Klebsiella pneumoniae — одна из наиболее частых причин заболеваний, требующих оказания медицинской помощи [1]. Особую обеспокоенность вызывают появление и глобальное распространение отдельных сиквенс-типов K. pneumoniae высокого риска, которые обладают множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) [2, 3]. В первую очередь это относится к карбапенемрезистентным (карба-Р) K. pneumoniae, поскольку устойчивость к карбапенемам в большинстве случаев сочетается с резистентностью к другим антимикробным препаратам, что существенно ограничивает возможности терапии. Согласно данным мультилокусного сиквенс-типирования (МЛСТ), большинство карба-Р-изолятов принадлежит к узкому ряду сиквенс-типов, доминирующих в структуре госпитальных популяций повсеместно [4, 5]. В настоящее время к числу глобально диссеминированных относят МЛУ-сиквенс-типы ST14/15, ST17/20, ST43, ST147, ST258, ST395 [5, 6], а также ST307, который приобрел значимость сравнительно недавно [7].

Одним из препаратов, сохраняющих активность в отношении карба-Р грамотрицательных организмов, является поликатионный антибиотик колистин (полимиксин Е). Возросшее использование колистина в клинике на фоне распространения устойчивости к карбапенемам привело к появлению колистинрезистентности [4, 8], которая может существенно снижать эффективность антимикробной терапии и проявляться увеличением показателей смертности инфицированных колистинрезистентными (кол-Р) K. pneumoniae [9].

Устойчивость к колистину обусловлена модификацией липополисахарида (ЛПС), например, путем изменения его структуры, что снижает связывание антибиотика с клеточной стенкой бактерии [10]. Модификация ЛПС связана с повреждением двухкомпонентной системы PhoPQ/PmrAB и ее регулятора MgrB в результате мутаций гена mgrB, а также с плазмидными mcr-подобными генами [8, 10].
Мутации, приводящие к развитию устойчивости, дают бактериям преимущество над чувствительными штаммами в присутствии антибиотика, однако формирование и поддержание резистентности могут быть сопряжены с определенными биологическими затратами. Последние могут быть выражены в снижении темпов роста и уменьшении конкурентоспособности (т. е. уровня поддержания жизнедеятельности, который обозначают термином «бактериальный фитнес») [11, 12] по сравнению с чувствительными штаммами в отсутствие селективного действия антибиотика [13, 14]. С учетом того, что устойчивость к колистину связана с модификацией важнейшего компонента клеточной стенки бактерий — ЛПС, колистинрезистентность может быть сопряжена со снижением бактериального фитнеса.

Целью работы было охарактеризовать генотипы карба-Р-изолятов K. pneumoniae, выделенных у пациентов хирургических отделений и отделений реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) в г. Москве, и описать молекулярные механизмы устойчивости к колистину, а также исследовать влияние колистинрезистентности на кинетику роста и конкурентоспособность этой популяции бактерий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследовали 159 карба-Р-изолятов K. pneumoniae (минимальная подавляющая концентрация (МПК) меропенема больше 8 мг/л и МПК имипенема больше 4 мг/л, согласно критериям EUCAST) [15], чувствительные и резистентные к колистину, собранные в течение 2012–2017 гг. в г. Москве от пациентов хирургических отделений и ОРИТ. В коллекцию были включены только недублирующиеся изоляты, т. е. от одного пациента — один изолят K. pneumoniae, включая изоляты из стерильных локусов (кровь, моча, ликвор), из респираторного тракта (аспират, мокрота), стомы, раны, зева, ануса.

