В последние годы проводят активные исследования действия химических токсинов из окружающей среды и нарушения регуляции процессов про- и антиоксидантной защиты в развитии острого панкреатита (ОП). Так, была выявлена ассоциация острого небилиарного панкреатита с курением [1], а у курящих и злоупотребляющих алкогольными напитками пациентов с ОП отмечен повышенный риск развития панкреонекроза [2]. Несмотря на многочисленные исследования, генетические механизмы реализации предрасположенности к ОП и его осложнениям пока изучены недостаточно, но очевидно, что генетически детерминированные особенности функционирования системы биотрансформации ксенобиотиков и антиоксидантной системы играют в этом важную роль.
Трансмембранный белок ABCB1 — член надсемейства АТФ-зависимых транспортеров лекарственных средств и ксенобиотиков с широкой субстратной специфичностью, отвечает за снижение накопления наркотиков в клетках с множественной лекарственной устойчивостью, часто опосредует развитие резистентности к противоопухолевым препаратам. Гены ABC делят на семь различных подсемейств. ABCB1 является членом подсемейства MDR/TAP, локализован на 7q21.12. Ген экспрессируется в большей степени в яичках, мышцах, желудке и поджелудочной железе. Была изучена роль гена ABCB1 в развитии колоректального рака [3, 4], однако статистически значимых ассоциаций выявлено не было. Роль гена при ОП ранее не изучали.
На сегодняшний день наиболее изучена система оксидазы цитохрома Р450, включающая CYP1, CYP2 и CYP3, которые в целом отвечают за расщепление чужеродных соединений у млекопитающих.
Обнаружено увеличение активности ферментов фазы активации у больных с нарушенной функцией поджелудочной железы за счет полиморфизма генов цитохрома Р450, CYP1A1, CYP2E1 [5]. По мнению авторов, основную причастность к развитию панкреатита имеет CYP1A1, который запускает каскад протеинкиназы с увеличением репликации ДНК и тканевой пролиферации, генерирует радикалы кислорода, образует реактивные промежуточные продукты метаболизма ксенобиотиков и способен активировать многие канцерогены.
Известно, что CYP1A1 (ароматическая соединительно-индуцируемая арилгидрокарбонгидроксилаза) в первой фазе биотрансформации ксенобиотиков превращает полициклические ароматические углеводороды в высокоактивные мутагенные метаболиты. Ген, кодирующий ключевой фермент, локализован на 15q24.1. Известно 19 вариантов полиморфизма гена, играющих определенную роль в развитии онкологических и профессиональных заболеваний [6].
CYP2E1 (цитохром P450 2E1) кодирует белки цитохрома Р450 (монооксигеназы), которые катализируют многие реакции, связанные с метаболизмом лекарственных средств и синтезом холестерина, стероидов и других липидов. Этот белок локализован в эндоплазматическом ретикулуме, его индуцируют действие этанола, диабетическое состояние и голодание. Фермент участвует в метаболизме этанола, ацетона, бензола, этиленгликоля, а также премутагенов, обнаруженных в сигаретном дыме [7]. Ген локализован на 10q26.3, экспрессируется в большей степени в жировой ткани, слизистой оболочке пищевода, периферической крови.
При сравнении частоты генотипов и аллелей ADH2, ADH3, ALDH2, CYP2E1, IL1, IL6, IL8 и TNF у пациентов с хроническим панкреатитом, алкогольным циррозом печени и у здоровых индивидов было обнаружено, что частота CYP2E1 и ALDH2 была значительно ниже, чем в контроле [8]. В то же время не обнаружена связь между полиморфизмом CYP2E1 и алкогольным панкреатитом в азиатской популяции [9, 10]. Носители генотипа m2/ m2 CYP1A1 могут быть более склонны к развитию алкогольного цирроза и алкогольного панкреатита [11]. Установлена связь полиморфизма P450 CYP1A1 Ile105Val с повышенным риском развития хронического панкреатита [12]. В результате транзиции A→G, приводящей к замене изолейцина на валин в кодоне 462 молекулы цитохрома (Ile462Val), активность продуцируемого фермента увеличивается в два раза по сравнению с исходным белком, что может привести к увеличению концентрации недоокисленных промежуточных токсичных метаболитов и накоплению свободных радикалов [13–15].
