ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Таксономический дисбиоз микробиоты и сывороточные биомаркеры как отражение тяжести поражения центральной нервной системы

Е. А. Черневская, А. Ю. Меглей, И. В. Буякова, Н. Ю. Ковалева, К. М. Горшков, В. Е. Захарченко, Н. В. Белобородова
Информация об авторах

Федеральный научно-клинический центр реаниматологии и реабилитологии, Москва, Россия

Для корреспонденции: Екатерина Александровна Черневская
ул. Петровка, д. 25, с. 2, г. Москва, 127051; ur.rrcknf@ayaksvenrehce

Информация о статье

Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом Федерального научно-клинического центра реаниматологии и реабилитологии (протокол № 2/19/2 от 20 июня 2019 г.). Все пациенты или их законные представители подписали добровольное информированное согласие.

Вклад авторов: Е. А. Черневская, А. Ю. Меглей — оценка таксономического состава микробиоты и уровня биомаркеров, анализ полученных данных, написание текста рукописи; Н. В. Белобородова — дизайн исследования, редактирование рукописи; И. В. Буякова, Н. Ю. Ковалева, К. М. Горшков — отбор и работа с пациентами, сбор клинических данных; В. Е. Захарченко — получение данных для анализа, редактирование рукописи. Все авторы прочли и одобрили рукопись.

Статья получена: 20.08.2020 Статья принята к печати: 03.09.2020 Опубликовано online: 16.09.2020
|

Достижения в области интенсивной терапии за последние десятилетия значительно снизили смертность пациентов при острых критических состояниях, но вместе с тем увеличили долю пациентов, оставшихся длительно зависимыми от методов интенсивной терапии. Это привело к появлению понятия ХКС [1]. Среди критериев ХКС: пребывание в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) не менее двух недель; необходимость проведения интенсивной искусственной вентиляции легких (ИВЛ) более 14–28 дней; стойкое воспаление; иммуносупрессия; синдром гиперметаболизма- гиперкатаболизма; повышенная восприимчивость к инфекциям [24].

Большинство пациентов, перенесших тяжелые органические повреждения головного мозга, отвечают критериям ХКС. Первичная патология утяжеляет неврологическую дисфункцию, которая может быть и самостоятельным элементом ХКС как результат функционально-метаболических нарушений, опосредованных воспалительными и невоспалительными компонентами: чрезмерная активация микроглии; нарушение перфузии головного мозга; нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ); изменение нервной передачи [3]. Такие аномальные процессы определяют по повышенным уровням маркеров воспаления/ повреждения головного мозга [5]. На сегодняшний день не существует универсального биомаркера, способного отразить сложные патофизиологические процессы, характерные для критического состояния, поэтому для мониторинга пациентов в ХКС необходима комплексная оценка биомаркеров. Наиболее востребованы среди них белок S100 и нейронспецифичная энолаза (NSE) [68], свидетельствующие о повреждении нервной ткани, а также неспецифичные маркеры воспаления — интерлейкин-6 (IL6) [9] и С-реактивный белок (СРБ) [10].

Важную роль в развитии ХКС может играть изменение состава микробиоты кишечника пациентов. Интерес к изучению микробиоты при критических состояниях обусловлен возможностью ее влияния на функции ЦНС человека [11, 12]. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) может играть роль в возникновении и прогрессировании органной недостаточности при критических состояниях [13, 14]. Пациенты в ХКС имеют метаболические нарушения, приводящие к развитию белково-энергетической недостаточности [15], коморбидные заболевания ЖКТ, вызванные в том числе питанием через назогастральный зонд [16], что может служить причиной дисбиотических нарушений при ХКС [17]. Число исследований, посвященных изучению микробиоты при критических состояниях, растет с каждым годом, однако особенности микробиоты кишечника при ХКС все еще недостаточно изучены [18].

Существует целый ряд методов для изучения микробиоты человека: от традиционного культивирования микроорганизмов до современных технологий секвенирования ДНК следующего поколения (NGS). Перспективной альтернативой классическим культуральным методам в изучении микробиоты является метод ПЦР-РВ, позволяющий в кратчайшие сроки не только качественно, но и количественно оценить основные группы бактерий микробиоты кишечника [19].

Целью данного исследования было выявить связь изменений таксономического состава микробиоты кишечника, воспалительных и неврологических сывороточных биомаркеров с тяжестью поражения ЦНС у пациентов в ХКС.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В сравнительное проспективное исследование включены пациенты с поражением ЦНС различной этиологии (n = 29), находящиеся в ХКС в одном из ОРИТ Федерального научно- клинического центра реаниматологии и реабилитологии (ФНКЦРР) в период с июня 2019 г. по март 2020 г.

