В последнее десятилетие во всем мире отмечен рост числа случаев туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ ТБ) [1]. Терапия МЛУ ТБ включает выполнение сложных и длительных лечебных протоколов, что негативно влияет на приверженность пациента к лечению. Поэтому перспективным направлением является разработка лекарственных форм противотуберкулезных препаратов (ПТП) пролонгированного действия, в частности активных субстанций, инкапсулированных в биорезорбируемые полимерные микрокапсулы, обеспечивающие контролируемый пространственный и временной выход препарата из полимерной структуры в окружающие ткани на протяжении 1–4 недель [2]. Применение сверхкритических флюидных технологий (СКФ) позволяет создавать универсальные экологически безопасные микронизированные системы, обеспечивающие полное отсутствие примесей органического растворителя [3]. Время выхода препарата из полимерного носителя во многом зависит от свойств полимерной матрицы (микрочастицы): состава, дисперсности и морфологии микрочастиц носителя. Причем в ряде случаев возможна ситуация, когда лекарственная субстанция располагается преимущественно на поверхности и в приповерхностной области, что приводит к быстрому и плохо контролируемому росту концентрации препарата во внешней среде. Такой высокий начальный выброс препарата представляет собой существенную проблему при использовании полимерных носителей, так как может оказывать токсическое воздействие на организм [4–6].

Для предварительной оценки кинетики высвобождения препарата из полимерных микрочастиц и матриксов используют УФ-спектрофотометрию, которая позволяет определить накопление препарата в фосфатно-солевом буфере в процессе инкубации полимерного носителя [4]. Тем не менее эта модель оценки кинетики очень приблизительна, поскольку для роста бактерий, и особенно микобактерий туберкулеза (МБТ), необходимы многокомпонентные среды, включающие большое число питательных веществ [7], что создает существенные помехи для УФ-спектрометрии и не позволяет использовать этот метод для оценки высвобождения препарата из носителя в условиях, приближенных к естественным.

Поэтому целью исследования была разработка in vitro модели для оценки высвобождения ПТП из полимерных носителей в среде, подходящей для культивирования микобактерий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве лекарственной субстанции для включения в биорезорбируемый носитель был выбран левофлоксацин (LFX) — препарат, обязательный в схеме лечения туберкулеза с МЛУ.
Было запланировано адаптировать модель для работы в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960. Преимущества использования системы BACTEC MGIT 960 обусловлены высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO 9001 производств реагентов и сред, а также применением стандартных протоколов исследования [8]. В системе ВАСТЕС MGIT 960 культивирование микроорганизмов производят в специальных пробирках MGIT, на дне которых расположен связанный флюорофор под полупроницаемой мембраной. Высвобождение флюорофора и испускание света определенной волны прямопропорционально зависят от потребления микобактериальными клетками кислорода в среде: чем больше активно делящихся клеток, тем интенсивнее они потребляют кислород и тем выше светимость флюорофора. Значимым параметром для определения антимикобактериального эффекта является время начала роста культуры под действием соединения. Существенная (более трех суток) задержка начала роста культуры M. tuberculosis, по сравнению с контролем без препарата, свидетельствует о гибели части микобактериальной популяции под действием тестируемого соединения.

Инкапсулированные формы LFX

В качестве исходного материала для формирования биорезорбируемых полимерных носителей левофлоксацина использовали полилактогликолид (ПЛГ) марки Purasorb PDLG7502 (CorbionPurac; Нидерланды) с вязкостью 0,2 дл/г. В качестве активной субстанции использовали левофлоксацин (Sigma-Aldrich; США). Диоксид углерода марки ОСЧ (99,998%, «НИИКМ; Россия) использовали без дополнительной очистки. Антибиотик в количестве 10 мас.% (100 мг LFX на 900 мг полимера) инкапсулировали в ПЛГ-матриксы в пресс-формах цилиндрической формы с использованием сверхкритической флюидной пластификации исходной смеси с ПЛГ и LFX в среде диоксида углерода и ее последующего вспенивания при сбросе давления CO₂ до атмосферного. Микрочастицы со средним размером частиц 50 и 100 мкм получали путем криоизмельчения матриксов в роторной мельнице с применением сухого льда (подробнее см. [4]).
Согласно разработанной модели рассчитанное количество полимерного носителя с инкапсулированным LFX инкубировали в среде Middlebrook 7H9 при 37 °С в течение 66 суток с отбором проб среды с выделившимся LFX в установленные сроки.