Таким образом, полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков могут иметь отношение к развитию ОП. Целью работы было определить связь ОНП генов CYP1A1 -462 T>C rs1048943, CYP2E1 -1293 G>C rs3813867 и ABCB1 -3435 G>A rs1045642 с развитием ОП и его осложнений.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Образцы ДНК для исследования получали от 547 неродственных больных ОП (154 женщины и 393 мужчины), находившихся на стационарном лечении в хирургических отделениях города Курска в период 2012–2015 гг., и 573 неродственных индивида без заболеваний ЖКТ (161 женщина и 412 мужчин). Средний возраст больных составил 48,9 ± 13,1, здоровых лиц — 47,8 ± 12,1. Критерии включения пациентов в основную группу: 1) установленный диагноз острого панкреатита; 2) возраст 18–80 лет; 3) отсутствие патологии органов билиарной системы: желчно-каменной болезни, пороков развития ПЖ (pancreas divisum), травм поджелудочной железы, в том числе операционной или после эндоскопических манипуляций; 4) отсутствие в анамнезе приема панкреатотоксичных лекарственных препаратов (гипотиазида, НПВС, стероидных противовоспалительных средств), аутоиммунных, инфекционных, аллергических заболеваний (лаки, краски), дисгормональных процессов при беременности и менопаузе, заболеваний близлежащих органов ЖКТ; 5) отсутствие наследственной отягощенности по ОП. Критерии исключения: несоответствие критериям включения.
Диагноз ОП устанавливали с использованием современной классификации ОП, разработанной Российским обществом хирургов в 2014 г. с учетом классификации Атланта-92 и ее модификаций, предложенных в г. Кочин в 2011 г. Международной ассоциацией панкреатологов и Международной рабочей группой по классификации острого панкреатита [16, 17] с использованием общеклинических, лабораторных (общий и биохимический анализ крови) и инструментальных методов исследования (УЗИ и МРТ поджелудочной железы, эзофагогастродуоденоскопии).
При анкетировании участников исследования у всех пациентов учитывали наличие вредных привычек — курения и злоупотребления алкоголем как основных факторов риска развития ОП [18, 19].
В зависимости от количества потребляемого алкоголя в неделю участников исследования подразделили на две группы: 1) лица, употреблявшие алкоголь менее 200 г в перерасчете на этанол в неделю; 2) лица, употреблявшие алкоголь более 200 г в перерасчете на этанол в неделю. Данное значение выбрали в качестве порогового, так как оно представляет собой медиану (в граммах чистого этанола) среди максимальных уровней «безопасного потребления алкоголя» (safe alcohol intake) в неделю, одобренного во многих странах в соответствии с национальными рекомендациями по уровню потребления спиртных напитков [20]. По частоте употребления алкоголя участники исследования были разделены на две группы:
1) лица, употребляющие алкоголь 1–2 дня в месяц или реже;
2) лица, употребляющие алкоголь 1 день или более в неделю.
Согласно стажу употребления алкоголя все пациенты были разделены на две группы:
1) лица с продолжительностью употребления алкоголя до 10 лет;
2) лица, употребляющие алкоголь в течение 10 лет или более.

У пациентов проводили забор цельной венозной крови объемом 5–10 мл в пластиковые пробирки с 0,5 М ЭДТА. Затем кровь замораживали и хранили в морозильных камерах при температуре –20 °С до выделения геномной ДНК. Выделение ДНК проводили стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции и преципитации этанолом. Сначала проводили лизис лейкоцитов. Для этого лейкоцитарную массу, осажденную дважды центрифугированием с Na^- фосфатным буфером (pH = 7,8), подвергали лизису в растворе, содержащем ТЕ-буфер, протеиназу К и 0,4% додецилсульфат натрия (SDS) в течение 12 ч при температуре 42 °С. Затем из полученного клеточного лизата выделяли геномную ДНК: сначала с помощью фенола и 10 мМ Трис-HCl (рН = 8,0), затем фенола и хлороформа (в соотношении 1 : 1) и на заключительном этапе — хлороформа. Геномную ДНК преципитировали ледяным 96%-м этанолом, высушивали на воздухе, растворяли в ТЕ-буфере, измеряли концентрацию ДНК, замораживали при температуре –20 °С до выполнения генотипирования ДНК-полиморфизмов.
Генотипирование CYP1A1 -462 T>C rs1048943, CYP2E1 -1293 G>C rs3813867 и ABCB1 -3435 G>A rs1045642 проводили методом ПЦР в режиме реального времени путем дискриминации аллелей с помощью TaqMan-зондов на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories; США) с использованием коммерческих наборов реактивов TaqMan SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems; США). Повторное генотипирование 10% исследованных образцов, отобранных по случайному принципу и при отсутствии информации о статусе болезни, показало 100%-ю воспроизводимость оригинальных результатов. Для сравнения категориальных переменных между группами использовали критерий χ2 Пирсона, для сравнения количественных переменных — критерии Стьюдента (для нормально распределенных признаков) и Манна–Уитни (для признаков, отличных от нормальных). Для анализа соответствия распределения частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга (РХВ) и сравнения частот аллелей и генотипов между группами использовали критерий χ2 Пирсона. Ассоциации аллелей и генотипов с риском развития панкреатита оценивали по величине отношения шансов (OR). Статистический анализ осуществляли с использованием программы Statistica 6.0 (StatSoft; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ассоциации изучаемых полиморфизмов генов CYP1A1 T>C и CYP2E1 G>C с риском развития ОП не были обнаружены (табл. 1).
