Достижения в области интенсивной терапии за последние десятилетия значительно снизили смертность пациентов при острых критических состояниях, но вместе с тем увеличили долю пациентов, оставшихся длительно зависимыми от методов интенсивной терапии. Это привело к появлению понятия ХКС [1]. Среди критериев ХКС: пребывание в отделении реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) не менее двух недель; необходимость проведения интенсивной искусственной вентиляции легких (ИВЛ) более 14–28 дней; стойкое воспаление; иммуносупрессия; синдром гиперметаболизма- гиперкатаболизма; повышенная восприимчивость к инфекциям [2–4].

Большинство пациентов, перенесших тяжелые органические повреждения головного мозга, отвечают критериям ХКС. Первичная патология утяжеляет неврологическую дисфункцию, которая может быть и самостоятельным элементом ХКС как результат функционально-метаболических нарушений, опосредованных воспалительными и невоспалительными компонентами: чрезмерная активация микроглии; нарушение перфузии головного мозга; нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ); изменение нервной передачи [3]. Такие аномальные процессы определяют по повышенным уровням маркеров воспаления/ повреждения головного мозга [5]. На сегодняшний день не существует универсального биомаркера, способного отразить сложные патофизиологические процессы, характерные для критического состояния, поэтому для мониторинга пациентов в ХКС необходима комплексная оценка биомаркеров. Наиболее востребованы среди них белок S100 и нейронспецифичная энолаза (NSE) [6–8], свидетельствующие о повреждении нервной ткани, а также неспецифичные маркеры воспаления — интерлейкин-6 (IL6) [9] и С-реактивный белок (СРБ) [10].

Важную роль в развитии ХКС может играть изменение состава микробиоты кишечника пациентов. Интерес к изучению микробиоты при критических состояниях обусловлен возможностью ее влияния на функции ЦНС человека [11, 12]. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) может играть роль в возникновении и прогрессировании органной недостаточности при критических состояниях [13, 14]. Пациенты в ХКС имеют метаболические нарушения, приводящие к развитию белково-энергетической недостаточности [15], коморбидные заболевания ЖКТ, вызванные в том числе питанием через назогастральный зонд [16], что может служить причиной дисбиотических нарушений при ХКС [17]. Число исследований, посвященных изучению микробиоты при критических состояниях, растет с каждым годом, однако особенности микробиоты кишечника при ХКС все еще недостаточно изучены [18].

Существует целый ряд методов для изучения микробиоты человека: от традиционного культивирования микроорганизмов до современных технологий секвенирования ДНК следующего поколения (NGS). Перспективной альтернативой классическим культуральным методам в изучении микробиоты является метод ПЦР-РВ, позволяющий в кратчайшие сроки не только качественно, но и количественно оценить основные группы бактерий микробиоты кишечника [19].

Целью данного исследования было выявить связь изменений таксономического состава микробиоты кишечника, воспалительных и неврологических сывороточных биомаркеров с тяжестью поражения ЦНС у пациентов в ХКС.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В сравнительное проспективное исследование включены пациенты с поражением ЦНС различной этиологии (n = 29), находящиеся в ХКС в одном из ОРИТ Федерального научно- клинического центра реаниматологии и реабилитологии (ФНКЦРР) в период с июня 2019 г. по март 2020 г.

Критерии включения в исследование: пациенты с поражением ЦНС различной этиологии, соответствующие критериям ХКС (пребывание в ОРИТ не менее двух недель и/или необходимость проведения ИВЛ более чем 14–28 дней) в возрасте от 18 до 75 лет включительно, поступающие в ОРИТ ФНКЦРР для интенсивной нейрореабилитации. Критерии исключения: возраст старше 75 лет; химиотерапия/лечение гормональными (стероидными) препаратами; диагностированная нейроинфекция; прием антибактериальных, про-/пре- и метабиотических препаратов на момент поступления в ОРИТ.

