Целью триазолов является продукт гена ERG11 — цитохром-P450-стерол-14a-деметилаза (CYP51). Фермент CYP51 превращает ланостерол в эргостерол, являясь частью пути биосинтеза основного компонента мембраны клеток грибов [1]. Ингибирование синтеза эргостерола замедляет развитие мицелиальных клеток за счет накопления токсичных стероидов, таких как метилированный стерол [2–4], нарушая целостность мембраны, текучесть и проницаемость [5]. Флуконазол (Fluc) действует как конкурентный ингибитор CYP51 и в настоящее время эффективен для лечения многих патогенных грибов.

Для лечения микозов и устойчивости к противогрибковым лекарственным средствам необходима разработка новых классов соединений. Противомикозные препараты относительно трудно разрабатывать по сравнению с антибактериальными из-за эукариотической природы клеток, к тому же противогрибковые препараты, основанные на триазольных соединениях, такие как флуконазол, постепенно становятся недостаточными для лечения многих инфекций. Необходимость разработки новых лекарственных средств побуждает к изучению молекулярных механизмов ингибирования препаратов триазола, что позволит понять молекулярную основу аффинности и специфичности флуконазола.

Ранее молекулярное моделирование использовали для поиска аналогов пиразола. Их искали, исходя из структуры белка CYP51-Ca [6, 7]. Кроме того, с помощью молекулярного моделирования выяснили особенности и механизмы взаимодействия различных ингибиторов с CYP51 [8] и роль мутаций в стабильности и аффинности связывания ферментов [9, 10]. Молекулярная динамика позволила также исследовать причины наибольшего сродства флуконазола к ферментам грибов по сравнению с микобактериальными и человеческими ортологами [11]. Недавно был опубликован обзор стратегий моделирования, используемых для конструирования лигандов для P450 [12].

На основании анализа баз данных был найден набор консервативных аминокислот (AA) [13, 14]. Из них с помощью молекулярно-динамического моделирования выделили три, играющие решающую роль в связывании белка с ингибитором: треонин (Thr77), аланин (Ala258) и лизин (Lys454) [8].

Хотя исследования молекулярной механики могут предсказать аминокислоты, участвующие в образовании комплекса белок–ингибитор, важно иметь набор экспериментальных методов, позволяющих проверить результаты моделирования. Экспериментальный подход, основанный на масс-спектрометрии c электрораспылительной ионизацией (ЭРИ-МС), может оказаться надежным методом для прогнозирования взаимодействий хозяин–гость и быть комплементарным теоретическим расчетам, в которых использованы модели молекулярной механики.

ЭРИ-МС широко используют для изучения нековалентных взаимодействий белков и других биомолекул [15–17]. Процедура мягкой ионизации позволяет молекулярным комплексам сохранять в газовой фазе информацию об их структуре в растворе [18]. За последние десятилетия резко растущее число статей, посвященных изучению нековалентных взаимодействий с помощью МС, свидетельствует о том, что МС стала важной технологией в этой области благодаря высокой скорости анализа, чувствительности и использованию малых объемов образцов [19]. МС использовали для исследования взаимодействий хозяина и гостя [20–25].

Нековалентные взаимодействия между флуконазолом и аминокислотами как элементарные шаги образования белок-ингибиторных комплексов ранее не исследовали.

Целью данной работы было изучение комплексов флуконазола с аминокислотами в газовой фазе с помощью ЭРИ-МС, а также исследование структурных и энергетических параметров комплексов с помощью молекулярной динамики и квантово-химических ab initio расчетов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Флуконазол (Fluc), аланин (Ala), лизин (Lys), треонин (Thr), метиловый спирт (степени очистки для жидкостной хроматографии) были приобретены у Merck (Merck; Германия). Деионизированную воду готовили с помощью установки Milli-Q Reference Water Purification System (Merck; Франция). Исходный раствор каждой аминокислоты и флуконазола готовили в метаноле в концентрации

10 ммоль/мл. Для масс-спектрометрического исследования индивидуальных соединений исходные растворы разбавляли водой до концентрации 1 ммоль/мл. Образцы для исследования комплексов флуконазола с аминокислотами с помощью тандемной масс-спектрометрии готовили путем смешивания исходных растворов флуконазола и одной из аминокислот в объемном отношении 1 : 1. Полученные таким образом растворы разбавляли водой до 1 ммоль/мл каждого компонента и перемешивали в течение 30 с. Образец для сравнения относительных интенсивностей комплексов флуконазола с аминокислотами готовили путем смешивания равных объемов исходных растворов флуконазола, аланина, лизина и треонина. Затем раствор разбавили водой до 1 ммоль/мл каждого компонента и перемешивали в течение 30 с. Все образцы готовили при комнатной температуре.