МПК к меропенему, имипенему и тигециклину определяли с помощью метода Е-тестов (BioMerieux; Франция) на среде Мюллера–Хинтона (Bio Rad; Франция). Чувствительность к аминогликозидам (гентамицину, нетилмицину, амикацину), ципрофлоксацину, фосфомицину, цефотаксиму, цефепиму, цефтазидиму оценивали на автоматизированном бактериологическом анализаторе VITEK 2 Compact (BioMerieux; Франция). Субстанцию колистина в форме порошка (Sigma Aldrich; Германия) использовали для определения МПК колистина с помощью метода микроразведений в соответствии с Национальным стандартом Российской Федерации (ГОСТ Р ИСО 20776-1- 2010). В качестве контроля использовали штамм Escherichia coli ATCC 25922. Согласно критериям EUCAST [15], пограничные значения МПК колистина для K. pneumoniae составляют: чувствительные ≤ 2 мг/л, резистентные > 2 мг/л.

Выявление и/или секвенирование по методу Сенгера генов mcr-1, mgrB, pmrA, pmrB, phoP и phoQ, исследование аминокислотных последовательностей белков PmrA, PmrB, PhoP и PhoQ проводили согласно ранее описанным процедурам [16]. В качестве контроля выявления гена mcr-1 использовали mcr-1-положительный штамм E. coli (штамм предоставил НИИ антимикробной химиотерапии ФГБОУ ВО СГМУ Минздрава России). Для генотипирования штаммов K. pneumoniae использовали метод МЛСТ [17]. Идентификацию вставочных элементов проводили с помощью базы данных ISfinder [18].

Для исследования бактериального фитнеса были отобраны колистинчувствительные (кол-Ч) изоляты и колистинрезистентные (кол-Р) изоляты с поврежденными mgrB и mgrB дикого типа. Использовали суточные культуры K. pneumoniae, выращенные на агаре Луриа– Бертани, или LB (HiMedia Laboratories Pvt. Limited; Индия), согласно ранее описанным протоколам исследования бактериального фитнеса [14]. Готовили взвесь из одной колонии в среде LB и инкубировали в орбитальном шейкере-инкубаторе ES-20 (BioSan; Латвия) при 37 °С в течение 3 ч при постоянном перемешивании 250 об./мин. Концентрацию микроорганизмов измеряли на проточном цитометре Novocyte (ACEA Biosciences; США).

Для сравнительного анализа кривых роста кол-Ч- и кол-Р-бактерий суспензию доводили до концентрации бактериальных клеток 5 × 106 в 1 мл. Полученную бактериальную взвесь в объеме 250 мкл инкубировали в 96-луночных плоскодонных планшетах в трех повторах для каждого штамма в присутствии колистина в концентрации 0, 1, 4, 16, 64 мг/л. Инкубацию проводили в многофункциональном микропланшетном ридере Infinite 200 (Tecan; Австрия) в течение 15 ч при 37 °С с параллельной оценкой оптической плотности при длине волны 600 нм (OП600) каждые 30 мин. Данные регистрировали при помощи программы Magellan 6.6 (Tecan; Австрия). В качестве индикатора интенсивности роста использовали значение площади под кривой роста (ПКР), которую рассчитывали от начала экспоненциального роста до выхода кривой на плато (рис. 1) и выражали в OП₆₀₀ за 1 ч.

Для оценки конкурентоспособности кол-Р- и кол-Ч- изолятов K. pneumoniae рассчитывали индекс конкуренции (ИК). Для этого суспензию кол-Р- и кол-Ч-изолятов доводили до концентрации 1,5 × 103 в 1 мл и смешивали в соотношении 1 : 1 (1,5 × 103 в 1 мл КОЕ каждого штамма). Смесь кол-Р- и кол-Ч-изолятов, а также суспензии кол-Р- и кол-Ч- изолятов по отдельности выращивали в среде LB при 37 °С и 180 об./мин в течение 16–18 ч. По окончании инкубации бактериальные суспензии разводили в 105 раз и с помощью автомата для посева easySpiral (Interscience; Франция) наносили по 10 мкл на чашки Петри с агаром LB без колистина и с агаром LB, содержащим 10 мг/л колистина. Инкубацию проводили при 37 °С в течение 16–18 ч.