Критерии включения в исследование: пациенты с поражением ЦНС различной этиологии, соответствующие критериям ХКС (пребывание в ОРИТ не менее двух недель и/или необходимость проведения ИВЛ более чем 14–28 дней) в возрасте от 18 до 75 лет включительно, поступающие в ОРИТ ФНКЦРР для интенсивной нейрореабилитации. Критерии исключения: возраст старше 75 лет; химиотерапия/лечение гормональными (стероидными) препаратами; диагностированная нейроинфекция; прием антибактериальных, про-/пре- и метабиотических препаратов на момент поступления в ОРИТ.

Возраст пациентов составил от 20 до 75 лет (медиана 56 (32–63) лет), из них 17 женщин (58,6%) и 12 мужчин (41,4%). По нозологическим формам в исследование включены 15 пациентов, перенесших острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК), семь пациентов после перенесенных тяжелых черепно-мозговых травм (ЧМТ), четыре пациента с осложненным течением послеоперационного периода после нейрохирургических вмешательств, три — с аноксическим поражением головного мозга после успешных реанимационных мероприятий при клинической смерти. На ИВЛ находились 10 пациентов и 19 пациентов (на самостоятельном дыхании через трахеостомическую трубку). Все пациенты находились на энтеральном питании, больше половины из них (n = 15) получали питание через назогастральный зонд или гастростому. В связи с инфекционными осложнениями (уроинфекция, инфекция нижних дыхательных путей) антибактериальную терапию получал 21 пациент (табл. 1). Кроме того, всем пациентам назначали комплексный препарат (метабиотик), содержащий в своем составе активные метаболиты Bacillus subtilis, сорбент и пребиотический компонент.
У пациентов оценивали уровень сознания (вегетативное состояние, сохранное сознание), неврологический статус по шкале комы Глазго (ШКГ) (15 баллов — ясное сознание, 14–13 баллов — оглушение, 12–9 баллов — сопор, 8–6 баллов — кома), назначение антибактериальных препаратов в день отбора биоматериала.

Отбор образцов клинического материала

По одному образцу кишечного содержимого и венозной крови собирали в день поступления (до начала антибактериальной терапии) и затем на каждые седьмые сутки в динамике до момента перевода из ОРИТ (2–7 образцов от одного пациента). Сбор, транспортирование и хранение клинического материала проводили в строгом соответствии с методическими рекомендациями [20]. Взятие кишечного содержимого производили в одноразовый стерильный контейнер. Контейнеры доставляли в лабораторию и хранили до начала исследования при +2–8 °С.
Время от взятия материала до начала исследования не превышало 24 ч. Для выделения ДНК использовали супернатант: 0,1 г кишечного содержимого смешивали с 800 мкл изотонического раствора и перемешивали на вортексе до получения гомогенной суспензии; полученную смесь центрифугировали в течение 30 с при 12 045 g.
Дальнейшее исследование проводили согласно протоколу, представленному в наборе тест-системы Колонофлор-16 («АльфаЛаб»; Россия). Взятие крови производили из венозного катетера в пробирку без антикоагулянта. Образцы сыворотки получали путем центрифугирования венозной крови при 1500 g в течение 10 мин. Сыворотку разливали по 500 мкл в одноразовые пробирки типа эппендорф, замораживали и хранили до начала исследования при –20 °С.

Оценка таксономического состава микробиоты кишечника

Для оценки использовали отечественную тест-систему «Колонофлор-16» («АльфаЛаб»; Россия), которая включает реагенты для выделения ДНК, смесь для ПЦР- амплификации, специфичную для ДНК всех бактерий (общая бактериальная масса), смеси для амплификации, специфичные для каждого выявленного вида (или группы) бактерий. Измерения проводили на амплификаторе планшетного типа CFX 96 (BioRad; США).