Экспериментальные исследования проводили на масс-спектрометре MaxisImpact с гибридным квадруполь-времяпролетным анализатором и источником с электро-распылительной ионизацией (BrukerDaltonics; Германия). Масс-спектрометр работал в режиме положительных ионов при следующих условиях: диапазон масс m/z — 50–1000, напряжение на игле — 4,5 кВ, распыляющий газ подавали под давлением 0,6 бар, поток осушающего газа составлял 5,0 л/мин, температура осушающего газа — 200 °С. Эксперименты с тандемной масс-спектрометрией осуществляли с окном изоляции ионов m/z — 3 и вариацией энергии столкновений. Анализ проводили в режиме прямого ввода образца с помощью шприцевого насоса kdScientific (kdScientific; США) с потоком 3 мкл/мин.

Молекулярно-динамическое исследование комплексов Fluc + AA осуществляли с помощью программы NAMD [26]. Силовое поле для моделирования исследуемых комплексов было разработано на основании CHARMM General Force-Field (v3.1) [27, 28]. Типы атомов и частично заряды на атомах флуконазола подбирали по аналогии. Недостающие параметры связей, углов и двугранных углов, а также недостающие заряды на атомах флуконазола были оптимизированы с помощью Force Field Toolkit (ffTK) — плагина программы VMD [26].

Квантово-химические расчеты структуры и энергетических параметров комплексов флуконазола с аминокислотами проводили с использованием программ GAMESS [29]. Полную оптимизацию геометрии комплексов для изучения структурных и энергетических свойств проводили на уровне теории функционала плотности (DFT) с использованием функций B3LYP с базисом 3-21G и 6-311++G** с диффузными и поляризационными орбиталями.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании растворов отдельных аминокислот методом ЭРИ-МС были зарегистрированы пики, соответствующие протонированным аминокислотам, а также их аддуктам с катионом натрия. В ЭРИ-МС экспериментах с растворами, содержащими как аминокислоту, так и флуконазол в воде, выявлены ассоциаты аминокислот с молекулой лекарственного препарата, что свидетельствует о достаточной стабильности таких комплексов в газовой фазе.

На рис. 1 представлен ЭРИ-масс-спектр положительных ионов раствора, содержащего все три аминокислоты и флуконазол в воде в эквимолярных концентрациях. О возможности образования ассоциатов свидетельствуют пики [Fluc + Ala + H]+ (m/z 396), [Fluc + Lys + H]+ (m/z 453) и [Fluc + Thr + H]+ (m/z 426). С учетом интенсивностей соответствующих пиков можно построить следующий ряд (табл. 1): [Fluc + Ala + H]+ < [Fluc + Thr + H]+ < [Fluc + Lys + H]+. Поскольку интенсивность масс-спектрометрического пика пропорциональна количеству соответствующих ионов, достигших детектора, можно предположить, что указанная последовательность справедлива и для энергии взаимодействия в комплексе, однако в интенсивность иона ассоциата, помимо стабильности, вносят вклад его эффективность ионизации, стабильность отдельных компонентов комплекса и др. Для дополнительной экспериментальной оценки стабильности комплексов и энергии взаимодействия были зарегистрированы и проанализированы тандемные масс-спектры, полученные в результате столкновительно-индуцированной диссоциации исследуемых ассоциатов. На рис. 2 представлены масс-спектры фрагментации комплексов [Fluc + Ala + H]+ (рис. 2А), [Fluc + Thr + H]+ (рис. 2Б), и [Fluc + Lys + H]+ (рис. 2С). В масс-спектрах выявлены пики комплексов, а также пики фрагментов комплексов, обусловленные протонированным флуконазолом, в случае фрагментации ассоциатов с аланином и треонином, и протонированным лизином в случае фрагментации его ассоциата с флуконазолом. Таким образом, на этом этапе можно сделать вывод, что фрагментация рассматриваемых комплексов идет по двум направлениям: либо потеря нейтральной аминокислоты, либо нейтрального флуконазола. По всей видимости, это связано с различным сродством данных молекул к протону. Для количественной оценки стабильности исследуемых комплексов проанализировали интенсивности пиков в тандемных масс-спектрах с варьированием энергии столкновений. На рис. 3 представлены зависимости интенсивности иона-предшественника от энергии столкновений. Относительную стабильность ассоциатов флуконазола с различными аминокислотами оценивали путем сравнения энергии, необходимой для снижения интенсивности пика иона-предшественника на 50%. Для рассматриваемых комплексов эти величины составили 23, 25 и 29 эВ в комплексах с аланином, лизином и треонином соответственно (табл. 1).

Таким образом, в масс-спектрах растворов, содержащих флуконазол и аланин, треонин или лизин, были выявлены кластеры [Fluc + AA + H]+. Поскольку удалось экспериментально оценить их стабильность, представляет интерес оценить энергию взаимодействия флуконазола с каждой из рассматриваемых аминокислот, что и составило предмет описываемых далее молекулярно-динамического моделирования и квантово-химических расчетов.