Возраст пациентов составил от 20 до 75 лет (медиана 56 (32–63) лет), из них 17 женщин (58,6%) и 12 мужчин (41,4%). По нозологическим формам в исследование включены 15 пациентов, перенесших острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК), семь пациентов после перенесенных тяжелых черепно-мозговых травм (ЧМТ), четыре пациента с осложненным течением послеоперационного периода после нейрохирургических вмешательств, три — с аноксическим поражением головного мозга после успешных реанимационных мероприятий при клинической смерти. На ИВЛ находились 10 пациентов и 19 пациентов (на самостоятельном дыхании через трахеостомическую трубку). Все пациенты находились на энтеральном питании, больше половины из них (n = 15) получали питание через назогастральный зонд или гастростому. В связи с инфекционными осложнениями (уроинфекция, инфекция нижних дыхательных путей) антибактериальную терапию получал 21 пациент (табл. 1). Кроме того, всем пациентам назначали комплексный препарат (метабиотик), содержащий в своем составе активные метаболиты Bacillus subtilis, сорбент и пребиотический компонент.
У пациентов оценивали уровень сознания (вегетативное состояние, сохранное сознание), неврологический статус по шкале комы Глазго (ШКГ) (15 баллов — ясное сознание, 14–13 баллов — оглушение, 12–9 баллов — сопор, 8–6 баллов — кома), назначение антибактериальных препаратов в день отбора биоматериала.

Отбор образцов клинического материала

По одному образцу кишечного содержимого и венозной крови собирали в день поступления (до начала антибактериальной терапии) и затем на каждые седьмые сутки в динамике до момента перевода из ОРИТ (2–7 образцов от одного пациента). Сбор, транспортирование и хранение клинического материала проводили в строгом соответствии с методическими рекомендациями [20]. Взятие кишечного содержимого производили в одноразовый стерильный контейнер. Контейнеры доставляли в лабораторию и хранили до начала исследования при +2–8 °С.
Время от взятия материала до начала исследования не превышало 24 ч. Для выделения ДНК использовали супернатант: 0,1 г кишечного содержимого смешивали с 800 мкл изотонического раствора и перемешивали на вортексе до получения гомогенной суспензии; полученную смесь центрифугировали в течение 30 с при 12 045 g.
Дальнейшее исследование проводили согласно протоколу, представленному в наборе тест-системы Колонофлор-16 («АльфаЛаб»; Россия). Взятие крови производили из венозного катетера в пробирку без антикоагулянта. Образцы сыворотки получали путем центрифугирования венозной крови при 1500 g в течение 10 мин. Сыворотку разливали по 500 мкл в одноразовые пробирки типа эппендорф, замораживали и хранили до начала исследования при –20 °С.

Оценка таксономического состава микробиоты кишечника

Для оценки использовали отечественную тест-систему «Колонофлор-16» («АльфаЛаб»; Россия), которая включает реагенты для выделения ДНК, смесь для ПЦР- амплификации, специфичную для ДНК всех бактерий (общая бактериальная масса), смеси для амплификации, специфичные для каждого выявленного вида (или группы) бактерий. Измерения проводили на амплификаторе планшетного типа CFX 96 (BioRad; США).

Определение биомаркеров сыворотки крови

Образцы сыворотки крови в объеме 200 мкл использовали для определения концентраций: NSE, белка S100, прокальцитонина (PCT), IL6 и кортизола с использованием соответствующих наборов реактивов (Roche Diagnostics; Швейцария). Измерение биомаркеров проводили на  автоматическом электрохемилюминисцентном анализаторе Cobas e411 (Roche; Швейцария).
Определение концентраций альбумина и СРБ проводили на автоматическом биохимическом анализаторе AU 480 (Beckman Coulter; США) с применением оригинальных реагентов.
Данные представлены в виде медианы, 25 и 75%- го квартилей. При сравнении двух групп использовали U-критерий Манна–Уитни; корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Все полученные различия в группах считали статистически значимыми при p ≤ 0,05. Статистический анализ проводили с использованием Statistica 13.0 (Stat Soft Inc.; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 29 пациентов (см. табл. 1).
Особенности течения ХКС, независимо от первичной нозологической формы, позволили объединить разнородных пациентов с тяжелым поражением ЦНС в общую группу исследования. Анализ микробиоты кишечника пациентов в зависимости от проводимой антибактериальной терапии (АБТ) не выявил статистически значимых различий между группами пациентов (табл. 2). Поэтому в дальнейшем при сопоставлении групп пациентов мы ориентировались на неврологическую оценку.
По уровню сознания пациентов разделили на две группы (см. табл. 1) согласно общепринятым критериям [21]: пациенты в вегетативном состоянии или с минимальным сознанием (n = 10); пациенты в сознании, имевшие грубые когнитивные и психические нарушения (n = 19), что является одним из признаков ХКС. Группы были сопоставимы по возрасту (табл. 3).