Определение биомаркеров сыворотки крови

Образцы сыворотки крови в объеме 200 мкл использовали для определения концентраций: NSE, белка S100, прокальцитонина (PCT), IL6 и кортизола с использованием соответствующих наборов реактивов (Roche Diagnostics; Швейцария). Измерение биомаркеров проводили на  автоматическом электрохемилюминисцентном анализаторе Cobas e411 (Roche; Швейцария).
Определение концентраций альбумина и СРБ проводили на автоматическом биохимическом анализаторе AU 480 (Beckman Coulter; США) с применением оригинальных реагентов.
Данные представлены в виде медианы, 25 и 75%- го квартилей. При сравнении двух групп использовали U-критерий Манна–Уитни; корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Все полученные различия в группах считали статистически значимыми при p ≤ 0,05. Статистический анализ проводили с использованием Statistica 13.0 (Stat Soft Inc.; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 29 пациентов (см. табл. 1).
Особенности течения ХКС, независимо от первичной нозологической формы, позволили объединить разнородных пациентов с тяжелым поражением ЦНС в общую группу исследования. Анализ микробиоты кишечника пациентов в зависимости от проводимой антибактериальной терапии (АБТ) не выявил статистически значимых различий между группами пациентов (табл. 2). Поэтому в дальнейшем при сопоставлении групп пациентов мы ориентировались на неврологическую оценку.
По уровню сознания пациентов разделили на две группы (см. табл. 1) согласно общепринятым критериям [21]: пациенты в вегетативном состоянии или с минимальным сознанием (n = 10); пациенты в сознании, имевшие грубые когнитивные и психические нарушения (n = 19), что является одним из признаков ХКС. Группы были сопоставимы по возрасту (табл. 3).

При исследовании таксономического состава микробиоты кишечника в группах пациентов в ХКС методом ПЦР-РВ обнаружены следующие особенности (рис. 1):
– общая бактериальная масса сопоставима с референсными значениями, рекомендованными производителем;
– в составе микробиоты пациентов присутствуют Clostridium spp., Fusobacterium nucleatum, Parvimonas micra, которых в норме не обнаруживают;
 логарифмы концентраций (lg КОЕ/г) шести видов микроорганизмов (Klebsiella spp., Candida spp., Staphylococcus aureus, Proteus spp., Enterobacter spp./ Citrobacter spp.) значительно превышают референсные значения в 1,5–2 раза;
– уровень Bacteroides thetaiotimicron снижен по сравнению с референсными значениями;
– достоверные различия между группами пациентов по уровню сознания выявлены для F. prausnitzii (p = 0,015).

Значения таких сывороточных биомаркеров, как кортизол, СРБ, альбумин и коэффициент СРБ/альбумин, статистически значимо различались в двух исследуемых группах (см. табл. 3). Уровень РСТ не превышал референсные значения ни у пациентов с сохранным сознанием, ни у пациентов в вегетативном состоянии, но различия между двумя этими группами были достоверными (p = 0,009) (см. табл. 3).

При оценке степени нарушения сознания по ШКГ образцы пациентов были разделены на три группы, в соответствии с балльной оценкой: 15 баллов — ясное сознание (n = 37), 14–13 баллов — оглушение (n = 33), 12–6 баллов — сопор/кома (n = 40). Выявлены статистически значимые различия в уровнях коэффициента СРБ/альбумин (см. рис. 2), кортизола и IL6 (рис. 3).

Для выявления связи в системе «кишечник–мозг» провели корреляционный анализ уровней сывороточных биомаркеров и представителей микробиоты кишечника. В группе пациентов в вегетативном состоянии выявили статистически значимые обратные корреляции кортизола с F. prausnitzii (r = –0,62) и с B. thetaiotaomicron (r = –0,57). В группе пациентов с сохранным сознанием обнаружены прямые корреляции коэффициента СРБ/альбумин с S. aureus (r = 0,72), B. fragilis group/F. prausnitzii с S100 (r = 0,45).

С помощью корреляционного анализа была выявлена сильная обратная связь уровня Enterococcus spp. со значениями ШКГ (r = –0,77; р ≤ 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты данного исследования подтвердили, что состав микробиоты кишечника у пациентов в ХКС существенно отличается от референсных значений независимо от неврологического статуса. Дисбиотические нарушения у пациентов в ХКС выражены повышенными уровнями представителей типа Proteobacteria, грибов рода Candida spp., условно-патогенных видов Firmicutes и Bacteroides, а также сокращением численности комменсальной микробиоты (см. рис. 1), являющейся продуцентом низкомолекулярных метаболитов (F. prausnitzii), что соотносится с результатами работ, проведенных с использованием технологий секвенирования микробиоты кишечника по 16S РНК у пациентов, находящихся в ОРИТ [22], а также у пациентов с повреждением головного мозга в критическом состоянии [23]. Так, у перенесших инсульт пациентов выраженный дисбиоз с преобладанием продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, включая Odoribacter и Akkermansia, коррелировал с исходом заболевания [24]. Однако в указанном исследовании оценивали состав микробиоты в первые 48 ч после инсульта, и нами не найдено источников, в которых детально описан состав микробиоты при хронизации процесса, что подчеркивает новизну полученных результатов.