Выбор начальной структуры играет решающую роль для оптимизации геометрии молекулы методами квантовой химии. Поскольку как аминокислоты, так и флуконазол обладают большим числом степеней свободы и конфомационно подвижны, в данной работе выбор начальной структуры для квантово-химических расчетов осуществляли с помощью молекулярной динамики методом симуляции отжига. Выбор того, какая из молекул в комплексе, флуконазол или аминокислота, является акцептором протона, осуществляли на основании тандемных масс-спектров (см. рис. 2). В комплексах [Fluc + Ala + H]+ и [Fluc + Thr + H]+ протонированным был флуконазол, а в комплексе [Fluc + Lys + H]+ протон локализовался на лизине. Полученные в результате симуляции отжига структуры оптимизировали методом B3LYP сначала с базисом 3-21G, а затем с базисом 6-311++G**. Полученные в результате оптимизации структуры комплексов представлены на рис. 4. В комплексах [Fluc + Ala + H]+ и [Fluc + Thr + H]+ оптимизация геометрии привела к смещению протона в сторону флуконазола, а в случае комплекса [Fluc + Lys + H]+ протон локализован на лизине, что согласуется с предположением, высказанным на основании экспериментальных данных. Причиной такого поведения аминокислот по отношению к протону может быть различное сродство к протону у аминокислот и флуконазола, а также значение pI, которое для лизина составляет 9,74, а для аланина и треонина 6 и 5,6 соответственно. На основании выполненного моделирования были рассчитаны энергии образования комплексов по формуле IE = EAB – EA – EB, где EAB — энергия комплекса, EA и EB — энергии компонентов комплекса. В табл. 2 представлены значения энергии, полученные в результате квантово-химических расчетов методами B3LYP/3-21 и B3LYP/6-311++G**. Значения энергии взаимодействия между компонентами комплекса, посчитанные методом B3LYP/6-311++G**, совпадают с последовательностью, выявленной экспериментально, в то время как при расчете методом B3LYP/3-21 значение энергии взаимодействия флуконазола с лизином оказалось выше, чем с треонином. Этот факт может свидетельствовать о важности использования диффузных и поляризационных орбиталей при моделировании нековалентных комплексов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее была показана важность понимания того, какие аминокислоты участвуют в связывании триазиновых соединений и какого рода взаимодействия определяют стабильность комплексов «белок ‒ лекарственный препарат» [11]. В упомянутой работе сравнивали взаимодействие флуконазола с различными CYP51. Энергия взаимодействия в таких комплексах является результатом конкурентных взаимодействий лиганда с остатками аминокислот в составе белка, с гемом и с молекулами воды. Взаимодействие белок–флуконазол оказалось более эффективным в CYP51 митохондрий из-за полярных взаимодействий с остатком аргинина. Однако в ферментах грибов эти взаимодействия замещает взаимодействие лиганда с гемом, которое компенсирует потерю полярной связи и приводит к более энергетически выгодному связыванию. Следовательно, разработка лиганда с повышенной специфичностью к ферментам грибов должна быть сосредоточена на повышении полярности лиганда и усилении его взаимодействия с гемом. В то же время было высказано предположение, что более крупные гидрофобные лиганды лучше подходят для воздействия на микобактериальные и человеческие ферменты [11]. Подобные исследования демонстрируют важность понимания и учета взаимодействия лекарственных препаратов с различными компонентами их мишеней. Данная работа демонстрирует подход, который можно применять на ранних этапах проектирования и разработки новых лекарственных препаратов, позволяя оценить стабильность комплексов лекарственного препарата с аминокислотами как с экспериментальной, так и с теоретической точки зрения.

ВЫВОДЫ

ЭРИ-МС и молекулярная динамика были использованы для изучения взаимодействия флуконазола с аминокислотами, которые, согласно литературным данным, играют решающую роль в связывании белка с ингибитором. Нековалентные комплексы оказались стабильными в газовой фазе, что позволило зарегистрировать соответствующие сигналы в масс-спектрах. С помощью тандемной масс-спектрометрии с варьированием энергии столкновений была исследована относительная стабильность зарегистрированных комплексах и построен ряд стабильности: [Fluc + Ala + H]+ (23 эВ) < [Fluc + Lys + H]+ (25 эВ) < [Fluc + Thr + H]+ (29 эВ). Моделирование средствами молекулярной динамики и квантовой химии позволило определить структуру комплексов и энергию взаимодействия в них, причем значения энергии взаимодействия, полученные методом B3LYP/6-311++G**, образуют ряд стабильности ассоциатов, аналогичный полученному с помощью эксперимента. Такой подход комбинирования экспериментальных масс-спектрометрических исследований и квантово-химического моделирования может быть использован на начальных этапах разработки новых лекарственных препаратов и поиска молекулярных механизмов их действия.