Подсчет КОЕ производили с помощью автоматического счетчика Scan 500 (Interscience; Франция). ИК рассчитывали как отношение числа кол-Р-КОЕ на чашке LB с колистином к числу кол-Ч-КОЕ на чашке LB без колистина. ИК < 1 означал сниженную конкурентоспособность кол-Р-изолята по сравнению с кол-Ч-изолятом. Эксперименты выполняли в трех повторах.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM SPSS Inc; США). Значения ПКР и числа колоний представляли в виде медианы (Р25; Р75), значения ИК выражали в виде среднего (стандартное отклонение). Различия ПКР оценивали при помощи теста Краскела–Уоллиса, парные сравнения проводили с использованием теста Манна– Уитни. Различия считали значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика карба-Р-изолятов K. Pneumoniae

Все 159 карба-Р-изолятов K. pneumoniae обладали МЛУ- фенотипом, т. е. были резистентными по меньшей мере к трем классам антимикробных препаратов. Все штаммы были устойчивы к цефалоспоринам 3-го и 4-го поколений, а также имели высокий уровень резистентности к ципрофлоксацину (93%), фосфомицину (90%), нетилмицину (82%), гентамицину (84%), амикацину (50%) и колистину (45%). Большинство карба-Р-изолятов K. pneumoniae сохраняло чувствительность к тигециклину: только у 7% была отмечена резистентность.
По данным МЛСТ, исследованные карба-Р-изоляты были распределены между 18 сиквенс-типами, но большинство (86%) относилось к пяти доминирующим сиквенс-типам: ST307 (n = 46, 29%), ST395 (n = 40, 25%), ST377 (n = 17, 10%), ST48 (n = 17, 10%) и ST23 (n = 16, 10%).

Механизмы устойчивости к колистину

Резистентностью к колистину обладал 71 (45%) карба- Р-изолят K. pneumoniae, МПК колистина для которых варьировала от 4 до 1024 мг/л и более. Расшифровка молекулярных механизмов устойчивости к колистину была начата с поиска плазмидного гена mcr-1, который, по данным литературы, служит наиболее частой причиной резистентности [19]. Ни в одном из 71 кол-Р-изоляте K. pneumoniae ген mcr-1 обнаружен не был.
Далее мы исследовали структуру гена mgrB, с повреждением которого может ассоциироваться устойчивость к колистину. Изменения mgrB были обнаружены у 23 (32%) кол-Р-изолятов (табл. 1). В 4 (17%) изолятах была выявлена делеция всего локуса mgrB. У 13 (56%) изолятов mgrB был поврежден вставочными элементами четырех различных типов (IS1A, IS1R, ISKpn14 и ISKpn26) из семейств IS-1 и IS-5, внедренными в разные позиции mgrB (см. табл. 1). В гене mgrB у 6 (26%) кол- Р-изолятов был обнаружен новый мобильный элемент MITEKpn1, который охарактеризован в нашей недавней публикации [16].
Таким образом, 48 из 71 (68%) кол-Р-изолятов K. pneumoniae содержали ген mgrB дикого типа, что требовало поиска других механизмов устойчивости к колистину. С этой целью во всех 48 кол-Р-изолятах, имевших mgrB дикого типа, мы проанализировали аминокислотные последовательности белков PmrA, PmrB, PhoP и PhoQ, участвующих в процессах модификации ЛПС, повреждение которых может вызывать устойчивость к колистину [10]. Значимые изменения PmrA и/или PmrB были выявлены у трех изолятов, которые принадлежали к трем разным сиквенс-типам (ST307, ST395, ST48) с МПК колистина в диапазоне от 128 до 1024 мг/л и более (см. табл. 1).