Культура МБТ

Исследование проводили на лабораторном чувствительном штамме M. tuberculosis H37Rv из коллекции ФГБНУ «Центральный НИИ туберкулеза». Во всех экспериментах использовали стандартизированную по КОЕ культуру M. tuberculosis, находящуюся в логарифмической фазе роста и представляющую собой суспензию одиночных (неслипшихся) клеток. Для получения суспензии бактериальную массу, выросшую на среде Левенштейна– Йенсена, пассировали при 37 °С на бульоне Дюбо (Difco; США) c 0,5% БСА на протяжении двух циклов по 14 дней. Далее серийные 10-кратные разведения суспензии, профильтрованной через фильтр 5 мкм (Millipore; США), наносили в виде капель (объем капель — 20 мкл) на чашки Петри с агаром Дюбо (Difco; США). Чашки Петри культивировали при 37 °С, а исходную суспензию хранили при 4 °С. Через 3–4 суток культивирования производили подсчет микроколоний с использованием инвертированного микроскопа Olympus (Olympus; США) ×200. Стандартизированную суспензию микобактерий в объеме 500 мкл засевали на жидкую среду Middlebrook 7H9 (BD; США) с обогатительной добавкой OADC в пробирки MGIT для последующей автоматической детекции роста микобактерий в системе BACTEC MGIT 960 (BD; США).

Оценка бактериостатической активности на BACTEC MGIT 960

Бактериостатическую активность соединения оценивали по наличию или отсутствию роста в пробирке с определенной концентрацией препарата. Предварительно проведенное исследование в системе BACTEC MGIT960 на культуре с различным числом КОЕ МБТ показало, что снижение КОЕ не менее чем на 75% (75%-я ингибиция роста) приводит к задержке начала роста культуры от трех дней, не менее 90% — от восьми дней, 99% — от 16 дней, 99,9% — 21 дня и т. д. [9]. Время проведения эксперимента составляло 42 дня, согласно протоколу производителя. Все выросшие культуры подвергали контролю на видовую специфичность (принадлежность к микобактериям туберкулеза). Для определения кислотоустойчивости выросшей культуры проводили микроскопию мазков по Ziehel–Neelsen. Если в положительной пробирке MGIT подтверждалось присутствие кислотоустойчивых бактерий, проводили иммунохроматографический экспресс-тест BD MGIT TBc ID согласно инструкции изготовителя. Для контроля роста в системе BACTEC MGIT 960 неспецифичной микрофлоры проводили посев культуры на кровяной агар. При появлении роста микроорганизмов на кровяном агаре через 24 ч инкубации при 37 °С делали вывод о контаминации исследуемого материала неспецифичной микрофлорой.

Методы статистического анализа

При оценке результатов исследования использовали описательную статистику. Все микробиологические эксперименты проводили трехкратно. Для анализа данных использовали Microsoft Office Excel 2019 (Microsoft; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходя из того что для оценки накопления препарата в среде по динамике роста МБТ была использована система BACTEC MGIT960, от непосредственного размещения полимерного носителя с препаратом в пробирке MGIT, используемой в системе BACTEC MGIT 960, решено было отказаться по ряду причин. Во-первых, полимер мог влиять на светимость флюорофора и искажать результаты эксперимента, а во-вторых, при таком построении эксперимента возможна оценка только по конечной точке высвобождения, а не в динамике от первых часов до нескольких дней.
Поэтому полимерный носитель с инкапсулированным препаратом был помещен в культуральную среду Middlebrook 7H9 (эту же среду использовали в пробирках MGIT). Через определенные промежутки времени отбирали пробы среды с выделившимся препаратом (по 100 мкл среды на точку). Количество инкубируемого в среде инкапсулированного в полимерный носитель левофлоксацина рассчитывали таким образом, чтобы при высвобождении всего LFX в 100 мкл среды достигалась концентрация, достаточная для того, чтобы при добавлении этого объема в пробирку MGIT концентрация препарата в среде была равна минимальной ингибирующей концентрации (МИК) LFX.

