкислении реакционной массы HCl до рН = 1–2 при температуре 5 °С (рис. 2).
После синтеза осуществляли очистку полученного продукта. Поэтапная очистка включала: удаление водорастворимых примесей путем промывания охлажденной водой с повторной фильтрацией и перекристаллизацию с пропанолом-2 после предварительного высушивания в вакууме при 10 мм рт. ст. до постоянной массы (выход 67%). Эффективность очистки контролировали хроматографическими методами (ТСХ и ВЭЖХ).

Описание и идентификация N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамида

Полученная активная фармацевтическая субстанция — белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок, молярная масса 255,14 г/моль, температура плавления 93–94 °С. Практически не растворим в воде, растворим в спирте, в ацетонитриле и других органических растворителях.
Химическую структуру N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2- ил)-2-пропилпентанамида (С₁₂H₂₁N₃OS) подтверждали методом элементного анализа и с помощью спектральных характеристик. Расчетным путем для С₁₂H₂₁N₃OS было определено содержание элементов: C — 56,44%; H — 8,29%; N — 16,45%; O — 6,26%; S — 12,56%. Элементный анализ показал содержание C — 56,39%; H — 8,34%; N — 16,41%; O — 6,26%; S — 12,60%, что соответствовало химической структуре синтезированного соединения.
Результаты спектроскопии: ИК-спектры (при таблетировании с KBr), ν/см–1: 3302, 3030 (NH), 2981, 2959, 2860 (СН), 1545 (NHCO); 1H-ЯМР (400 MГц, DMSO-d6) δ ppm: 0,97 (s, 3H, CH3), 1,33 (s, 2H, CH₂), 1,41–1,50 (m, 4H), 2,65 (s, 2H, CH₂), 10,63 (s, 1H, NH); 13C-ЯМР (400 MГц, DMSO-d6) δ ppm: 13,48, 13,66, 20,06, 24,70, 35,27, 43,22, 155,85, 156,5, 175,00; ESI+-масс-спектр — m/z 256,1 ([M + H]+), значения MRM-переходов — m/z 256,1 → m/z 81,1 и m/z 130,1. ESI+-масс-спектр N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)- 2-пропилпентанамида представлен на рис. 3.
Индивидуальность синтезированного антиконвульсанта оценивали с помощью ВЭЖХ. Хроматографию проводили с использованием колонки Phenomenex synergi Fusion 4 мкм-C18 2 × 50 мм, при температуре 50 °С. Элюирование осуществляли метанолом с водой деионизированной в соотношении 90 : 10 и с добавлением 0,1%-го аммония ацетата. Время удерживания составило 1,31 мин (рис. 4).

Оценка противоэпилептической активности на модели изониазид-индуцированных судорог у мышей

При интраперитонеальном введении изониазида (250 мг/кг) генерализованные клонико-тонические судороги со смертельным исходом развивались у всех подопытных мышей группы контроля. Предварительное введение ВПЗ за 40 мин до изониазида оказывало дозозависимое влияние на течение изониазид-индуцированных судорог у мышей (р < 0,0001; однофакторный дисперсионный анализ ANOVA). ВПЗ в дозе 75 мг/кг статистически значимо увеличивал продолжительность латентного периода первого судорожного приступа в среднем в 1,5 раза (р < 0,05) по сравнению с контролем, однако не предупреждал развития судорог и гибели подопытных животных. При использовании ВПЗ в дозах 150 мг/кг и 300 мг/кг наряду с увеличением латентного периода первого судорожного приступа отмечено уменьшение числа смертельных исходов. В серии опытов с использованием ВПЗ в дозе 450 мг/кг развития судорожного синдрома в течение 3 ч после введения изониазида зарегистрировано не было (см. таблица.).
По результатам пробит-анализа значение ED50 при интраперитонеальном введении ВПЗ в тесте антагонизма с изониазидом составило 126,8 мг/кг (95% ДИ: 65,5–245,4). Терапевтический индекс был равен 7,3.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Основные критерии для поиска новых антиконвульсантов — эффективность при фармакорезистентной эпилепсии, меньшее количество побочных эффектов, лучшая переносимость, а также способность замедлять прогрессирование и модифицировать течение эпилепсии; дополнительные преимущества — линейность фармакокинетики, легкость титрации при клиническом использовании, наличие дополнительных терапевтических эффектов, в том числе обезболивающего при невропатической боли. Поиск таких препаратов осуществляют как среди новых молекул, так и путем создания новых производных известных антиконвульсантов.
В литературе показана возможность создания новой генерации вальпроатов [16]. Отмечено, что тератогенность амидных аналогов существенно ниже, чем у самой вальпроевой кислоты [17]. Среди амидов вальпроевой кислоты выявлены эффективные противоэпилептические [18], антиневропатические [19–20], противовирусные [21–22] и другие средства. Антиконвульсивная активность обнаружена также у ряда производных 1,3,4-тиадиазола, в том числе содержащих остаток вальпроевой кислоты [23]. Большинство тиадиазоловых производных отличалось от аналогов более высокой биодоступностью и меньшей токсичностью. Подобная закономерность отмечена и в отношении синтезированного вальпроата, содержащего в своей структуре 1,3,4-тиадиазолил. Показано, что значение полулетальной дозы 1,3,4-тиазиазолиламидного деривата вальпроевой кислоты (внутрибрюшинно, мыши) в среднем в 1,8 раза больше, чем у вальпроевой кислоты [24]. Наличие противоэпилептического эффекта у синтезированного вальпроата подтверждено на моделях максимального электрошока и пентилентетразоловых судорог у мышей [25–26]. Учитывая, что наибольшую активность ВПЗ проявил в тесте с антагонистом ГАМКА-рецепторов пентилентетразолом, в настоящем исследовании оценивали его влияние на судороги, индуцированные другим антагонистом ГАМК — гидразидом изоникотиновой кислоты изониазидом. Проконвульсивный эффект изониазида связан с угнетением синтеза ГАМК за счет антагонизма с пиридоксальфосфатом, являющимся коферментом глутаматдекарбоксилазы, которая катализирует превращение глутамата в ГАМК. Судорожный синдром, нередко описываемый как эпилептический статус, представляет собой серьезное осложнение при лечении туберкулеза гидразидами изоникотиновой кислоты. Изониазид-индуцированные судороги плохо поддаются лечению обычными антиконвульсантами и не всегда могут быть предупреждены пиридоксином [27–28]. Известно, что вальпроаты могут дозозависимо угнетать развитие судорог, вызванных изониазидом [29]. В настоящем исследовании показано, что предварительное введение N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамида увеличивало латентный период судорог и уменьшало гибель мышей в тесте антагонизма с изониазидом. На основании этих сведений N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамид можно отнести к потенциальным противоэпилептическим средствам с улучшенным профилем безопасности.

ВЫВОДЫ

Результаты исследования подтверждают перспективность поиска новых антиконвульсантов путем модификации вальпроевой кислоты за счет введения в ее химическую структуру 1,3,4-тиадиазола. Преимущество синтезированного N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)- 2-пропилпентанамида в способности предупреждать развитие изониазид-индуцированных судорог, недостаток — нерастворимость в воде, что затрудняет получение инъекционных лекарственных форм. В дальнейшем для улучшения его биофармацевтических свойств предполагается получение нанокапсулированной формы с β-циклодекстрином. Методики идентификации N-(5-этил-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-2-пропилпентанамида могут быть использованы для определения его подлинности и проведения фармакокинетических исследований.