Влияние устойчивости к колистину на бактериальный фитнес

Кинетика роста кол-Р- и кол-Ч-изолятов K. pneumoniae в отсутствие колистина различалась незначимо, медианы ПКР составили 4,2 (3,9; 4,3) и 4,05 (3,9; 4,6) ОП600 за 1 ч соответственно (p = 0,842; табл. 2). Добавление 1 мг/л колистина резко снижало ПКР кол-Ч-изолятов до 1,9 (0,95; 4,13) ОП600 за 1 ч (р = 0,065), а более высокие концентрации колистина ожидаемо полностью подавляли рост чувствительных изолятов (см. табл. 2). Кол-Р-изоляты K. pneumoniae сохраняли обычную кинетику роста при содержании колистина 1 мг/л и демонстрировали ее значимое снижение в присутствии 4 и 16 мг/л колистина (р = 0,016 и р < 0,001 соответственно). Почти полное угнетение роста кол-Р-изолятов обнаружено при добавлении колистина в концентрации 64 мг/л, когда ПКР составила 0,9 (0; 3,0) ОП600 за 1 ч (см. табл. 2).
При сравнении ПКР кол-Р-изолятов с поврежденным mgrB и mgrB дикого типа (см. табл. 2) оказалось, что статус mgrB незначимо влиял на кинетику роста бактериальной популяции вне зависимости от концентрации колистина.

Затем мы провели исследование 26 кол-Р-изолятов и рассчитали ИК в экспериментах по оценке конкурентоспособности относительно карба-Ч/кол-Ч-изолята K. pneumoniae при их совместном культивировании (рис. 2 см. табл. 2). Среднее значение ИК составило 0,15 (0,21), при этом у 25/26 (96%) кол-Р-изолятов ИК был < 1 и варьировал от 0,01 до 0,53, а один изолят имел ИК = 1. Изоляты с диким типом и повреждением mgrB обладали похожими ИК, которые составили 0,19 (0,26) и 0,1 (0,1) соответственно (р = 0,283; см. табл. 2). Таким образом, резистентность к колистину у подавляющего числа кол-Р- изолятов K. pneumoniae была ассоциирована со снижением конкурентоспособности по отношению к карба-Ч/кол-Ч- изолятам K. pneumoniae, которое не зависело от статуса гена mgrB.

Влияние устойчивости к колистину на бактериальный фитнес было дополнительно исследовано в карба-Р/кол-Ч и карба-Р/кол-Р парах K. pneumoniae, относившихся к одному сиквенс-типу. Для данных экспериментов были отобраны изоляты пяти наиболее распространенных (ST23, ST48, ST307, ST377 и ST395) и одного редкого (ST147) сиквенс-типов, среди которых в коллекции имелся минимум один кол-Ч-изолят (табл. 3). Конкурентоспособность всех кол-Р-изолятов ST48, ST147, ST307 и ST377 относительно кол-Ч-изолятов аналогичных сиквенс-типов была снижена, о чем свидетельствовал ИК < 1. Результаты исследования изолятов двух других сиквенс-типов, ST23 и ST395, не были так однозначны. Один кол-Р-изолят ST23 (ИК = 1,3) и два кол-Р-изолята ST395 (ИК = 1,87 и ИК = 2,5) продемонстрировали повышенный фитнес относительно своих кол-Ч-аналогов (см. табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Большинство карба-Р-изолятов K. pneumoniae в нашей коллекции относилось к пяти глобальным сиквенс- типам, причем два генотипа, ST307 и ST395, суммарно составляли 54%. По данным ряда авторов, ST307 ранее не входил в число доминирующих сиквенс-типов на территории нашей страны [20, 21], но в настоящее время становится одним из ведущих международных сиквенс- типов высокого риска [7], что согласуется с полученными нами данными.