При исследовании таксономического состава микробиоты кишечника в группах пациентов в ХКС методом ПЦР-РВ обнаружены следующие особенности (рис. 1):
– общая бактериальная масса сопоставима с референсными значениями, рекомендованными производителем;
– в составе микробиоты пациентов присутствуют Clostridium spp., Fusobacterium nucleatum, Parvimonas micra, которых в норме не обнаруживают;
 логарифмы концентраций (lg КОЕ/г) шести видов микроорганизмов (Klebsiella spp., Candida spp., Staphylococcus aureus, Proteus spp., Enterobacter spp./ Citrobacter spp.) значительно превышают референсные значения в 1,5–2 раза;
– уровень Bacteroides thetaiotimicron снижен по сравнению с референсными значениями;
– достоверные различия между группами пациентов по уровню сознания выявлены для F. prausnitzii (p = 0,015).

Значения таких сывороточных биомаркеров, как кортизол, СРБ, альбумин и коэффициент СРБ/альбумин, статистически значимо различались в двух исследуемых группах (см. табл. 3). Уровень РСТ не превышал референсные значения ни у пациентов с сохранным сознанием, ни у пациентов в вегетативном состоянии, но различия между двумя этими группами были достоверными (p = 0,009) (см. табл. 3).

При оценке степени нарушения сознания по ШКГ образцы пациентов были разделены на три группы, в соответствии с балльной оценкой: 15 баллов — ясное сознание (n = 37), 14–13 баллов — оглушение (n = 33), 12–6 баллов — сопор/кома (n = 40). Выявлены статистически значимые различия в уровнях коэффициента СРБ/альбумин (см. рис. 2), кортизола и IL6 (рис. 3).

Для выявления связи в системе «кишечник–мозг» провели корреляционный анализ уровней сывороточных биомаркеров и представителей микробиоты кишечника. В группе пациентов в вегетативном состоянии выявили статистически значимые обратные корреляции кортизола с F. prausnitzii (r = –0,62) и с B. thetaiotaomicron (r = –0,57). В группе пациентов с сохранным сознанием обнаружены прямые корреляции коэффициента СРБ/альбумин с S. aureus (r = 0,72), B. fragilis group/F. prausnitzii с S100 (r = 0,45).

С помощью корреляционного анализа была выявлена сильная обратная связь уровня Enterococcus spp. со значениями ШКГ (r = –0,77; р ≤ 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты данного исследования подтвердили, что состав микробиоты кишечника у пациентов в ХКС существенно отличается от референсных значений независимо от неврологического статуса. Дисбиотические нарушения у пациентов в ХКС выражены повышенными уровнями представителей типа Proteobacteria, грибов рода Candida spp., условно-патогенных видов Firmicutes и Bacteroides, а также сокращением численности комменсальной микробиоты (см. рис. 1), являющейся продуцентом низкомолекулярных метаболитов (F. prausnitzii), что соотносится с результатами работ, проведенных с использованием технологий секвенирования микробиоты кишечника по 16S РНК у пациентов, находящихся в ОРИТ [22], а также у пациентов с повреждением головного мозга в критическом состоянии [23]. Так, у перенесших инсульт пациентов выраженный дисбиоз с преобладанием продуцентов короткоцепочечных жирных кислот, включая Odoribacter и Akkermansia, коррелировал с исходом заболевания [24]. Однако в указанном исследовании оценивали состав микробиоты в первые 48 ч после инсульта, и нами не найдено источников, в которых детально описан состав микробиоты при хронизации процесса, что подчеркивает новизну полученных результатов.