Носители аллеля А гена ABCB1 G>A (rs1045642) обладали повышенным риском развития ОП, а носители генотипа G/G, напротив, пониженным.
При отсутствии длительного злоупотребления алкогольными напитками носители генотипов G/C–C/C CYP2E1 G>C (rs3813867) редко страдали ОП (табл. 2).
Носители генотипов C/C CYP1A1 T>C (rs1048943) чаще страдали инфицированным панкреонекрозом, в отличие от носителей генотипов G/G ABCB1 G>A (rs1045642) (табл. 3).
У носителей генотипов C/C CYP1A1 T>C (rs1048943) и G/C CYP2E1 (rs3813867) чаще развивалась ПК, а G/G ABCB1 G>A rs1045642 — реже (табл. 4).
Наиболее часто ОП осложняло развитие ГНП у носителей генотипа C/C CYP1A1 T>C (rs1048943) и редко у носителей генотипа G/G ABCB1 G>A (rs1045642) (табл. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В процесс биотрансформации, включающий ферментативное превращение чужеродных включений, или ксенобиотиков, и состоящий из трех фаз: активации, собственно детоксикации и выведения, вовлечено множество ферментов [:lit_21, 22]. Роль генов ФБК (CYP2E1 и CYP1A1) в развитии алкогольного панкреатита и цирроза печени изучали у употребляющих алкогольные напитки бразильцев; ассоциации с панкреатитом установлено не было [11].
Известно, что цитохромы Р450 осуществляют биоактивацию полициклических ароматических углеводородов. Установлено, что CYP1A1 отсутствует в нормальной ткани, а экспрессируется лишь под действием ксенобиотиков. Обнаруженная нами ассоциация генотипа C/C CYP1A1 T>C (rs1048943) с повышенным риском развития ОП, возможно, свидетельствует об изменении активности фермента и увеличении концентрации недоокисленных токсичных метаболитов, агрессивно влияющих на ткань поджелудочной железы.
Роль полиморфизмов гена CYP2E1 в развитии острого панкреатита до настоящего времени не изучали, но опубликованы данные о том, что минорный аллель CYP2E1 может обладать протективным эффектом при отравлении метанолом [23]. В нашем исследовании носители генотипов G/C CYP2E1 (rs3813867) чаще страдали ОП, однако при отсутствии воздействия фактора риска злоупотребления алкогольными напитками более 10 лет носители генотипов G/C–C/C CYP2E1 G>C (rs3813867) были устойчивее к воздействию алкоголя и редко страдали ОП.
Ген ABCB1 кодирует Р-гликопротеин, который является эффлюксным транспортером и участвует в выведении ксенобиотиков, препятствуя их накоплению в органах и тканях [24]. Изучение вклада полиморфного варианта rs1045642 гена ABCB1 в развитие артериальной гипертензии и оценка результатов лечения амлодипином в различных популяциях [25–27] показали высокий антигипертензивный эффект в группе ТТ, который авторы объяснили снижением экспрессии ABCB1. Те же авторы обнаружили связь генотипа ТТ с более высоким риском геморрагических осложнений при приеме дабигатрана после артропластики коленного сустава. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что снижение экспрессии ABCB1 негативно отражается на способности к детоксикации алкоголя и у носителей аллеля А повышает риск развития ОП.
В целом, более легкое течение ОП было характерно для носителей генотипов G/G ABCB1 G>A (rs1045642), тяжелое — для носителей C/C CYP1A1 T>C (rs1048943).

ВЫВОДЫ

Проведенное нами изучение вклада ОНП генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в развитие ОП у жителей Курской области позволило не только выявить  ассоциации генотипов с развитием ОП и его осложнений, но и установить триггерное влияние факторов риска на развитие заболевания у носителей определенных генотипов. Основываясь на анализе генетических факторов, таких как полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, можно осуществлять прогнозирование вероятности развития ОП и особенностей его клинического течения, что открывает возможности ранней диагностики болезни и проведения необходимых профилактических мероприятий по ее предупреждению. Исследование генетических полиморфизмов может оказаться полезным для прогнозирования исходов заболевания и разработки персонализированных подходов к лечению и профилактике.