Существенная доля (45%) исследованных нами карба-Р-изолятов была устойчива к колистину. По данным многоцентрового исследования «МАРАФОН» [2, 3], в большой выборке госпитальных K. pneumoniae распространенность кол-Р-изолятов была низкой, хотя и возросла с 4,5% в 2012 г. до 7,9% в 2014 г. Наши данные могут отражать общую тенденцию к повышению антибиотикорезистентности, которая затрагивает и устойчивость к колистину. Например, 15-летнее ретроспективное исследование в крупном госпитале в Афинах показало резкое увеличение доли кол-Р- изолятов K. pneumoniae из гемокультур с 0% в 2002 г. до 26,9% в 2016 [22]. Вместе с тем высокая частота встречаемости кол-Р-штаммов в нашей коллекции могла быть связана с преобладанием изолятов, полученных в отделениях реанимации и интенсивной терапии, где, по данным Feretzakis и соавт. [23], доля кол-Р-изолятов K. pneumoniae может кратно превышать долю таковых в других отделениях (40 против 13,8%). Кроме того, прямое сравнение исследований, в которых использованы различные способы тестирования устойчивости к колистину, может иметь известные трудности. Так, эпсилометрические E-тесты могут давать высокую долю ошибочных результатов по сравнению с референсным методом микроразведений, препятствуя выявлению реальной частоты колистинрезистентности [9, 20].

Наличие устойчивости к колистину не влияло на кинетику роста в отсутствие антибиотика и не зависело от статуса гена mgrB, что согласуется с результатами предыдущих исследований [24]. В противоположность этому, устойчивость к колистину у Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa сопровождается выраженными нарушениями динамики роста бактериальной популяции [13, 25], что может объяснять сравнительно высокую распространенность энтеробактерий с хромосомной устойчивостью к колистину по сравнению с кол-Р A. baumannii и P. aeruginosa.

В то же время подавляющее большинство кол-Р-изолятов демонстрировали снижение конкурентоспособности по сравнению с кол-Ч-изолятами K. pneumoniae, что характерно и для других видов бактерий, в частности A. baumannii [13] и P. aeruginosa [25]. Описано снижение бактериального фитнеса у кол-Р K. pneumoniae, являющихся носителями гена mcr-1 [26].

Интересные результаты были получены в конкурентных экспериментах с кол-Р- и кол-Ч-изолятами K. pneumoniae одного сиквенс-типа, т. е. бактериями с очень схожим генотипом, но различающимися чувствительностью к колистину. Было исследовано шесть разных сиквенс- типов, и большинство протестированных кол-Р-изолятов демонстрировали снижение ИК. В то же время у двух кол-Р-ST395-изолятов и одного кол-Р-ST23-изолята уровень конкурентоспособности оказался выше, чем у кол-Ч- изолятов аналогичных ST.

Это можно объяснить наличием в их геноме возможных компенсаторных мутаций, как было описано в случае с резистентностью к фторхинолонам и колистину у Escherichia coli [27] и A. baumannii [28]. Компенсаторные мутации в противовес мутациям, приводящим к резистентности, увеличивают бактериальный фитнес резистентных изолятов и тем самым способствуют распространению устойчивости даже в отсутствие селективного воздействия антибиотика [27, 28].
Таким образом, устойчивость к колистину широко распространена в популяции карба-Р-изолятов K. pneumoniae, выделенных у пациентов в г. Москве. Настораживающая эпидемиологическая ситуация в отношении кол-Р-бактерий требует проведения дальнейшего тщательного мониторинга.

ВЫВОДЫ

Среди сиквенс-типов карба-Р-изолятов K. pneumoniae в нашей коллекции лидируют ST307 и ST395, а ведущим механизмом устойчивости к колистину является изменение гена mgrB различными вставочными элементами.
Изучение бактериального фитнеса кол-Р-изолятов K. pneumoniae позволило определить, что устойчивость к колистину не влияет на кинетику роста в его отсутствие и не зависит от статуса гена mgrB; подавляющее большинство кол-Р-изолятов K. pneumoniae имеют сниженную конкурентоспособность по сравнению с кол-Ч-изолятами, однако в рамках одного сиквенс-типа встречаются кол- Р-изоляты с повышенной конкурентоспособностью. Это определяет необходимость дальнейшего исследования бактериального фитнеса для понимания причин распространения резистентности к колистину среди энтеробактерий.