Анализ биомаркеров показал статистически значимые различия в уровнях кортизола, СРБ, альбумина и значении коэффициента СРБ/альбумин в группе пациентов с сохранным сознанием по сравнению с группой в вегетативном состоянии (см. табл. 3). Обнаружены статистически значимые корреляции биомаркеров с уровнем некоторых представителей микробиоты кишечника, что подтверждает концепцию о наличии связи состава и численности микробиоты кишечника с поражением ЦНС. Выявленные обратные корреляции уровня кортизола с уровнем F. prausnitzii и В. thetaiotaomicron у пациентов в вегетативном состоянии согласуются с данными более ранних исследований, в которых обнаружено, что сокращение численности указанных таксонов приводит к уменьшению нейропротективных функций микробиоты и, как следствие, повреждению нервной ткани [25], смещению иммуннореактивности в сторону развития воспаления и аутоиммунных процессов [26]. Повышение уровня кортизола, в свою очередь, отрицательно сказывается на метаболических процессах в организме пациентов в критическом состоянии, смещая равновесие в сторону катаболизма и способствуя развитию синдрома гиперметаболизма-гиперкатаболизма [27, 28].

В проведенном нами исследовании уровни кортизола, СРБ и значение коэффициента СРБ/альбумин у пациентов в вегетативном состоянии были практически вдвое выше, а уровень альбумина — ниже, что свидетельствует о более выраженных воспалительных и катаболических явлениях у этой группы больных. Несмотря на статистически значимые различия, уровень РСТ не превышал референсных значений в обеих группах, что может свидетельствовать об асептическом воспалении, не связанном с системной бактериальной инфекцией (см. табл. 3).

Коэффициент СРБ/альбумин широко изучают в последнее время как комбинацию маркеров, отражающих системное воспаление и нутритивный статус, и как независимый прогностический маркер у пациентов с инфекцией, злокачественными новообразованиями, в том числе и у пациентов ОРИТ [10, 29, 30]. Нами показано, что у пациентов в ХКС коэффициент СРБ/альбумин отражает степень нарушения сознания по ШКГ (см. рис. 2) и коррелирует с уровнем условно-патогенного представителя микробиоты S. aureus. Биомаркеры S100 и NSE принято рассматривать как маркеры острого повреждения нервной ткани [31]. У пациентов в ХКС их уровни изменялись незначительно, не выходя за пределы референсного интервала, что может отражать хронический характер повреждения ткани головного мозга. Обнаруженная прямая корреляция S100 с отношением Bacteroides fragilis к Faecalibacterium prausnitzii как потенциального биомаркера дисбиоза кишечника провоспалительного типа и сильная обратная корреляция ШКГ с уровнем Enterococcus spp. подтверждают связь дисбиотических нарушений с дисфункцией головного мозга. Однако связь между изученными таксонами микробиоты кишечника, неврологическими маркерами и степенью неврологического дефицита до конца не ясна и требует углубленного изучения. В опубликованной литературе нам не встретились данные о корреляционной связи между изучаемыми таксонами микробиоты и сывороточными биомаркерами при ХКС.

Таким образом, у пациентов с дисфункцией мозга в ХКС микробиота кишечника подвергается изменениям, позволяющим считать ее «поврежденным органом». Небольшое число наблюдений не позволило оценить вклад антибактериальных препаратов в развитие нарушений таксономического состава микробиоты кишечника ввиду выраженных различий индивидуальных схем АБТ у обследованных пациентов. Однако комплексный подход с применением современных технологий может способствовать оптимизации АБТ, что является задачей дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов в ХКС выявлены выраженные нарушения таксономического состава микробиоты кишечника независимо от тяжести поражения ЦНС.
2. Обнаруженные статистически значимые корреляции биомаркеров с ШКГ и некоторыми представителями микробиоты свидетельствуют в пользу концепции о связи между численностью и составом микробиоты кишечника и поражением ЦНС.
3. Применение комплексной ПЦР-диагностики позволяет проводить динамическую оценку таксономического состава микробиоты кишечника в кратчайшие сроки.
4. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения важной роли микробиоты кишечника в патогенезе неврологического дефицита. Целенаправленная коррекция микробиоты может повысить эффективность нейрореабилитации даже у пациентов с тяжелыми повреждениями головного мозга.

КОММЕНТАРИИ (0)