Анализ биомаркеров показал статистически значимые различия в уровнях кортизола, СРБ, альбумина и значении коэффициента СРБ/альбумин в группе пациентов с сохранным сознанием по сравнению с группой в вегетативном состоянии (см. табл. 3). Обнаружены статистически значимые корреляции биомаркеров с уровнем некоторых представителей микробиоты кишечника, что подтверждает концепцию о наличии связи состава и численности микробиоты кишечника с поражением ЦНС. Выявленные обратные корреляции уровня кортизола с уровнем F. prausnitzii и В. thetaiotaomicron у пациентов в вегетативном состоянии согласуются с данными более ранних исследований, в которых обнаружено, что сокращение численности указанных таксонов приводит к уменьшению нейропротективных функций микробиоты и, как следствие, повреждению нервной ткани [25], смещению иммуннореактивности в сторону развития воспаления и аутоиммунных процессов [26]. Повышение уровня кортизола, в свою очередь, отрицательно сказывается на метаболических процессах в организме пациентов в критическом состоянии, смещая равновесие в сторону катаболизма и способствуя развитию синдрома гиперметаболизма-гиперкатаболизма [27, 28].

В проведенном нами исследовании уровни кортизола, СРБ и значение коэффициента СРБ/альбумин у пациентов в вегетативном состоянии были практически вдвое выше, а уровень альбумина — ниже, что свидетельствует о более выраженных воспалительных и катаболических явлениях у этой группы больных. Несмотря на статистически значимые различия, уровень РСТ не превышал референсных значений в обеих группах, что может свидетельствовать об асептическом воспалении, не связанном с системной бактериальной инфекцией (см. табл. 3).

Коэффициент СРБ/альбумин широко изучают в последнее время как комбинацию маркеров, отражающих системное воспаление и нутритивный статус, и как независимый прогностический маркер у пациентов с инфекцией, злокачественными новообразованиями, в том числе и у пациентов ОРИТ [10, 29, 30]. Нами показано, что у пациентов в ХКС коэффициент СРБ/альбумин отражает степень нарушения сознания по ШКГ (см. рис. 2) и коррелирует с уровнем условно-патогенного представителя микробиоты S. aureus. Биомаркеры S100 и NSE принято рассматривать как маркеры острого повреждения нервной ткани [31]. У пациентов в ХКС их уровни изменялись незначительно, не выходя за пределы референсного интервала, что может отражать хронический характер повреждения ткани головного мозга. Обнаруженная прямая корреляция S100 с отношением Bacteroides fragilis к Faecalibacterium prausnitzii как потенциального биомаркера дисбиоза кишечника провоспалительного типа и сильная обратная корреляция ШКГ с уровнем Enterococcus spp. подтверждают связь дисбиотических нарушений с дисфункцией головного мозга. Однако связь между изученными таксонами микробиоты кишечника, неврологическими маркерами и степенью неврологического дефицита до конца не ясна и требует углубленного изучения. В опубликованной литературе нам не встретились данные о корреляционной связи между изучаемыми таксонами микробиоты и сывороточными биомаркерами при ХКС.

Таким образом, у пациентов с дисфункцией мозга в ХКС микробиота кишечника подвергается изменениям, позволяющим считать ее «поврежденным органом». Небольшое число наблюдений не позволило оценить вклад антибактериальных препаратов в развитие нарушений таксономического состава микробиоты кишечника ввиду выраженных различий индивидуальных схем АБТ у обследованных пациентов. Однако комплексный подход с применением современных технологий может способствовать оптимизации АБТ, что является задачей дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов в ХКС выявлены выраженные нарушения таксономического состава микробиоты кишечника независимо от тяжести поражения ЦНС.
2. Обнаруженные статистически значимые корреляции биомаркеров с ШКГ и некоторыми представителями микробиоты свидетельствуют в пользу концепции о связи между численностью и составом микробиоты кишечника и поражением ЦНС.
3. Применение комплексной ПЦР-диагностики позволяет проводить динамическую оценку таксономического состава микробиоты кишечника в кратчайшие сроки.
4. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения важной роли микробиоты кишечника в патогенезе неврологического дефицита. Целенаправленная коррекция микробиоты может повысить эффективность нейрореабилитации даже у пациентов с тяжелыми повреждениями головного мозга.