При учете особенности включения LFX в полимерный носитель (поверхностное или равномерное включение) исходили из того, что поверхностно расположенный препарат будет легко удален из носителя при интенсивной отмывке. Отмывку полимерного носителя проводили средой Middlebrook 7H9 однократно. Для этого полимерный носитель в центрифужной пробирке заливали стерильной средой объемом 30 мл, интенсивно встряхивали на вортексе, затем центрифугировали в режиме 3000 g при комнатной температуре 5 мин и полностью отбирали супернатант. Отмытый таким образом полимерный носитель использовали в эксперименте. Учитывая возможность поверхностного расположения препарата в полимере, в опыте с отмывкой носителя брали в 2 раза большее количество препарата, чем в опыте с неотмытым носителем, чтобы оставалась вероятность зарегистрировать бактериостатический эффект даже при элиминации части препарата с поверхности. Так, в опыте без отмывки в 30 мл культуральной среды инкубировали 6,3 мг полимера с включенным LFX (содержание LFX составило 0,63 мг). В опыте с отмывкой в 30 мл культуральной среды инкубировали 12,6 мг полимера с включенным LFX (содержание LFX составило 1,26 мг).

Таким образом, предложенная модель представляет собой два параллельно проводимых опыта с высвобождением препарата в культуральную среду: с нативной и отмытой инкапсулированными формами LFX. Сравнивая результаты двух опытов, можно уточнить кинетику выхода препарата в питательную среду. Например, ситуация быстрого бактериостатического эффекта, достигнутого при использовании среды, где инкубировали нативную инкапсулированную форму LFX, при отсутствии эффекта с аликвотами среды, в которой инкубировали отмытую инкапсулированную форму, будет свидетельствовать о том, что весь препарат (или большее его количество) располагался на поверхности полимера. При отсроченном бактериостатическом эффекте в опыте с отмывкой инкапсулированной формы по сравнению с нативной можно заключить, что определенная доля препарата при синтезе распределилась в полимере равномерно, а часть — поверхностно. В случае отсроченного бактериостатического эффекта в опыте без отмывки по сравнению с опытом с отмывкой носителя можно заключить, что препарат равномерно распределен в полимере и постепенно высвобождается (так как в опыт с отмывкой отбирали в 2 раза больше носителя с препаратом, то и эффект наступает раньше).

Влияние диапазона концентраций LFX на динамику роста M. tuberculosis H37Rv

Для определения количества инкапсулированных форм LFX, необходимого для исследования кинетики высвобождения препарата в культуральной среде, было исследовано влияние ряда концентраций LFX на рост лабораторного штамма МБТ. Для этого стандартизированную культуру инкубировали с LFX в концентрации от 0,031 до 0,4 мкг/мл в системе BACTEC MGIT 960. В качестве контроля использовали культуру без добавления препарата (табл. 1). Было показано, что МИК LFX в отношении используемого в эксперименте штамма составила 0,25 мкг/мл. На основании полученных данных была построена зависимость доза– эффект (:media_;), которую использовали в дальнейшем для определения выхода LFX из полимерного носителя в культуральную среду.

Исследование кинетики высвобождения LFX из биорезорбируемых полимеров в культуральной среде по оценке динамики роста культуры M.tuberculosis H37Rv

По описанному выше дизайну были исследованы инкапсулированные формы LFX в трех вариантах полимерных носителей — ПЛГ-матрикса и частиц размером 50 и 100 мкм. В качестве контроля использовали культуру МБТ без добавления препарата и культуру с добавлением проб среды, в которой культивировали интактный ПЛГ-матрикс (без включения LFX). Результаты представлены в табл. 2.
Таким образом, при использовании в качестве носителя частиц ПЛГ размером 50 и 100 мкм обнаружен немедленный бактериостатический эффект в опыте с нативным носителем и отсроченный — в опыте с отмывкой носителя, из чего можно заключить, что большая часть LFX распределена по поверхности полимера (не менее 60%): уже через 3 ч инкубации неотмытого полимера в культуральную среду высвободилось количество препарата (0,15–0,20 мкг/мл), достаточное для ингибирования роста более 90% популяции микобактериальных клеток.

В случае с LFX, включенным в ПЛГ-матрикс, наоборот, отсроченный бактериостатический эффект был отмечен в опыте без отмывки носителя (на первый день с отмывкой и на 29-й день — без отмывки), что свидетельствует о том, что LFX достаточно равномерно распределен в матриксе и высвобождается постепенно. Кроме того, результат, полученный в опыте с отмывкой, показывает, что часть препарата была сосредоточена в приповерхностной области: был отмечен выход 25% LFX уже в первые сутки, что выражалось в подавлении роста 25% микобактериальных клеток, далее отмечено равномерное высвобождение препарата до 50% к 45-м суткам (полное подавление роста культуры вследствие достижения МИК LFX, равного 0,25 мкг/мл).
Рост культуры с аликвотами среды, в которой инкубировали матрикс без препарата, не отличался от роста культуры без добавления препаратов, что говорит об адекватности разработанной модели.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Разработанная модель и проведенные экспериментальные исследования позволяют оценить кинетику высвобождения противотуберкулезных препаратов в культуральной среде по подавлению роста культуры M. tuberculosis in vitro. Ранее испытания антимикобактериальной активности in vitro проводили только для липосомных форм инкапсулированных препаратов, использование которых не подразумевало постепенного высвобождения препаратов, а лишь способствовало их доставке к очагу туберкулезной инфекции. При подобных испытаниях применяли классические схемы исследования in vitro, нацеленные на оценку эффективности действия инкапсулированных форм препарата по сравнению с чистой субстанцией и оценку непосредственного токсического действия оболочки липосомы на микобактерии [10–12]. Препараты с пролонгированным высвобождением в модели in vitro изучали в отношении бактерий, не относящихся к роду   Mycobacterium, например, на Staphylococcus aureus, с построением графика зависимости время–эффект при культивировании бактерий в присутствии полимерного носителя с инкапсулированным антибиотиком [13].

Антимикробное действие инкапсулированных противотуберкулезных препаратов изучали преимущественно в моделях in vivo. При испытании на моделях туберкулеза мыши и кролика микрочастиц на основе ПЛГ с включением рифампицина [14], изониазида [15, 16], этионамида [17], комбинации рифампицина и изониазида [18], рифампицина и циклосерина [19] были показаны их высокая противотуберкулезная активность, пролонгированный эффект и сниженная токсичность по сравнению с традиционными формами препаратов. Использование экспериментальных животных для испытания инкапсулированных препаратов пролонгированного действия, с одной стороны, существенно облегчает практическую составляющую эксперимента и интерпретацию результата, так как здесь используют естественную фармакокинетику высвободившегося из носителя препарата. С другой стороны, модель in vivo из-за высоких финансовых затрат на проведение эксперимента (закупка и содержание линейных животных) и по этическим причинам не позволяет проводить скрининговые исследования большого числа носителей и включенных в них препаратов. Разработка моделей, позволяющих оценивать рост культуры M. tuberculosis при накоплении препарата в среде и под действием препарата, выделившегося в среду за определенный промежуток времени, весьма перспективна благодаря возможности испытания большого числа комбинаций носитель– препарат для отбора наилучшего варианта и дальнейшего испытания in vivo.
Анализ полученных результатов позволяет также ответить на вопрос, требуется ли предварительная подготовка носителя с препаратом перед экспериментом (нужна отмывка от поверхностно расположенного препарата или нет), и определить необходимое количество носителя с препаратом для эксперимента in vivo с учетом предварительной подготовки и кинетики высвобождения.

ВЫВОДЫ

Разработана модель in vitro, позволяющая проводить скрининг инкапсулированных пролонгированных форм противотуберкулезных препаратов. Применение такого подхода для оценки пролонгированных форм препаратов позволяет отобрать наиболее перспективную композицию (мало поверхностно расположенного препарата, равномерное высвобождение на протяжении всего срока эксперимента). Результаты, полученные для трех инкапсулированных форм LFX в биорезорбируемых полимерных носителях из ПЛГ, показали, что кинетика накопления препарата в среде существенно зависит от вида полимерного носителя и наиболее перспективен матрикс, который хорошо включает в себя LFX и достаточно равномерно высвобождает его при инкубации в среде.
В целом, разработанная модель может быть полезна не только для скрининга антимикобактериальной активности инкапсулированного левофлоксацина, но и для скрининга инкапсулированных форм любых других ПТП. Проведение такого скринингового исследования перед испытаниями in vivo позволит существенно снижать материальные затраты и, несомненно, более приемлемо с точки зрения биоэтики.